Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

El objetivo general del siguiente experimento es permitir mediciones repetidas de la conductividad hidráulica o la permeabilidad al agua de las paredes de los microvasos ulares en el mesentario de ratas en condiciones experimentales controladas. Esto se logra mediante la canulación de microvasos ulares para permitir que se establezcan las presiones oncóticas e hidrostáticas en el lumen y para permitir que la composición química de los ocho profusos y los ocho suses se controle con precisión. A continuación, se ocluye el vaso y se observan los glóbulos rojos suspendidos en el PERFUSE eight, que actúan como marcadores de flujo moviéndose en el lumen como indicadores del intercambio de líquido transvascular.

A continuación, se registran la posición y la velocidad de los glóbulos rojos marcadores, ya sea hacia el sitio de oclusión o lejos del sitio de oclusión. Finalmente, se libera la oclusión y se repite para mediciones adicionales o se recciona el vaso. Canulado y las mediciones se repiten en condiciones modificadas.

En última instancia, se pueden realizar mediciones emparejadas de la conductividad hidráulica en condiciones de control y prueba para permitir la investigación más directa de los factores que regulan los microrecipientes. Permeabilidad. Una ventaja de la técnica de Landis modificada para investigar la regulación de la permeabilidad capilar es la etapa de perfusión. La microperfusión permite medir la permeabilidad de la pared de los microvasos en condiciones en las que la composición de los ocho PERFUSE, el área de superficie de intercambio y la presión de los microvasos se controlan directamente.

Este método puede abordar cuestiones relativas a los mecanismos celulares y moleculares de la regulación de la permeabilidad en microvasos que son representativos de órganos intactos, y puede proporcionar una comparación con los resultados de monocapas endoteliales cultivadas, que a menudo se utilizan para investigar los detalles de los mecanismos moleculares. Joyce Clark, nuestra directora de laboratorio, demuestra nuestro protocolo. Joyce ha sido responsable de muchas de las mejoras en este protocolo durante su tiempo aquí como nuestra gerente de laboratorio.

Para comenzar, use un extractor electrónico para formar varios tubos capilares de vidrio de silicato de boro limpios en mitades cónicas, cada una con una longitud de punta de aproximadamente un centímetro utilizando una muela abrasiva accionada por aire y un papel abrasivo de 0,5 micras bañado en agua y un soporte de micropipeta colocado en un ángulo de 30 grados con respecto al bisel horizontal, las micro pipetas. Después de lavar y secar las micropipetas de acuerdo con el protocolo de texto, seleccione micropipetas con una abertura de aproximadamente 50 micras de largo y una relación entre la longitud del bisel y el ancho entre 3,1 y 3,5. También deben tener una punta afilada, que ayuda a penetrar las fibras de colágeno duras del mesenterio.

Para hacer restricción, sostenga brevemente un capilar de vidrio tirado no biselado cerca de una micro llama para formar un extremo romo. Repita para hacer varios sujetadores y guárdelos en una caja libre de polvo. A continuación, haga microocluidas sosteniendo un tubo capilar tirado no biselado en ángulo bajo una micro llama y utilice un adaptador de tubo o una micropipeta rota para doblar suavemente el tubo a unos cuatro milímetros de la punta en un ángulo cercano a los 120 grados.

Con respecto al eje, es importante que la punta no esté sellada en la llama ni rota. Después de anestesiar a una rata y organizar el tejido mesentario y el intestino de acuerdo con el protocolo de texto, coloque la bandeja del animal en la platina del microscopio para que el mesentario sea visible a través de las piezas oculares. Coloque una línea de goteo alimentada por gravedad de solución de timbre de mamíferos para superfusionar continuamente.

A continuación, utilizan almohadillas de gasa para mantener el intestino en su lugar, ayudar a retener la humedad y absorber el exceso de timbres de la superficie, ajustar el flujo y aspirar el efluente para mantener una capa constante de suse, identificar los microvasos flar objetivo, que son segmentos no ramificados aguas abajo del flujo convergente y una o dos ramas distales a los capilares verdaderos. Busque un vaso no ramificado que tenga un flujo sanguíneo rápido y libre de glóbulos blancos que se adhieran a la pared del vaso. Poseer. Coloque los microrecipientes de prueba en el centro del campo del microscopio y mueva el retenedor a su posición cerca del sitio de canulación elegido.

Para llenar la micropipeta, extraiga la perfusión de ocho y lave los eritrocitos en una jeringa preparada de acuerdo con el protocolo de texto, asegúrese de que no haya burbujas en el tubo. Avance el tubo en el extremo grande de la micropipeta hasta que coincida con la región cónica. Aplique una pulsación suave y rápida en el émbolo de la jeringa para llenar la punta de la micropipeta.

Aparecerá un pequeño arroyo o gota en la punta cuando esté lleno. Mientras retira el tubo, empuje suavemente el émbolo para llenar el eje de la micropipeta. A continuación, elimine las pequeñas burbujas del eje agitándolo suavemente.

A continuación, coloque la micropipeta en un soporte de pipeta con un puerto lateral que permite una conexión continua del fluido a un manómetro de agua. Asegúrese de que el soporte, que está conectado a un accionamiento hidráulico y a un micromanipulador, esté colocado en un ligero ángulo horizontal para que el borde del cono de la micropipeta no golpee la tripa o la bandeja. Con una jeringa o una pera de goma llena de agua, ajuste la presión hidrostática que se aplica al fluido en la micropipeta cambiando la altura del fluido en la columna de agua del manómetro a unos 40 centímetros de agua por encima del mesenterio.

Antes de colocar la micropipeta llena bajo el microscopio, presione suavemente el retenedor sobre el tejido cerca de los microvasos, aplicando suficiente fuerza para agarrar el tejido, retire ligeramente el retenedor, estirando el tejido en línea con los microvasos para que las tensiones en las fibras de colágeno mesentérico estén alineadas con el vaso. Alinee la micropipeta con el recipiente y bájela a la vista a través de los oculares. Coloque la punta justo aguas arriba del sitio de canulación elegido y bájela sobre el tejido para que obstruya parcialmente el flujo dentro del vaso, pero no lo ocluya.

Con el accionamiento hidráulico, canula el recipiente introduciendo lentamente la punta de la pipeta en el lumen del recipiente, teniendo cuidado de no empujar la punta a través del otro lado del recipiente. A medida que la micropipeta entra en el lumen, la perfusión de ocho lavará rápidamente la sangre del lumen del vaso y entrará en la circulación. Disminuya la presión de perfusión ajustando el manómetro hasta que los glóbulos rojos oscilen suavemente en la luz del vaso.

Esto determina la presión de equilibrio, que mide la presión hidrostática de los microvasos o PC en el extremo distal del segmento de los microvasos. Mantener la perfusión del vaso por encima de esta presión de equilibrio para llevar a cabo la microoclusión. Coloque el bloqueador sobre el recipiente perfundido cerca del borde inferior del campo del microscopio utilizando video y audio.

Registre verbalmente la ubicación del sitio del bloque como se ve en la pieza I roja. El sitio del bloqueo es 57 con la punta del bloqueador colocada justo encima del microvaso. Utilice el control Z fino del micromanipulador para bajar suavemente el bloqueador hasta que se ocluya el flujo en el recipiente.

Utilice el audio para anotar la presión del manómetro. La presión es de 50. A continuación, aplique la oclusión durante tres a 10 segundos y suelte.

Para restaurar la perfusión libre, mueva el sitio del bloque hacia el recipiente hacia la punta de la pipeta en pasos de cinco a 10 micras, realizando no más de tres a cinco oclusiones en cada ubicación para evitar daños en la pared del vaso en el sitio del bloqueo. Analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto. Este curso de tiempo mide los cambios en la conductividad hidráulica o LP.In micro vasos de rata canulados con éxito con cuatro ochos perfusos.

La magnitud de LP a presión constante se utilizó para medir los cambios en los microvasos. Permeabilidad de la pared cuando se perfunde con 1%BSA como control frente a 10 molares del agente inflamatorio Brady Kinin o bk. Como se muestra aquí, BK causó un aumento transitorio en LP que volvió a los niveles de control dentro de los 10 a 15 minutos.

Después de restablecer los niveles basales con 1%BSA 10 nanomolar. El BK se reperfundió junto con una escena de pH micromolar, un fosfato o S one P. Los resultados indican que el S un P atenuó significativamente la respuesta a bk. Para algunos diseños experimentales, es importante estimar tanto el coeficiente de reflexión solut para una macromolécula como el lp.

Esto se logra mejor midiendo JV a múltiples presiones en cada micro recipiente individual. Este experimento estimó tanto la LP como la presión oncótica efectiva de la albúmina al 5% en el PERFUSE 8 cuando no había albúmina en el tejido que rodea los microvasos. Se midió JV sobre S a tres presiones diferentes y se trazó. Aquí.

El LP es la pendiente de la relación entre JV sobre S y la presión, y la intersección en el eje de presión es la diferencia de presión oncótica efectiva a través de la pared del recipiente. Cuando se combina con otras técnicas como el marcaje inmunofluorescente y la microscopía confocal, o incluso la microscopía electrónica de transmisión, la microprofusión proporciona un potente análisis del endotelio microvascular y su función utilizando vasos de permeabilidad conocida. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar mediciones repetidas de la conductividad hidráulica o la permeabilidad al agua de los microrecipientes ulares en el mesentry de ratas en condiciones experimentales controladas.

Se puede utilizar este enfoque en los modelos de ratas actualmente disponibles, pero estoy particularmente interesado en la posibilidad de que se pueda utilizar en nuevas ratas modificadas genéticamente que estarán disponibles con la tecnología CRISPR Cas nine, y espero que se extienda de esta manera.