Name: Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprende la técnica de microperfusión modificada de Landis para medir la conductividad hidráulica en microvasos del mesenterio de rata. Este método permite evaluar la permeabilidad vascular bajo condiciones controladas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta obra fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL44485 y HL28607.

Declaración de Ética: Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional. 1. Fabricación preliminar de Micropipetas, inmovilización y bloqueadores <ol><li> Tire varios tubos capilares de vidrio de borosilicato limpias en un medio con un extractor electrónica ajustado de manera que, cuando se tira, la porción estirada del tubo es de aproximadamente 1 cm de longitud y las dos mitades son algo simétrica. Asegúrese de que el cono es consistente con las dimensiones de la figura 1. Utilice las dos mitades para micropipetas, inmovilización y bloqueadores. <ol><li> Bisel las micropipetas utilizando una muela de aire impulsado 30 con 0,5 micras papel abrasivo bañado con agua. Ajuste el ángulo del soporte de micropipeta de modo que es de aproximadamente 30 grados desde la horizontal. </li><li> Lave y seque las micropipetas mediante succión para extraer la acetona limpia a través de la punta y el eje. Inspeccione las micropipetas (Figura 1A), utilizando un pequeño microscopio vertical con 4 × 40 × y objetivos equipados con un soporte micropipeta pinza y una retícula ocular. </li><li> Seleccione micropipetas con abertura de la punta de aproximadamente 50 micras de largo con un bisel cuya longitud / anchura relación es de entre 3.1 y 3.5 y con un punto fuertemente cónica que ayuda a penetrar en las fibras de colágeno difíciles en el mesenterio. </li><li> Guarde 15-20 micropipetas de ligeramente diferentes tamaños en una caja libre de polvo. </li></ol></li><li> Hacer inmovilización utilizando tubos capilares tirados preparados en el paso 1.1). Mantenga un tubo capilar de vidrio tirado brevemente cerca de una microllama para formar un extremo romo (Figura 1B). Guarde varios en una caja libre de polvo. </li><li> Hacer microoccluders utilizando tubos capilares tirados preparados en el paso 1.1). Mantenga un tubo capilar tirado bajo un microllama y suavemente doblar (usando un adaptador de la tubería, por ejemplo., 23G) la punta fina (unos 4 mm desde la punta) para hacer un ángulo de cerca de 120 grados en el eje ( <strong&gt; Figura 1C). Marca y almacenar varios. </li></ol> 2. Preparación y Cirugía Animal <ol><li> Anestesiar macho (350 a 450 g) o ratas hembra Sprague-Dawley (de 200-300 g) con pentobarbital sódico (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) a través de inyección subcutánea; proteger el mesenterio al no utilizar la inyección intraperitoneal. </li><li> A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y los protocolos experimentales, mantener la anestesia mediante inyecciones suplementarias (30 mg / kg) según sea necesario. Determinar profundidad de la anestesia por pellizco dedo del pie o del reflejo corneal. Después de la terminación del procedimiento experimental, la eutanasia a la rata a través de sobredosis de pentobarbital o inyección intracardiaca de cloruro de potasio saturado bajo anestesia. </li></ol> 3. Preparar Soluciones y eritrocitos para su uso como marcadores de flujo <ol><li> Prepare la solución de los mamíferos de Ringer para superperfundido y la solución de perfusión de control (típicamente ácido mamíferos solución de Ringer que contiene 10 mg / ml grasoalbúmina libre de suero bovino, BSA). <ol><li> Perfundido Filtrar por 0,2 micras filtros de jeringa para eliminar las partículas diminutas que podrían bloquear la punta de la micropipeta; filtrarse en pequeño recipiente limpio. </li></ol></li><li> Preparar los eritrocitos mediante la elaboración de aproximadamente 0,2 ml de sangre de la vena de la cola de la rata anestesiada en una aguja 20G en una pequeña jeringa que contiene 0,05 ml de heparina (1.000 U / ml) y transferir a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene aproximadamente 14 ml solución de mamífero solución de Ringer . <ol><li> Centrífuga para empacar suavemente las células rojas (sobre un máximo de 200 × g durante 7 min). Dibuja el sobrenadante y volver a suspender las células rojas en la solución de Ringer. </li><li> Después de la centrifugación y eliminación del sobrenadante tres veces salen de los glóbulos rojos concentrados en la parte inferior del tubo para su uso posterior. Tenga en cuenta que este procedimiento reduce las plaquetas en los perfundidos finales a menos de 0,1% de los niveles normales 31. </li></ol></li></ol> 4. Disponer de Tejidos en el AnimalBandeja <ol><li> Afeitarse el abdomen de la rata anestesiada desde abajo del ombligo al apéndice xifoides. Asegúrese de que el área afeitada se extiende alrededor de la parte derecha (por rata colocada en el lado derecho) para que el pelo no se forma una mecha para dibujar el superperfundido fuera del tejido también. Eliminar pelos cortados con una gasa humedecida o tejido. <ol><li> Mantenga la piel con un objeto contundente fórceps dentadas y hacer una incisión en la línea central (2-3 cm de largo) a través de la piel con unas tijeras resistentes. El uso de un bien (iris) tijeras hacen una incisión similar a través de la línea alba, el levantamiento de la pared abdominal con pinzas dentadas para evitar daños en el intestino. </li><li> Con el animal en su lado de la bandeja de animal, tire suavemente de la tripa de la cavidad abdominal con bastoncillos de algodón (palo de madera) empapados en solución de Ringer y pinzas dentadas contundentes. Organizar el intestino en el tejido bien para que el mesenterio se monta sobre el pilar para ver a través del microscopio con cuidado de no tocar el mesenterio (potedañar ntially microvasos), ya sea con fórceps o algodón. Nota: La bandeja de animales (Figura 2A) puede construirse a partir de plexiglás y requiere un tejido bien (alrededor de 3 mm de profundidad), un pilar ópticamente claro (por ejemplo, cuarzo pulido alrededor de 2 cm de diámetro y 5 mm de altura.), Y una almohadilla de calentamiento ajustada para mantener la temperatura del animal. El espesor de la columna no debe exceder la distancia de trabajo del objetivo. </li></ol></li><li> Coloque la bandeja de animal en la platina del microscopio de manera que el mesenterio es visible a través de los oculares. </li><li> Coloque una línea de goteo por gravedad a superfuse continuamente el mesenterio con solución de mamíferos de Ringer mantenida a 35-37 ° C. Utilice compresas de gasa para mantener el intestino en su lugar, ayudar a retener la humedad y absorber el exceso de solución de Ringer de la superficie. Ajustar el flujo y aspirar el efluente para mantener un espesor superperfundido consistente. </li><li> Identificar objetivo microvasos venulares, que sonsegmentos no ramificados aguas abajo del flujo convergente, una o dos ramas distales a los verdaderos capilares. Encontrar un buque no ramificado (idealmente, de 600 a 1.000 m de longitud) con el flujo de sangre a paso ligero y libre de células blancas que se pegan en la pared del vaso. </li><li> Coloque la prueba de microvasos en el centro del campo del microscopio y mover el retenedor en su posición cerca del sitio de canulación elegido. </li></ol> 5. Llene Micropipeta y el monte en el soporte <ol><li> Justo antes de la canulación, suspender las células rojas de la perfusión. Añadir 7 l de concentrado de hematíes a 0,5 ml de perfusión en un tubo de ensayo de borosilicato limpio. Nota: hematocritos de 1-3% pueden ser utilizados, pero hematocrito consistente dará lugar a concentraciones de perfundido consistente de cualquier sustancias liberadas de las células rojas. </li><li> Coloque una jeringa de 1 ml con un adaptador de tubería de 23G y PE 50 tubos (5-15 cm de longitud). Dibuje el / mezcla de glóbulos rojos perfundido en la jeringa. Invertir la jeringa para mezclar y expulsar todas las burbujas de la tubería yadaptador. Para aumentar la eficiencia, la tubería en forma de varias jeringas antes del inicio del experimento y mantenerlos en una caja libre de polvo o bolsa de plástico. </li><li> Llene la micropipeta por el avance de la tubería en el extremo grande de la micropipeta hasta que hace tope con la región cónica. Aplicar un empujón rápido suave en el émbolo de la jeringa para llenar la punta de la micropipeta. Nota: Un pequeño arroyo o de gotas deben ser visibles en la punta a la evidencia de llenado completo. </li><li> Retirar el tubo mientras empuja suavemente el émbolo para llenar la parte más ancha del eje micropipeta. Retire las pequeñas burbujas en el gran eje con un movimiento rápido con cuidado el eje micropipeta. Nota: Un procedimiento similar se ha ilustrado 32. </li><li> Coloque la micropipeta en un soporte de pipetas con un puerto lateral que permite una conexión de fluido continuo a un manómetro de agua. Asegúrese de que el titular, que se adjunta a una unidad hidráulica utilizada para controlar muy bien el avance de la micropipeta, se encuentra en un ligero ángulo (15 a 25 °)a la horizontal de modo que el borde de la conicidad micropipeta no golpea el intestino o en la bandeja. </li><li> Monte la unidad hidráulica en un micromanipulador móvil, que tiene x, y, z y unidades para permitir estrecha alineación con el recipiente de ensayo (Figura 2). </li><li> Ajustar la presión hidrostática aplicada al fluido en la micropipeta utilizando una jeringa o pera de goma lleno de agua para cambiar la altura de líquido en la columna de agua del manómetro a aproximadamente 40 cmH 2 O por encima del mesenterio. </li><li> Canular la microvasos tan pronto como sea posible después de llenar la pipeta; células rojos se asientan en la parte inferior de la pipeta, de modo que después de aproximadamente 40 min muy pocas células rojas fluirá al interior del recipiente. </li></ol> 6. Microcannulation y microvascular Medición de Presión <ol><li> Antes de colocar la micropipeta llena bajo el microscopio, presionar suavemente el limitador sobre el tejido cerca de la microvasos aplicar fuerza suficiente para agarrar el tejido. Dibujar elretenedor de la espalda, estirando ligeramente el tejido en línea con el de los microvasos de manera que las tensiones en las fibras de colágeno mesentéricos están alineados con el recipiente. <ol><li> Alinear la micropipeta con el buque y lo baja a la vista a través de los oculares. Coloque la punta justo aguas arriba del sitio de canulación elegido y lo baja sobre el tejido de modo que obstruye parcialmente el flujo dentro del vaso, pero no ocluir la misma. </li></ol></li><li> Canular la embarcación por la conducción de la punta de la pipeta lentamente en la luz del vaso utilizando el accionamiento hidráulico. Tenga cuidado de no empujar a través de la parte inferior del recipiente. Nota: Como la micropipeta entra en el lumen, el perfundido se lava rápidamente la sangre en el recipiente fuera del lumen y perfundido fluye libremente en circulación distal del animal para la prueba de los microvasos, desplazando parte de la perfusión normal de la sangre en los vasos aguas abajo. </li><li> Bajar la presión de perfusión mediante el ajuste del manómetro hasta que la sangre (como se indicapor las células rojas de los animales) se dibuja de nuevo en el segmento de perfusión; esto determina la presión de equilibrio en el que las células rojas oscilan suavemente en la luz del vaso y mide la presión hidrostática de microvasos (P c) en el extremo distal del segmento de microvasos. Mantener la perfusión buque en todas las presiones por encima de esta presión de equilibrio. </li></ol> 7. Microocclusion y Recolección de Datos <ol><li> Paso opcional: Antes de utilizar el micro-oclusor para bloquear el recipiente, pulse en el tejido en una zona no utilizada del mesenterio lejos de cualquier recipiente de modo que la punta se acumula una fina almohadilla de tejido que protege el recipiente experimental durante micro repetida oclusiones. </li><li> Coloque el bloqueador por encima del recipiente de perfundido cerca del borde inferior del campo del microscopio. </li><li> Registre la siguiente con el vídeo y el audio. <ol><li> Verbalmente registrar la ubicación del sitio de bloque y el borde inferior de la pantalla como se ve en la retícula ocular. </li><li> Con la puntadel bloqueador colocado justo encima de la de los microvasos, utilice el control z fina de la micromanipulador para bajar suavemente el bloqueador hasta que se ocluye el flujo en el vaso. Tenga en cuenta la presión del manómetro (Pc) en audio. Aplicar la oclusión normalmente para 3.10 segundos, y luego suelte, la restauración de la perfusión libre. Mueva el sitio de bloque hasta la embarcación hacia la punta de la pipeta en 5-10 micras pasos basados ​​en tiempo (&gt; 5 min después del bloque inicial en un sitio), número de oclusiones (3-5), para evitar daños en la pared del vaso en el sitio de bloque . </li></ol></li></ol> 8. Análisis de datos y medición de Lp (Agua Permeabilidad) <ol><li> Durante la reproducción de vídeo, determinar la distancia inicial (ℓ 0) a partir de una célula roja marcador para el sitio de la oclusión mediante el uso de una imagen de un micrómetro de platina y las posiciones conocidas en las imágenes. Determinar la velocidad inicial (dl / dt) de la célula marcador de su posición en varios marcos durante el 3-10 seg de las imágenes grabadas. Disuadirmina el radio del vaso (r) a partir de las imágenes tomadas durante la oclusión (Figura 3). </li><li> Calcular J v / S para cada oclusión como (dl / dt) × (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calcular L p a una presión constante como (J v / S) dividida por la presión de conducción (presión de microvasos - efectiva la presión osmótica coloidal; ver Discusión). </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los detalles de los cálculos PL. Aunque el movimiento del fluido transvascular ocurre mientras el buque está libremente perfundido, dicho intercambio es demasiado pequeña para ser medida durante la perfusión libre porque es típicamente menos de 0,01% de la tasa de perfusión buque. Sin embargo, cuando la perfusión se detiene transitoriamente mediante la oclusión de la microvasos, el flujo de transvascular (es decir, la filtración) se mide desde el movimiento de las células rojas de marcador e...

Microperfusión en la vasculatura conlleva establecer el flujo de un líquido de perfusión artificial de composición conocida controla a través de una micropipeta en un vaso sanguíneo por lo general menos de 40 micras de diámetro. El recipiente de perfundido se mantiene dentro de su entorno de tejido normal y es perfundido con la sangre del animal hasta el momento de la canulación. Cuando se utiliza junto con una serie de imágenes de vídeo o técnicas fluorométricos, en microperfusión situ permite la medición de los flujos de agua y de solutos a través de las paredes de los microvasos en condiciones donde se sabe que las fuerzas de conducción para estos flujos y las propiedades de permeabilidad de la pared vascular pueden ser directamente evaluado. Además, mediante el control de la composición del líquido que rodea al de los microvasos en el tejido (perfundido y superperfundido), la regulación de la permeabilidad microvascular y el intercambio se puede investigar al permitir que las células endoteliales que forman la pared de los microvasos de estar expuestos a una variedad de correocondiciones Xperimental (agonistas, condiciones de perfusión modificados, indicadores fluorescentes para medir la composición intracelular y la señalización) durante períodos medidos con precisión de tiempo (seg a hr). Además, las evaluaciones ultraestructurales o citoquímicos de estructuras moleculares celulares clave que regulan la barrera se pueden investigar en los mismos microvasos en el que se mide directamente la permeabilidad. El enfoque de esta manera forma un puente entre la investigación de los mecanismos celulares y moleculares para modificar la función de barrera endotelial en cultivos de monocapas de células endoteliales y la investigación en microvasos intactos. Ver las siguientes revisiones para evaluación adicional 1-6. Una limitación de microperfusión es que sólo se puede utilizar en lechos microvasculares que son delgadas, transparentes y tienen una integridad estructural suficiente para permitir la canulación con una micropipeta de vidrio. Mientras que las primeras investigaciones utilizan microvasos rana en el mesenterio y delgado cutánea angina de muscle 7,8, con mucho, la preparación más comúnmente utilizado en los modelos de mamíferos es el mesenterio de rata 9-15. La mayoría de las investigaciones se han centrado en los cambios agudos en la permeabilidad vascular estudiado durante períodos de 1-4 horas, pero las investigaciones más recientes se han extendido a las mediciones en los buques individuales de 24-72 hr después de una perfusión inicial 12,16. La tecnología CRISPR recientemente desarrollado, que promete hacer modelos de ratas modificadas genéticamente más disponibles para el estudio de la regulación de la permeabilidad vascular 17 debería permitir a los métodos descritos en esta comunicación que se aplicarán en los microvasos venulares del mesenterio en estos importantes nuevos modelos de rata. El método requiere un microscopio invertido equipado con una platina del microscopio a la medida lo suficientemente grande como para contener tanto la preparación de los animales y al menos tres micromanipuladores utilizado para microherramientas posición cerca de la embarcación perfundido y para alinear una micropipeta perfusión con el buquelumen. Por ejemplo, una plataforma personalizada para una platina del microscopio xy (alrededor de 90 × 60 cm) puede fabricarse a partir de una placa de acero 1 cm de espesor con un revestimiento a prueba de herrumbre. La etapa está unido a una tabla de índices de ingeniería o dos diapositivas en cola de milano montados en ángulos rectos y apoyadas sobre pilares de teflón o transferencias de bolas para el movimiento en el plano horizontal. Una plataforma típica (véase la figura 2) tiene mucho en común con el equipo de microscopio y microposicionamiento utilizado para una serie de experimentos microcirculación intravital como los que para medir el flujo único de los vasos sanguíneos y el hematocrito, el suministro de oxígeno local microvasos sanguíneos perfundidos, la regulación de liso vascular el tono muscular y la acumulación microvascular local de los trazadores fluorescentes inyectados en toda la circulación. 18-26 El aspecto fundamental de la técnica es la medición del flujo de volumen (v J) a través de un área de superficie definida (S) de la pared de los microvasos. Para llevar a caboesto a través de la técnica de Landis modificado descrito en el presente documento un sencillo microscopio invertido es adecuada. Una cámara de video pequeña está montado en el puerto de imagen y la señal de vídeo, con una base de tiempo de descuento, se visualiza en un monitor de video y grabado, ya sea en forma digital en un ordenador o como una señal digital o analógica en una grabadora de vídeo. Una vez que el microvasos se canula la porción de la microvasos visible a la cámara se puede cambiar moviendo el escenario y manipuladores como una unidad sin alterar la canulación. Medición de los flujos de transvascular también se puede combinar con las investigaciones más detalladas utilizando un microscopio de fluorescencia sofisticado con filtros adecuados tales como equipos de perforación utilizados para las mediciones de permeabilidad soluto, monitoreo relación fluorescente de calcio citoplasmático u otros mecanismos celulares, y de formación de imágenes confocal 6,12,13, 27. Una ventaja clave de todos los enfoques microperfusión es la capacidad de tomar medidas repetidas, en el mismo buque, En la variación controlada de fuerza motriz, como presiones hidrostáticas y oncóticos o cambio inducido en las respuestas de los buques a las condiciones inflamatorias. El diseño más común es una comparación emparejada de la conductividad hidráulica medida (L p) en el mismo recipiente con el recipiente primero perfundido a través de una micropipeta llena de un líquido de perfusión de control y la suspensión de glóbulos rojos para establecer un estado permeabilidad línea de base, a continuación, con una segunda pipeta con el agente de prueba añadido al perfundido. Múltiples canulaciones son posibles con el ciclo se repite después de la reperfusión con la pipeta de control. El presente protocolo demuestra la canulación y microperfusión de un vaso venular en mesenterio de rata para grabar flujos de agua a través de la pared de microvasos y medir la L p de la pared del vaso, un índice útil de la permeabilidad de la vía común para el agua y solutos a través de la intacto barrera endotelial. El procedimiento se denomina techniq Landis modificadoue porque el principio Landis original de utilizar el movimiento relativo de los glóbulos rojos como una medida de intercambio de fluido transvascular después de la perfusión está bloqueado se conserva 28, pero la gama de condiciones experimentales (por ejemplo, las diferencias de la presión oncótica hidrostáticas y de albúmina a través de la pared de los microvasos) disponible después microperfusión es mucho mayor que en la sangre perfundida microvasos uncannulated 8,29.

<table><tbody><tr><td>MICROSCOPIO, MESA Y PLATINA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio invertido (tipo metalúrgico) con cabezal trinocular para vídeo: ejemplo</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>intente colocar los oculares más arriba en relación con la platina: hay que mirar a través de los oculares mientras se extiende hasta la parte superior de la platina sobre los micromanipuladores intermedios</td></tr><tr><td>microscopio invertido (tipo metalúrgico) con cabeza trinocular para vídeo: ejemplo</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>intente colocar los oculares más alto en relación con la plataforma: debe mirar a través de los oculares mientras extiende la mano hasta la parte superior de la etapa sobre los micromanipuladores intermedios</td></tr><tr><td>, diámetro estrecho, larga distancia de trabajo objetivo: ejemplo:</td><td>Nikon Nikon</td><td>Plan E 10 veces; / 0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>plataforma de la etapa: taller de soldadura de chapa de acero de 1/2 pulgada o 1 cm,</td><td>esto debe ser pesado para reducir la vibración</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa Unislide x-y: correderas de cola de paloma</td> Cámara de video <td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD: ejemplo</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (ya no está disponible)</td> <td>no se necesita color</td></tr><tr><td>sistema de captura de video con audio--sistema de reproducción de video genérico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(fotograma completamente quieto, movimiento de un solo fotograma)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pequeño </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrófono MICROMANIPULADORES, SOPORTES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador, XYZ (3)</td><td>Anterior/Stoelting (ya no disponible)</td><td></td><td>busque una Z fina y un rango de recorrido más amplio en unidades gruesas para facilitar el posicionamiento</td></tr><tr><td>accionamiento de sonda hidráulica, unidireccional</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>necesita comprar accionamiento manual o accionamiento electrónico</td></tr><tr><td>accionamiento manual del tambor&nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>o accionamiento hidráulico, 3 vías</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1 vía) o MX630 (3 vías)</td> <td>ideal para brazos cortos, lleno de agua y debe enviarse de vuelta para recarga ~ cada 2 años</td></tr><tr><td>conectores/varillas/soportes</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB, etc.</td><td></td></tr><tr><td>tornillo de banco</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>para sujetar el</td></tr><tr><td>soporte de pipeta</td><td>de retención Manómetro de agua World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BANDEJA DE</td><td></td><td></td><td></td>MICROSCOPIO</tr><tr><td>transparente Plexiglás para bandeja de microscopio para animales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disco de cuarzo pulido de 3/4 de pulgada ~1/4 de pulgada de alto</td><td>Cuarzo Científico Inc.</td><td>personalizado</td><td>&nbsp;( o plexiglás pulido, vidrio); Asegúrese de que la altura sea menor que la distancia de trabajo del objetivo</td></tr><tr><td>Pegamento de plexiglás (Weld-on 4: PRECAUCIÓN CARCINOGEN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>adhesivo médico para pozo de tejido</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>Estera térmica de caucho de silicona multiusos, 5" de largo x 2" de ancho</td><td>Calentador Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>para bandeja de microscopio--necesita cable y controlador--versión de 240V disponible</td></tr><tr><td>Adaptador de cable de alimentación para calentadores y kits Kapton, 6 pies, 120 VCA</td><td>Mezclador Cole</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Controlador de voltaje variable, 10 A; 120 V de entrada, 0-140 V de salida</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>extractor de pipetas vertical</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 con filamento</td><td></td>de nicromo</tr><tr><td>Tubo capilar de pared delgada de 1,5 mm de diámetro exterior</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>amoladora de pipetas aerible piedra y microscopio de disección--vea la referencia en el texto</td><td></td><td></td><td>o compre un paquete de Sutter Instruments o World Precision Instruments</td></tr><tr><td>Máquina de bruñir RX, System II</td><td>RX Máquina de bruñido Corporation</td><td>MAC-10700 Rx Máquina de sistema II</td><td>alternativa para la piedra difusora, úsela con un microscopio de disección montado en ángulo</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; con disco de afilado cerámico</td><td>RX Máquina de afilado RX</td><td></td> Uso <td>"tal cual" o adjunte la película de lapeado</td></tr><tr><td>hojas de película de lapeado, 0.3 o 0.5 mmm</td><td>3M</td><td>número de pieza 051144 80827</td><td>268X Hojas de película de lapeado imperial con parte posterior adhesiva: se puede comprar en Amazon</td></tr></tbody></table>

microperfusión técnica de investigar reglamento de microvessel permeabilidad en rata mesenterio

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experimentos para medir las propiedades de permeabilidad de microvasos perfundidos individualmente proporcionan un puente entre la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que regulan la permeabilidad vascular en cultivos de monocapas de células endoteliales y las propiedades de intercambio funcionales de camas microvasculares enteros. Un método para canular y perfundir microvasos venulares de mesenterio de rata y medir la conductividad hidráulica de la pared de microvasos se describe. El equipo principal necesaria incluye un microscopio intravital con una etapa modificado grande que soporta micromanipuladores para posicionar tres Microtools diferentes: (1) una micropipeta de cristal biselado para canular y perfundir el microvasos; (2) un micro-oclusor de vidrio para bloquear transitoriamente la perfusión y permitir la medición de movimiento de circulación de agua transvascular a una presión hidrostática medido, y (3) una varilla de vidrio contundente para estabilizar el tejido mesentérico en el sitio de canulación. El Landis micro-oclusión techniq modificadoue utiliza glóbulos rojos suspendidos en el líquido de perfusión artificial como marcadores de movimiento de fluidos transvascular, y también permite mediciones repetidas de estos flujos condiciones experimentales se cambian y la diferencia de presión osmótica hidrostática y coloidal a través de los microvasos se controlan cuidadosamente. Las mediciones de la conductividad hidráulica primero utilizando un perfundido control, a continuación, después de volver a la canulación de la misma con los microvasos perfundidos de prueba permitir comparaciones de la respuesta de los microvasos bajo estas condiciones bien controladas emparejados. Los intentos de extender el método a los microvasos en el mesenterio de ratones con modificaciones genéticas esperados para modificar la permeabilidad vascular fueron severamente limitadas debido a la ausencia de largas microvasos rectas y no ramificados en el mesenterio ratón, pero la reciente disponibilidad de las ratas con modificaciones genéticas similares utilizando Se espera que la tecnología / Cas9 CRISPR para abrir nuevas áreas de investigación en que los métodos descritos en el presente documento pueden aplicarse. </p&gt;

La Figura 4 muestra los resultados de la medición de la evolución temporal de los cambios en L p en una rata venular microvasos canulado sucesivamente con cuatro perfundidos. 33 La magnitud de L p calculado a una presión constante se usó como una medida de los cambios en la permeabilidad de la pared de los microvasos, primero en el estado de control con un líquido de perfusión que contiene 1% de albúmina de suero bovino a continuación, cuando el recipiente se expone a la...

La técnica de Landis modificada permite la medición emparejada de la conductividad hidráulica de microvasos individuales en el mesenterio de ratas normales y modificadas genéticamente en condiciones de control y prueba utilizando técnicas de microperfusión. Proporciona un método conveniente para evaluar los mecanismos que regulan la permeabilidad de los microvasos y el intercambio transvascular en condiciones fisiológicas.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en permitir mediciones repetidas de la conductividad hidráulica o permeabilidad al agua de las paredes de microvasos ulares en el mesenterio de rata bajo condiciones experimentales controladas. Esto se logra canulando microvasos ulares para poder establecer las presiones oncótica e hidrostática en la luz y para permitir un control preciso de la composición química del perfusato ocho y de los sucesos ocho. A continuación, se ocluye el vaso y se pueden observar glóbulos rojos suspendidos en el perfusato ocho, que actúan como marcadores de flujo y se desplazan por la luz como indicadores del intercambio transvascular de líquidos.Luego, se registra la posición y velocidad de las células marcadas rojas ya sea hacia el sitio de oclusión o alejándose del sitio de oclusión. Finalmente, se libera la oclusión y se repite para mediciones adicionales o se recanaliza el vaso. Se canula nuevamente y se repiten las mediciones bajo condiciones modificadas.En última instancia, se pueden realizar mediciones pareadas de conductividad hidráulica en condiciones de control y de prueba para permitir la investigación más directa de los factores que regulan la permeabilidad de los microvasos. Una ventaja de la técnica de Landis modificada para investigar la regulación de la permeabilidad capilar es el paso de perfusión. La microperfusión permite medir la permeabilidad de la pared de los microvasos en condiciones en las que la composición del perfusado, el área superficial para el intercambio y la presión en los microvasos están completamente controladas.Este método puede abordar preguntas relacionadas con los mecanismos celulares y moleculares de la regulación de la permeabilidad en microvasos que son representativos de órganos intactos, y puede proporcionar una comparación con los resultados obtenidos de monocapas endoteliales cultivadas, que a menudo se utilizan para investigar los detalles de los mecanismos moleculares. Demostrando nuestro protocolo está Joyce Clark, nuestra gerente de laboratorio. Joyce ha sido responsable de muchas de las mejoras en este protocolo durante su tiempo aquí como gerente de nuestro laboratorio.Para comenzar, utilice un extractor electrónico para moldear varios tubos capilares de vidrio borosilicatado en puntas cónicas, cada uno con una longitud de punta aproximada de un centímetro, empleando una rueda de molienda accionada por aire y una lija de 0,5 micrones bañada en agua, junto con un soporte para micropipetas ajustado a un ángulo de 30 grados respecto al bisel horizontal, las micropipetas. Después de lavar y secar las micropipetas según el protocolo descrito en el texto, seleccione aquellas con una abertura de aproximadamente 50 micrones de longitud y una relación entre la longitud y el ancho del bisel comprendida entre 3,1 y 3,5. Asimismo, deben presentar una punta finamente cónica, lo que facilita la penetración de las resistentes fibras de colágeno en el mesenterio.Para fabricar restricciones, mantenga brevemente una micropipeta de vidrio estrechada sin bisel cerca de una microllama para formar un extremo romo. Repita el procedimiento para fabricar varias restricciones y guárdelas en una caja libre de polvo. Luego, fabrique microoclusivos sosteniendo un tubo capilar estrechado sin bisel en un ángulo bajo una microllama y utilice un adaptador de tubo o una micropipeta rota para doblar suavemente el tubo aproximadamente cuatro milímetros desde la punta, en un ángulo cercano a 120 grados.Con respecto al eje, es importante que la punta no esté sellada con la llama ni rota. Después de anestesiar una rata y acomodar el tejido mesentérico y el intestino según el protocolo descrito en el texto, coloque la bandeja del animal sobre la platina del microscopio de manera que el mesenterio sea visible a través de los oculares. Coloque una línea de goteo por gravedad con solución de Ringer para mamíferos para realizar una superperfusión continua.A continuación, utilice compresas de gasa para sostener el intestino en su lugar, ayudar a retener la humedad y absorber el exceso de solución de Ringer de la superficie; ajuste el flujo y aspire el efluente para mantener una capa constante de solución salina, identifique microvasos diana, que son segmentos no ramificados situados aguas abajo de un flujo convergente y una o dos ramas distales a los verdaderos capilares. Localice un vaso no ramificado con flujo sanguíneo rápido y libre de células blancas adheridas a la pared del vaso. Coloque los microvasos de prueba en el centro del campo del microscopio y mueva el sujetador a la posición cercana al sitio elegido para la canalización.Para llenar la micropipeta, aspire el perfusato y lave los eritrocitos hacia una jeringa preparada según el protocolo descrito en el texto, asegurándose de que no haya burbujas en el tubo. Introduzca el tubo en el extremo grande de la micropipeta hasta que toque la región cónica. Aplique un empujón suave y rápido al émbolo de la jeringa para llenar la punta de la micropipeta.Aparecerá una pequeña corriente o gota en la punta cuando esté llena. Mientras retira el tubo, presione suavemente el émbolo para llenar el vástago de la micropipeta. A continuación, elimine las burbujas pequeñas del vástago golpeándolo suavemente.Luego coloque la micropipeta en un porta-pipetas con un orificio lateral que permite una conexión continua de fluido con un manómetro de agua. Asegúrese de que el porta-pipetas, que está sujeto a una unidad hidráulica y un micromanipulador, esté colocado con un ligero ángulo horizontal para que el borde cónico de la micropipeta no toque el intestino o la bandeja. Mediante una jeringa o una perilla de goma llena de agua, ajuste la presión hidrostática aplicada al fluido en la micropipeta modificando la altura del fluido en la columna de agua del manómetro hasta aproximadamente 40 centímetros de agua por encima del mesenterio.Antes de colocar la micropipeta llena bajo el microscopio, presione suavemente el sujetador sobre el tejido cerca de los microvasos, aplicando una fuerza suficiente para agarrar el tejido, luego jale ligeramente el sujetador hacia atrás, estirando el tejido en línea con los microvasos, de modo que las tensiones en las fibras de colágeno mesentérico queden alineadas con el vaso. Alinee la micropipeta con el vaso y bájela hasta que aparezca en la vista a través de los oculares. Coloque la punta justo aguas arriba del sitio de canalización elegido y colóquela sobre el tejido de manera que obstruya parcialmente el flujo dentro del vaso, sin ocluirlo.Utilizando la unidad hidráulica, canule el vaso lentamente introduciendo la punta de la pipeta en la luz del vaso, teniendo cuidado de no atravesar el otro lado del vaso. A medida que la micropipeta entra en la luz, el perfusato ocho lavará rápidamente la sangre fuera de la luz del vaso e ingresará a la circulación. Reduzca la presión de perfusión ajustando el manómetro hasta que los glóbulos rojos oscilen suavemente dentro de la luz del vaso.Esto determina la presión de equilibrio, que mide la presión hidrostática en los microvasos o PC en el extremo distal del segmento de microvasos. Mantenga la perfusión del vaso por encima de esta presión de equilibrio para realizar la microoclusión. Coloque el bloqueador por encima del vaso perfundido cerca del borde inferior del campo del microscopio utilizando video y audio.Registre verbalmente la ubicación del sitio de bloqueo tal como se observa en el fragmento rojo de la I. El sitio de bloqueo está en 57 con la punta del bloqueador colocada justo por encima del microvaso. Utilice el control fino de Z del micromanipulador para bajar suavemente el bloqueador hasta que el flujo en el vaso esté ocluido.Utilice el audio para anotar la presión del manómetro. La presión es 50. A continuación, aplique oclusión durante tres a diez segundos y libere.Para restablecer la perfusión libre, mueva el sitio de bloqueo hacia arriba por el vaso en dirección a la punta de la pipeta en pasos de cinco a 10 micrones, realizando no más de tres a cinco oclusiones en cada ubicación para prevenir daños en la pared del vaso en el sitio de bloqueo. Analice los datos de acuerdo con el protocolo descrito en el texto. Este curso temporal mide los cambios en la conductividad hidráulica o LP. En microvasos urinarios de rata correctamente canulados con ocho perfusiones.La magnitud de LP a presión constante se utilizó para medir cambios en microvasos. La permeabilidad de la pared al perfundir con BSA al 1% como control frente a 10 moles del agente inflamatorio Bradykinina o bk. Como se muestra aquí, bk provocó un aumento transitorio en LP que regresó a los niveles de control dentro de los 10 a 15 minutos.Después de restablecer los niveles basales con BSA al 1 %, se reperfundió BK junto con un micromolar de pH escena uno fosfato o S uno P a 10 nanomolar. Los resultados indican que S uno P atenuó significativamente la respuesta a bk. Para algunos diseños experimentales, es importante estimar tanto el coeficiente de reflexión del soluto para una macromolécula como el lp.Esto se logra mejor midiendo JV a múltiples presiones en cada vaso microscópico individual. Este experimento estimó tanto LP como la presión oncótica efectiva del albúmina al 5% en el PERFUSE ocho cuando no había albúmina en el tejido que rodeaba los vasos microscópicos. JV sobre S se midió a tres presiones diferentes y se representó gráficamente aquí.El LP es la pendiente de la relación entre JV sobre S y la presión, y la intersección con el eje de presión es la diferencia efectiva de presión oncótica a través de la pared del vaso. Cuando se combina con otras técnicas como marcación inmunofluorescente y microscopía confocal, o incluso microscopía electrónica de transmisión, la microperfusión proporciona un análisis potente del endotelio microvascular y su función utilizando vasos de permeabilidad conocida. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar mediciones repetidas de la conductividad hidráulica o permeabilidad al agua de microvasos ulares en el mesenterio de rata bajo condiciones experimentales controladas.Puede utilizar este enfoque en los modelos de rata actualmente disponibles, pero me interesa especialmente la posibilidad de que se pueda usar en nuevas ratas modificadas genéticamente que estarán disponibles gracias a la tecnología CRISPR Cas nine, y espero que se extienda de esta manera.

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Adultos normales tejido vascularizado mamífero que carece de la angiogénesis fisiológica y que no ha sido expuesto a la intervención quirúrgica se utiliza para estudiar: (i) el inicio y desarrollo de la angiogénesis tras la administración intraperitoneal de agentes de prueba, y (ii) la modificación de la angiogénesis tras la administración sistémica de seleccionados agentes de pruebas.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

Este artículo describe un modelo simple para estimular la angiogénesis en el mesenterio de rata. El modelo produce aumentos dramáticos en el brote capilar, área vascular y la densidad vascular durante un transcurso de tiempo relativamente corto en un tejido que permite la visualización en la cara de la totalidad de las redes microvasculares hasta el nivel de células individuales.

Rata Exteriorización Mesenterio: un modelo para investigar la dinámica celulares implicados en la angiogénesis

Miografía de presión se utiliza para evaluar vasoactividad de las pequeñas arterias que se desarrollan constricción sostenida cuando se presuriza. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para evaluar en segmentos aislados de pequeñas arterias mesentéricas de ratas, vasoactividad y el efecto de la presión intraluminal del diámetro vascular.

Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

La preparación aislada de pulmón perfundido con sangre hace que sea posible visualizar las redes de microvasos en la superficie del pulmón. A continuación se describe un método para cuantificar la permeabilidad de la microvasculatura individuales en pulmones aislados utilizando imágenes de fluorescencia en tiempo real.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Angiogénesis implica interacciones multicelulares y multisistémicas que necesitan ser investigadas en un entorno fisiológicamente relevante. El objetivo de este estudio es demostrar la capacidad del modelo de cultivo de mesenterio en rata para realizar comparaciones time-lapse de redes microvasculares intactas durante la angiogénesis.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares Redes

Este manuscrito describe en vitro protocolos video microscopia para evaluar la función vascular en las arterias de resistencia cerebral de rata. El manuscrito también describe técnicas para evaluar la densidad de microvessel con fluorescencia marcada perfusión lectinas y tejido mediante flujometría Doppler láser.

Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas

En el presente protocolo, la función de barrera endotelial de la glándula submandibular (SMG) se evaluó inyectando diferentes trazadores fluorescentes ponderados molecularmente en las venas angulares de modelos animales de prueba in vivo bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones.

In vivo Detección de permeabilidad vascular en glándula submandibular de ratón

Este protocolo presenta un método para inducir la lesión por isquemia-reperfusión mesentérica y visualizar trampas extracelulares (TNE) de neutrófilos en vénulas mesentéricas mediante microscopía intravital. El flujo sanguíneo en la arteria mesentérica superior se restringió durante 1 h, seguido de reperfusión, lo que permitió cuantificar directamente la adhesión leucocitaria y la NETosis.

Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

Este video muestra la disección y remoción del timo fetal y la preparación de cultivos ex vivo de 2-dGuo tratados con el timo.

Preparación de 2-dGuo cultivos tratados con órganos timo

Aprende la técnica de microperfusión modificada de Landis para medir la conductividad hidráulica en microvasos del mesenterio de rata. Este método permite evaluar la permeabilidad vascular bajo condiciones controladas.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Explorar más videos