Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

El objetivo general del siguiente experimento consiste en permitir mediciones repetidas de la conductividad hidráulica o permeabilidad al agua de las paredes de microvasos ulares en el mesenterio de rata bajo condiciones experimentales controladas. Esto se logra canulando microvasos ulares para poder establecer las presiones oncótica e hidrostática en la luz y para permitir un control preciso de la composición química del perfusato ocho y de los sucesos ocho. A continuación, se ocluye el vaso y se pueden observar glóbulos rojos suspendidos en el perfusato ocho, que actúan como marcadores de flujo y se desplazan por la luz como indicadores del intercambio transvascular de líquidos.

Luego, se registra la posición y velocidad de las células marcadas rojas ya sea hacia el sitio de oclusión o alejándose del sitio de oclusión. Finalmente, se libera la oclusión y se repite para mediciones adicionales o se recanaliza el vaso. Se canula nuevamente y se repiten las mediciones bajo condiciones modificadas.

En última instancia, se pueden realizar mediciones pareadas de conductividad hidráulica en condiciones de control y de prueba para permitir la investigación más directa de los factores que regulan la permeabilidad de los microvasos. Una ventaja de la técnica de Landis modificada para investigar la regulación de la permeabilidad capilar es el paso de perfusión. La microperfusión permite medir la permeabilidad de la pared de los microvasos en condiciones en las que la composición del perfusado, el área superficial para el intercambio y la presión en los microvasos están completamente controladas.

Este método puede abordar preguntas relacionadas con los mecanismos celulares y moleculares de la regulación de la permeabilidad en microvasos que son representativos de órganos intactos, y puede proporcionar una comparación con los resultados obtenidos de monocapas endoteliales cultivadas, que a menudo se utilizan para investigar los detalles de los mecanismos moleculares. Demostrando nuestro protocolo está Joyce Clark, nuestra gerente de laboratorio. Joyce ha sido responsable de muchas de las mejoras en este protocolo durante su tiempo aquí como gerente de nuestro laboratorio.

Para comenzar, utilice un extractor electrónico para moldear varios tubos capilares de vidrio borosilicatado en puntas cónicas, cada uno con una longitud de punta aproximada de un centímetro, empleando una rueda de molienda accionada por aire y una lija de 0,5 micrones bañada en agua, junto con un soporte para micropipetas ajustado a un ángulo de 30 grados respecto al bisel horizontal, las micropipetas. Después de lavar y secar las micropipetas según el protocolo descrito en el texto, seleccione aquellas con una abertura de aproximadamente 50 micrones de longitud y una relación entre la longitud y el ancho del bisel comprendida entre 3,1 y 3,5. Asimismo, deben presentar una punta finamente cónica, lo que facilita la penetración de las resistentes fibras de colágeno en el mesenterio.

Para fabricar restricciones, mantenga brevemente una micropipeta de vidrio estrechada sin bisel cerca de una microllama para formar un extremo romo. Repita el procedimiento para fabricar varias restricciones y guárdelas en una caja libre de polvo. Luego, fabrique microoclusivos sosteniendo un tubo capilar estrechado sin bisel en un ángulo bajo una microllama y utilice un adaptador de tubo o una micropipeta rota para doblar suavemente el tubo aproximadamente cuatro milímetros desde la punta, en un ángulo cercano a 120 grados.

Con respecto al eje, es importante que la punta no esté sellada con la llama ni rota. Después de anestesiar una rata y acomodar el tejido mesentérico y el intestino según el protocolo descrito en el texto, coloque la bandeja del animal sobre la platina del microscopio de manera que el mesenterio sea visible a través de los oculares. Coloque una línea de goteo por gravedad con solución de Ringer para mamíferos para realizar una superperfusión continua.

A continuación, utilice compresas de gasa para sostener el intestino en su lugar, ayudar a retener la humedad y absorber el exceso de solución de Ringer de la superficie; ajuste el flujo y aspire el efluente para mantener una capa constante de solución salina, identifique microvasos diana, que son segmentos no ramificados situados aguas abajo de un flujo convergente y una o dos ramas distales a los verdaderos capilares. Localice un vaso no ramificado con flujo sanguíneo rápido y libre de células blancas adheridas a la pared del vaso. Coloque los microvasos de prueba en el centro del campo del microscopio y mueva el sujetador a la posición cercana al sitio elegido para la canalización.

Para llenar la micropipeta, aspire el perfusato y lave los eritrocitos hacia una jeringa preparada según el protocolo descrito en el texto, asegurándose de que no haya burbujas en el tubo. Introduzca el tubo en el extremo grande de la micropipeta hasta que toque la región cónica. Aplique un empujón suave y rápido al émbolo de la jeringa para llenar la punta de la micropipeta.

Aparecerá una pequeña corriente o gota en la punta cuando esté llena. Mientras retira el tubo, presione suavemente el émbolo para llenar el vástago de la micropipeta. A continuación, elimine las burbujas pequeñas del vástago golpeándolo suavemente.

Luego coloque la micropipeta en un porta-pipetas con un orificio lateral que permite una conexión continua de fluido con un manómetro de agua. Asegúrese de que el porta-pipetas, que está sujeto a una unidad hidráulica y un micromanipulador, esté colocado con un ligero ángulo horizontal para que el borde cónico de la micropipeta no toque el intestino o la bandeja. Mediante una jeringa o una perilla de goma llena de agua, ajuste la presión hidrostática aplicada al fluido en la micropipeta modificando la altura del fluido en la columna de agua del manómetro hasta aproximadamente 40 centímetros de agua por encima del mesenterio.

Antes de colocar la micropipeta llena bajo el microscopio, presione suavemente el sujetador sobre el tejido cerca de los microvasos, aplicando una fuerza suficiente para agarrar el tejido, luego jale ligeramente el sujetador hacia atrás, estirando el tejido en línea con los microvasos, de modo que las tensiones en las fibras de colágeno mesentérico queden alineadas con el vaso. Alinee la micropipeta con el vaso y bájela hasta que aparezca en la vista a través de los oculares. Coloque la punta justo aguas arriba del sitio de canalización elegido y colóquela sobre el tejido de manera que obstruya parcialmente el flujo dentro del vaso, sin ocluirlo.

Utilizando la unidad hidráulica, canule el vaso lentamente introduciendo la punta de la pipeta en la luz del vaso, teniendo cuidado de no atravesar el otro lado del vaso. A medida que la micropipeta entra en la luz, el perfusato ocho lavará rápidamente la sangre fuera de la luz del vaso e ingresará a la circulación. Reduzca la presión de perfusión ajustando el manómetro hasta que los glóbulos rojos oscilen suavemente dentro de la luz del vaso.

Esto determina la presión de equilibrio, que mide la presión hidrostática en los microvasos o PC en el extremo distal del segmento de microvasos. Mantenga la perfusión del vaso por encima de esta presión de equilibrio para realizar la microoclusión. Coloque el bloqueador por encima del vaso perfundido cerca del borde inferior del campo del microscopio utilizando video y audio.

Registre verbalmente la ubicación del sitio de bloqueo tal como se observa en el fragmento rojo de la I. El sitio de bloqueo está en 57 con la punta del bloqueador colocada justo por encima del microvaso. Utilice el control fino de Z del micromanipulador para bajar suavemente el bloqueador hasta que el flujo en el vaso esté ocluido.

Utilice el audio para anotar la presión del manómetro. La presión es 50. A continuación, aplique oclusión durante tres a diez segundos y libere.

Para restablecer la perfusión libre, mueva el sitio de bloqueo hacia arriba por el vaso en dirección a la punta de la pipeta en pasos de cinco a 10 micrones, realizando no más de tres a cinco oclusiones en cada ubicación para prevenir daños en la pared del vaso en el sitio de bloqueo. Analice los datos de acuerdo con el protocolo descrito en el texto. Este curso temporal mide los cambios en la conductividad hidráulica o LP. En microvasos urinarios de rata correctamente canulados con ocho perfusiones.

La magnitud de LP a presión constante se utilizó para medir cambios en microvasos. La permeabilidad de la pared al perfundir con BSA al 1% como control frente a 10 moles del agente inflamatorio Bradykinina o bk. Como se muestra aquí, bk provocó un aumento transitorio en LP que regresó a los niveles de control dentro de los 10 a 15 minutos.

Después de restablecer los niveles basales con BSA al 1 %, se reperfundió BK junto con un micromolar de pH escena uno fosfato o S uno P a 10 nanomolar. Los resultados indican que S uno P atenuó significativamente la respuesta a bk. Para algunos diseños experimentales, es importante estimar tanto el coeficiente de reflexión del soluto para una macromolécula como el lp.

Esto se logra mejor midiendo JV a múltiples presiones en cada vaso microscópico individual. Este experimento estimó tanto LP como la presión oncótica efectiva del albúmina al 5% en el PERFUSE ocho cuando no había albúmina en el tejido que rodeaba los vasos microscópicos. JV sobre S se midió a tres presiones diferentes y se representó gráficamente aquí.

El LP es la pendiente de la relación entre JV sobre S y la presión, y la intersección con el eje de presión es la diferencia efectiva de presión oncótica a través de la pared del vaso. Cuando se combina con otras técnicas como marcación inmunofluorescente y microscopía confocal, o incluso microscopía electrónica de transmisión, la microperfusión proporciona un análisis potente del endotelio microvascular y su función utilizando vasos de permeabilidad conocida. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar mediciones repetidas de la conductividad hidráulica o permeabilidad al agua de microvasos ulares en el mesenterio de rata bajo condiciones experimentales controladas.

Puede utilizar este enfoque en los modelos de rata actualmente disponibles, pero me interesa especialmente la posibilidad de que se pueda usar en nuevas ratas modificadas genéticamente que estarán disponibles gracias a la tecnología CRISPR Cas nine, y espero que se extienda de esta manera.