Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias
13 de noviembre de 2015
Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.
El objetivo general de este artículo de video es aislar mitocondrias de alta calidad de pequeñas cantidades de músculo esquelético de ratón para su uso en ensayos tric basados en microplacas. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en la investigación biomédica, como describir cómo ciertos medicamentos y proteínas modulan el músculo esquelético y el consumo de oxígeno mitocondrial. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden aislar mitocondrias de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón de lo que se ha informado anteriormente.
Realizar la eutanasia del ratón de acuerdo con las directrices de la institución. A continuación, coloque el ratón de lado y utilice unas tijeras de punta fina para hacer una incisión en la piel. Superposición del epicóndilo lateral del fémur.
Pele la piel hacia el ratón y luego retire la almohadilla de grasa colocada sobre el punto de origen del cuádriceps. A continuación, corte el tendón del cuádriceps que está unido a la rótula. Corta lentamente la apo neurosis entre el hueso y el cuádriceps evitando la arteria femoral.
A continuación, corte el tendón en el punto de origen del fémur para liberar el músculo cuádriceps y coloque el músculo cuádriceps en PBS refrigerado. Retire cualquier tejido adiposo visible sobre el cuádriceps con unas tijeras. Una vez limpio, voltee los cuádriceps para que la parte del músculo que estaba sobre el fémur quede hacia arriba.
Abra el músculo cuádriceps con pinzas con un movimiento de abanico. Retire las dos porciones de músculo rojo visible de cada lóbulo y colóquelas en un vaso de precipitados que contenga cinco mililitros de mitocondrias frías. Búfer de aislamiento.
A continuación, corta la piel que recubre el tendón de Aquiles con unas tijeras de punta fina y pela la piel hacia el ratón. Corta el tendón de Aquiles expuesto y pela el músculo hacia el cuerpo del ratón. Corte el tendón en los cóndilos lateral y medial del fémur para liberar el gastrocnemio y coloque el gastrocnemio unido a sus tendones en un plato lleno de PBS frío.
Dale la vuelta al gastrocnemio y despega el músculo sóleo. Coloque el músculo sóleo en el vaso de precipitados que contiene cinco mililitros de mitocondrias refrigeradas. Búfer de aislamiento.
Un siguiente ventilador abrió el gastroc y retiró las tres porciones de músculo rojo visual. Habrá dos porciones laterales y una franja roja superficial medial. Una vez aislado, transfiera el músculo rojo al vaso de precipitados que contiene cinco mililitros de mitocondrias refrigeradas.
Búfer de aislamiento uno. Retira otros 75 a 100 miligramos de músculo rojo de la otra pata del ratón. Repitiendo el proceso que se acaba de mostrar.
Coloque el músculo disecado de la segunda pierna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con el cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa y el tampón de lisis celular preparado como se describe en el protocolo de texto adjunto. Congele inmediatamente la segunda muestra en nitrógeno líquido para su uso en Western bloting. Coloque una superficie de plástico plana precurada sobre hielo en un balde grande.
A continuación, vierta una gota de tampón de aislamiento de mitocondrias sobre la superficie de plástico y utilice unas pinzas para colocar todo el músculo rojo seccionado en una gota de aislamiento. Búfer. Pica el tejido muscular durante dos minutos con hojas de afeitar de un solo filo, cambia a una nueva navaja afilada cada 40 segundos. Transfiera el tejido picado a un nuevo vaso de precipitados con cinco mililitros de mitocondrias frescas.
Búfer de aislamiento uno. Luego tome la solución y escúrrala a través de un colador de células de 100 micras, colocado en un tubo cónico de 50 mililitros. Seque el pañuelo con un limpiador delicado y luego transfiéralo a cinco mililitros de una solución de prueba al 0,05%.
Use pinzas para eliminar cualquier resto de tejido del limpiador de tareas y agréguelo a la tripsina. Incubar el tejido muscular en la solución de tripsina sobre hielo durante 30 minutos. A continuación, centrifugar la muestra a 200 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.
Después de la centrifugación, vierta el supinato de tripsina en un contenedor de residuos y vuelva a suspender el pellet con tres mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias heladas. A continuación, transfiera el tejido a un tubo homogeneizador de vidrio de 45 mililitros. Enjuague el tubo cónico de 15 mililitros con otros 1,5 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias para recoger cualquier muestra restante y agréguela al tubo homogeneizador de vidrio.
A continuación, coloque el tubo homogeneizador de vidrio en un vaso de precipitados o recipiente de plástico lleno hasta la mitad con hielo. Por lo tanto, el homogeneizador de vidrio se mueve mínimamente dentro del vaso de precipitados. Homogeneizar la muestra con un mortero de politetrafluoroetileno unido a un tejido accionado por motor.
Homogeneizador con 10 a 80 RPM. Sostenga la parte inferior de cada pasada durante unos dos segundos. A continuación, transfiera el homogeneizado de tejido a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.
Y enjuague el tubo homogeneizador de vidrio con 6,5 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias uno. Vierta el tampón en el tubo cónico de 15 mililitros que contiene el resto del tejido. Homogeneizado. Haga girar la muestra a 700 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y luego vierta suavemente el supinato en un tubo de centrífuga de vidrio de alta resistencia y deseche el pellet.
A continuación, gire el lazo a 8.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Para pellet las mitocondrias, retire el snat y vuelva a suspender el pellet añadiendo lentamente 500 microlitros de tampón de aislamiento de mitocondrias dos, corte el extremo de la punta de una pipeta y homogeneice suavemente el pellet en el tampón con movimientos de mezcla y agitación. A continuación, añade otros 4,5 mililitros de aislamiento de mitocondrias.
Después de que el gránulo esté completamente suspendido, gire el homogeneizado a 8.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para volver a pellet las mitocondrias. Retire el sobrenadante S y vuelva a suspender el pellet de forma suave pero completa añadiendo 2 incrementos de 25 microlitros de aislamiento de mitocondrias. Tampón dos, con una punta de pipeta con la punta cortada, revuelva suavemente y mezcle el pellet después de cada edición de 25 microlitros de tampón.
Cuando termine, coloque este caldo mitocondrial en hielo. Haga dos diluciones separadas de una a 20 del caldo mitocondrial en agua de alta pureza. Añada el 0,1% de Triton 100 x a una muestra y sonique durante 10 segundos a un ajuste bajo.
Deje la otra dilución en hielo y devuelva la muestra sonicada a hielo. Después de la sonicación, realice un ensayo de citrato sintasa con la dilución mitocondrial no sonicada y sonicada utilizando un ensayo fotométrico utilizando técnicas estándar, determine el porcentaje de membranas mitocondriales intactas utilizando las ecuaciones proporcionadas en el protocolo de texto adjunto. La sindicación de las mitocondrias da como resultado un aumento estadísticamente significativo en la actividad de la citrato sintasa.
La actividad sintasa de citrato en muestras mitocondriales no sonicadas en comparación con muestras sonicadas muestra que el 92,5% de las mitocondrias estaban intactas después de la expresión aislada de ga. DH y COX cuatro son evidentes en todo el tejido lisado en las mitocondrias aisladas, se observa la expresión de Cox cuatro. Si bien solo son evidentes bandas tenues de GA DH, estos hallazgos indican buenos aislamientos mitocondriales con poca contaminación de componentes no mitocondriales durante el procedimiento de aislamiento.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular el caldo mitocondrial con cuidado, nunca vórticelo ni mezclarlo vigorosamente después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la medición de la producción de especies de acción reactiva, para responder a preguntas adicionales, como si una intervención influye en la producción de especies reactivas de oxígeno en mitocondrias aisladas.
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Descripción general
Este artículo en video presenta un método para aislar mitocondrias de alta calidad a partir de pequeñas cantidades de músculo esquelético de ratón, adecuado para ensayos respirométricos basados en microplacas. La técnica mejora la comprensión de la función mitocondrial y su modulación por diversas sustancias.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Bioquímica
Antecedentes
- Las mitocondrias desempeñan un papel crucial en el metabolismo energético.
- Comprender la función mitocondrial es fundamental para la investigación biomédica.
- Los métodos anteriores requerían muestras de tejido más grandes para el aislamiento de mitocondrias.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar la eficiencia del aislamiento de mitocondrias.
Objetivo del estudio
- Aislar mitocondrias de alta calidad a partir de pequeñas cantidades de músculo esquelético.
- Facilitar la investigación sobre el consumo mitocondrial de oxígeno.
- Proporcionar un método confiable para estudiar los efectos de fármacos y proteínas sobre las mitocondrias.
Métodos Utilizados
- Eutanasia del ratón realizada según las directrices institucionales.
- Incisión realizada en la piel sobre el fémur para acceder al tejido.
- Aislamiento de mitocondrias a partir de muestras de músculo esquelético.
- Ensayos respirométricos basados en microplacas realizados para evaluar la función mitocondrial.
Resultados Principales
- Se aislaron con éxito mitocondrias de alta calidad a partir de muestras de tejido más pequeñas.
- Las mitocondrias aisladas mostraron un alto acoplamiento respiratorio.
- El método resultó efectivo para ensayos basados en microplacas.
- Los resultados respaldan futuras investigaciones sobre la modulación mitocondrial.
Conclusiones
- Este método permite el aislamiento eficiente de mitocondrias a partir de tejidos limitados.
- Abre nuevas vías para estudiar la función mitocondrial en diversos contextos.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para el análisis de interacciones de fármacos y proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar mitocondrias funcionales a partir de cantidades limitadas de músculo esquelético permite la validación temprana de objetivos en la investigación de enfermedades metabólicas. Este enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar lecturas respirométricas cuantitativas obtenidas a partir de tejido fisiológicamente relevante. Mejora la confianza predictiva en programas preclínicos dirigidos a las vías relacionadas con la obesidad, el envejecimiento y la diabetes tipo II.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función mitocondrial como diana terapéutica en trastornos metabólicos.
- Valor operativo: Reduce los requisitos de cantidad de tejido, aumentando la viabilidad del cribado preclínico de dianas.
- Valor científico: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante la evaluación de la integridad mitocondrial y la eficiencia de acoplamiento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera preparaciones de mitocondrias íntegras adecuadas para la respirometría en microplacas de alto rendimiento.
- Valor operativo: Proporciona mediciones reproducibles del consumo de O2 con ratios de control respiratorio >6.
- Valor científico: Permite la evaluación cuantitativa de los efectos de fármacos o proteínas sobre la función mitocondrial.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Utiliza músculo esquelético relevante para la enfermedad para modelar la disfunción mitocondrial en la obesidad y la diabetes.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo de aislamiento escalable compatible con formatos de placas de múltiples pozos.
- Valor científico: Facilita la continuidad traslacional desde el descubrimiento del blanco hasta la validación preclínica.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos líderes, particularmente para indicaciones metabólicas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la investigación mecanicista de las vías mitocondriales en el músculo esquelético.
- Selección: Permite obtener muestras mitocondriales listas para ensayos, aptas para la selección de compuestos en formatos de microplaca.
- Análisis: Proporciona resultados respirométricos cuantitativos, incluyendo flujo de O2 y ratios de control respiratorio.
- Investigación Traducional: Relaciona la función mitocondrial con modelos preclínicos de enfermedades metabólicas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de aislamiento reutilizable para la evaluación de mitocondrias en músculo esquelético.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo mediante la evaluación de la integridad y función mitocondrial.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y reduce la variabilidad en la respirometría mitocondrial.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones tempranas de avance o descarte al reducir el riesgo de toxicidad mitocondrial en candidatos principales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos que afectan el metabolismo mitocondrial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de aislamiento mitocondrial y ensayos respirométricos.
- Depende del acceso a equipos de homogenización, centrífugas y lectores de microplacas.
- Necesita protocolos estandarizados para el manejo de tejidos y la preparación de tampones entre los equipos.
- La adaptación a otros tejidos puede requerir la optimización de los parámetros de picado y homogenización.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad en el rendimiento según la calidad del tejido y la competencia del técnico.
