El estudio de las comunidades microbianas

El objetivo general de este procedimiento es construir un modelo para estudiar las interacciones entre una bacteria individual y un hongo único. Este enfoque puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones entre patógenos, como qué factores están involucrados en la comunicación cruzada y el dialecto interespecífico. La principal ventaja de esta técnica es que los datos generados a partir de este modelo in vivo tienen relevancia clínica.

Para administrar intranasalmente el hongo, primero diluya dos veces diez a la sexta UFC de C.albicans por mililitro en PBS estéril. A continuación, tras confirmar la pérdida del reflejo de enderezamiento en un ratón adulto hipotónico, aspire al menos 50 microlitros de la suspensión fúngica en una pipeta de 200 microlitros. Ahora, sostenga el ratón con una mano y gírelo de modo que quede acostado de espaldas con su abdomen orientado hacia arriba.

Cuando el ratón esté en posición, use el dedo índice de la mano que sostiene al ratón para sostener la cabeza, y el pulgar para mantener la mandíbula cerrada, y acerque la punta de la pipeta cerca de la nariz del animal. Luego, dispense cuidadosamente una gota de 50 microlitros de hongo sobre las fosas nasales, permitiendo que la gota sea inhalada por la respiración espontánea del ratón. A continuación, coloque al ratón solo en una jaula hasta que se recupere completamente.

Cuatro días después de la instalación de C.albicans, afeite el abdomen del animal sacrificado, seguido de la esterilización con etanol de la piel expuesta. A continuación, use tijeras para abrir la piel desde el esternón hasta la parte media del abdomen. Luego, extienda la incisión a lo largo de la caja torácica a ambos lados de la línea media y retire hacia atrás la piel a cada lado del tórax.

Cuando sea visible la caja torácica, realice una incisión vertical a ambos lados del tórax hacia las clavículas, y utilice el esternón para retraer toda la pared torácica anterior y visualizar el corazón y los pulmones. A continuación, utilizando una jeringa previamente heparinizada, punce el corazón junto a la arteria intraventricular y retire un mínimo de 500 microlitros de sangre. Coloque la muestra de sangre sobre hielo.

A continuación, realice una incisión cervical en la línea media para exponer la tráquea. Diseque cuidadosamente la fascia alrededor de la tráquea y coloque un punto de sutura por debajo de esta. Luego, utilice una aguja de gavaje modificada de calibre 20 para cateterizar la tráquea, asegurando la cánula con el punto de sutura previamente colocado.

Para realizar una lavado broncoalveolar, dispensar suavemente 500 microlitros de PBS frío con hielo en el pulmón. Luego, aspirar el líquido de lavado y transferir el fluido a un tubo centrífugo de dos mililitros sobre hielo. Después de recolectar dos muestras adicionales de 500 microlitros, extraer los pulmones de la cavidad torácica y colocar un fragmento de pulmón en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros para su almacenamiento inmediato a menos 80 grados Celsius.

Luego, coloque otra porción de tejido pulmonar en un tubo de hemólisis previamente pesado que contenga PBS sobre hielo. Finalmente, realice una incisión en el lado izquierdo del abdomen. Extraiga el bazo y colóquelo en un segundo tubo de hemólisis que contenga un mililitro de PBS, y coloque el tubo sobre hielo.

Se obtiene un modelo de persistencia de cuatro días mediante la administración intranasal de cinco veces diez a la quinta UFC de C.albicans por ratón. Durante estos cuatro días, los ratones ganan peso, pero no presentan lesión pulmonar. Sin embargo, a medida que aumenta la UFC del inóculo, también lo hace la lesión pulmonar.

Con el daño pulmonar máximo observado entre 24 y 36 horas después de la infección. La carga bacteriana, por el contrario, muestra una disminución de un logaritmo de UFC por mililitro cada 24 horas, con un aumento acumulativo en la diseminación bacteriana observado cada día. En el lavado broncoalveolar obtenido de los ratones infectados, los neutrófilos son ampliamente reclutados, y el recuento diferencial de células muestra una población de células inmunitarias infiltrantes compuesta por 90 por ciento de neutrófilos y 10 por ciento de macrófagos y linfocitos.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis del lavado broncoalveolar, para responder preguntas adicionales sobre la caracterización de la respuesta inflamatoria. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer una colonización por Pseudomonas. No olvide que trabajar con Candida luminiscente puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de protección para evitar la contaminación por gotas, durante la realización de este procedimiento.