El estudio de las comunidades microbianas En Vivo: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre Candida Albicans Y Pseudomonas Aeruginosa En las vías respiratorias

El objetivo general de este procedimiento es construir un modelo para estudiar las interacciones entre una bacteria individual y un solo hongo. Este mensaje puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones entre patógenos, como qué factores están involucrados en la diafonía y el dialecto entre especies. La principal ventaja de esta técnica es que los datos generados a partir de este modelo in vivo tienen relevancia clínica.

Para instalar el hongo por vía intranasal, primero diluya dos veces diez a la sexta UFC de C. albicans por mililitro en PBS estéril. A continuación, después de confirmar la pérdida del reflejo de enderezamiento en un ratón hipotónico adulto, aspire al menos 50 microlitros de la suspensión fúngica en una pipeta de 200 microlitros. Ahora, agarra al ratón con una mano y gira al animal para que quede acurrucado boca arriba con el abdomen erguido.

Cuando el ratón esté en posición, utilice el dedo índice de la mano que sostiene el ratón para apoyar la cabeza y el pulgar para mantener la mandíbula cerrada, y acerque la punta de la pipeta a la nariz del animal. Luego, dispense con cuidado una gota de 50 microlitros de hongo en las fosas nasales, permitiendo que la gota sea inhalada por la respiración espontánea del ratón. Y coloque al ratón solo en una jaula hasta que esté completamente recuperado.

Cuatro días después de la instalación de C. albicans, afeitar el abdomen del animal sacrificado, seguido de la esterilización con etanol de la piel expuesta. A continuación, utilice unas tijeras para abrir la piel desde el esternón hasta la mitad del abdomen. Luego, extienda la incisión a lo largo de la caja torácica a cada lado de la línea media y pliegue la piel a cada lado del tórax.

Cuando la caja torácica sea visible, haga una incisión vertical a cada lado del tórax hacia las clavículas y use el esternón para reclinar toda la pared torácica anterior para visualizar el corazón y los pulmones. A continuación, con una jeringa preheparinizada, se perfora el corazón junto a la arteria intraventricular y se extrae un mínimo de 500 microlitros de sangre. Coloque la muestra de sangre en hielo.

Luego, haz una incisión cervical en la línea media para revelar la tráquea. Diseccione cuidadosamente la fascia alrededor de la tráquea, seguido de la colocación de una sutura debajo de la tráquea. Luego, use una aguja de sonda nasogástrica modificada de calibre 20 para cateterizar la tráquea, asegurando la cánula con la sutura colocada anteriormente.

Para realizar un lavado broncoalveolar, dispense suavemente 500 microlitros de PBS helado en el pulmón. Luego, aspire el líquido de lavado y transfiera el líquido a un tubo de centrífuga de dos mililitros con hielo. Después de recolectar dos muestras más de 500 microlitros, retire los pulmones del tórax y coloque un trozo de pulmón en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros para su almacenamiento inmediato a menos 80 grados centígrados.

Luego, coloque otra pieza de tejido pulmonar en un tubo de hemólisis previamente pesado que contenga PBS en hielo. Finalmente, haga una incisión en el lado izquierdo del abdomen. Extraiga el bazo en un segundo tubo de hemólisis que contenga un mililitro de PBS y coloque el tubo en hielo.

Se obtiene un modelo de persistencia de cuatro días mediante instalación intranasal de cinco veces diez a la quinta UFC de C. albicans por ratón. Durante estos cuatro días, los ratones aumentan de peso, pero no presentan lesión pulmonar. Sin embargo, a medida que aumenta la UFC del inóculo, también lo hace la lesión pulmonar.

Con la lesión pulmonar máxima observada entre 24 a 36 horas después de la infección. La carga bacteriana, por el contrario, muestra una disminución de un log UFC por mililitro cada 24 horas, con un aumento acumulativo de la diseminación bacteriana observado durante cada día. En el lavado broncoalveolar recolectado de ratones infectados, los neutrófilos son ampliamente reclutados, con el recuento diferencial de células que demuestra una población de células inmunitarias infiltrantes del 90 por ciento de neutrófilos y 10 por ciento de linfocitos macrófagos.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis del lavado broncoalveolar, para responder preguntas adicionales sobre la caracterización de la respuesta inflamatoria. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir una colonización de Pseudomonas. No olvide que trabajar con Candida luminiscente puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de protección para evitar la contaminación por gotas, al realizar este procedimiento.