Name: Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer iPSCs genereren uit humane perifere T-cellen met Sendai-virus in feeder-vrije condities. Deze methode vermindert pathogeniciteit en biedt veilige toepassingen in regeneratieve geneeskunde en ziekte-modellering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi en Rei Ohno van de Keio University School of Medicine voor technische ondersteuning. Dit werk werd deels gefinancierd door een R &amp; D Systems programma ter ondersteuning van het praktische gebruik van de gezondheid van onderzoeksresultaten te versnellen, en de snelweg programma voor de realisatie van de regeneratieve geneeskunde.

1. Bereid geactiveerde menselijke T-cellen <ol><li> Verzamel 10 ml gehepariniseerd volbloed dat bij een donor door venapunctie. <ol><li> Verkrijgen geïnformeerde toestemming van donoren van tevoren venapunctie. Venapunctie moet worden uitgevoerd door gekwalificeerd en opgeleid personeel. </li><li> Handvat verkregen bloedmonsters met steriele apparatuur en na een passende bioveiligheid richtlijnen. </li></ol></li><li> Verdun 10 ml gehepariniseerd volbloed met 10 ml D-PBS (-). </li><li> Put 15 ml Ficoll-oplossing (Ficoll-Paque PREMIUM) in een nieuwe 50-ml conische buis. </li><li> Laag het 20-ml bloed bereid in stap 1.2 op de Ficoll-oplossing in stap 1,3. Met behulp van een elektrische pipet, laat bloed bereid in stap 1.2 run langzaam langs de binnenwand van de buis. Wees niet naar de bloed-oplossing en Ficoll- oplossing te mengen. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Stel de centrifugale vertraging snelheid &quot;langzaam&quot;. Let op: Na het centrifugeren, een witte dunnelaagje ontstaat tussen een bovenste melkachtig plasma laag en een minder duidelijke Ficoll laag. Deze witte dunne laag bevat mononucleaire cellen. </li><li> Breng de laag eenkernige cellen in nieuw 50-ml conische buis met een pipet 1 ml. Wees voorzichtig Ficoll oplossing niet op te nemen. </li><li> Voeg D-PBS (-) aan de mononucleaire cellen tot een totaal volume van 10 ml en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant. Voeg 10 ml D-PBS (-) aan de mononucleaire cellen en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant, voeg 1 ml medium KBM502 de verzamelde mononucleaire cellen en telling van de cellen met een hemocytometer. Meer dan 5 x 10 6 mononucleaire cellen kunnen worden verkregen uit 10 ml gehepariniseerd volbloed met behulp van Ficoll passende scheiding. </li><li> Bereid een anti-humaan CD3-antilichaam oplossing met een concentratie van 10 ug / ml in D-PBS (-). Voeg anti-humaan CD3-antilichaam oplossing voor een 6-wells plaat, geniet de brandingace van elk putje en incubeer de schaal bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende ten minste 30 min. </li><li> Verwijder het anti-humaan CD3-antilichaam oplossing uit elk putje en eenmaal wassen met D-PBS (-) net voor de cellen te zaaien. </li><li> Seed mononucleaire cellen die werden bereid in Stap 1,9 bij een dichtheid van 2,5 x 10 5 cellen / cm2 op het anti-humaan CD3-antilichaam beklede 6-putjesplaten in KBM502 medium. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator gedurende 3-7 dagen zonder mediumverversing tot de T-cellen confluentie bereiken. T-cellen in deze periode zijn beide geschorst en hechtende cellen. </li></ol> 2. Infect menselijke T-cellen met SeV Vectoren <ol><li> Na 3-7 dagen cultuur, het verzamelen van de geactiveerde T-cellen met bestaande medium door pipetteren. Overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 1 ml vers KBM502 medium. Tel de cellen en de plaat 1.5 x 10 6 cellen (in 2 ml vers medium KBM502) in elk putje van een anti-CD3-antilichaam beklede 6-wells plaat. </li><li> Ontdooi de SeV oplossingen van Oct3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF, en c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF op ijs. </li><li> Voeg de SeV oplossingen die Oct3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF en c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF afzonderlijk aan de putjes, elk bij een multipliciteit van infectie (MOI) 10. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator voor een verdere 24 uur. </li></ol> 3. Verwijder SeV vectoren van menselijke T-cellen <ol><li> 24 uur na infectie, het verzamelen van de geïnfecteerde cellen met een pipet. Als er hechtende cellen, kunnen ze gemakkelijk worden losgemaakt ze herhaaldelijk pipetteren en neer. Overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof met de SeV vectoren en voeg 2 ml vers KBM502 medium. Replate cellen in each van de putjes. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator gedurende nog 24 uur. </li></ol> 4. reseed Cellen op een Matrigel Layer <ol><li> Bereid basaalmembraan matrix oplossing ontdooien matrix gel (zie de lijst Materialen voor het specifieke merk in deze studie) bij 4 ° C en oplossen van 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12 medium. Opmerking: Matrix gel (zie de lijst Materialen voor het specifieke merk gebruikt in deze studie) moet ontdooien O / N bij 4 ° C volledig worden ontdooid. Houd het op ijs tot vlak voor gebruik. </li><li> Plate 5 ml basaalmembraan matrix oplossing per plaat in 100-mm schalen en laat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min voor het zaaien cellen. Tenminste twee 100-mm schalen zijn nodig voor een experiment. </li><li> Verzamel SeV-geïnfecteerde cellen door pipetteren, overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 1 ml vers KBM502 medium. Tel het aantal ceLLS met behulp van een hemocytometer, verwijder het basaal membraan matrix-oplossing van 100-mm gerechten bereid in stap 4.2 en plaat 1 x 10 5 en 1 x 10 6 cellen (in 10 ml vers mTeSR gemiddeld) op een 100-mm basaal membraan matrix-gecoat gerechten. Tot slot, gebruik maken van de plaat waarin kolonies gemakkelijk worden geplukt. </li><li> Incubeer de schotel bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator O / N. </li><li> Verander het medium tot 10 ml vlees mTeSR medium elke andere dag. Opmerking: Ongeveer 20-30 dagen na infectie kolonies die sterk embryonale stamcellen (SER) weergegeven. </li></ol> 5. Vouw T-cel afgeleid iPSCs <ol><li> Bereid basaalmembraan matrix oplossing ontdooien matrix gel (zie de lijst Materialen voor het specifieke merk in deze studie) bij 4 ° C en oplossen van 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12 medium. </li><li> Plaat 1 ml van de basaalmembraan matrix oplossing per putje in een 6-wells plaat en laat bij kamertemperatuur gedurendetenminste 30 min alvorens ze kolonies. </li><li> Vul een 96-wells plaat met 20 ul mTeSR medium per putje. </li><li> Selecteer kolonies die SER onder de stereomicroscoop met een pipet 20 ul lijken. Opmerking: De kolonies van de SER en iPSCs zijn rond en plat, zoals weergegeven in figuur 1B. </li><li> Transfer geselecteerde kolonies in de 96-well plaat gevuld met mTeSR medium in stap 5,3. </li><li> Voeg 200 ul mTeSR medium aan elk putje en zorgvuldig pipet op en neer om de kolonie breken in kleine klontjes onder de stereomicroscoop met een pipet 200 ul. Verwijder de basaalmembraan matrix oplossing uit de goed bereid in 5,2 en zet elke kolonie in een putje van de basaalmembraan matrix beklede 6-wells plaat met 2 ml mTeSR medium per putje. </li><li> Verander de middellange tot 2 ml vlees mTeSR medium elke andere dag. </li></ol> 6. Zorg voor T-cel afgeleid iPSCs De T-cel afgeleide iPSCs kan worden gehandhaafden opgeslagen met behulp van dezelfde technieken als voor menselijke iPSCs en menselijke SER. Zodra iPSC kolonies groeien, uit te breiden hen in grotere gerechten door het herhalen van dezelfde procedure. <ol><li> Wijzig de mTeSR medium om de 1-2 dagen. </li><li> Wanneer de kolonies confluent elke 5-7 dagen, passage van de cellen met behulp dissociatie oplossing voor menselijke iPSCs en menselijke SER&#39;s volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Hayes, M., Zavazava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+generate+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategies to generate induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).</li>
<li>Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+making+induced+pluripotent+stem+cells%3A+reprogramming+a+la+carte%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte.</a> Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Sampsell-Barron, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+adaptation+and+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Minegishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+optineurin+E50K-TBK1+interaction+evokes+protein+insolubility+and+initiates+familial+primary+open-angle+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma.</a> Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).</li>
<li>Tanaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+induces+myofibrillar+disarray+and+contractile+vector+variability+in+hypertrophic+cardiomyopathy-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Am Heart Assoc. 3, e001263(2014).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Kishino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+peripheral+T+cells+in+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions.</a> PLoS One. 9, e97397(2014).</li>
<li>Masaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus-mediated+gene+transfer+to+vasculature%3A+a+new+class+of+efficient+gene+transfer+vector+to+the+vascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system.</a> FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus-mediated+gene+transfer+into+adult+rat+retinal+tissue%3A+efficient+gene+transfer+by+brief+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure.</a> Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Iida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+vector%3A+vector+development+and+its+application+to+health+care+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Uirusu%22%5BJournal%5D)">Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology.</a> Uirusu. 57, 29-36 (2007).</li>
<li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+repopulation+of+cytoplasmically+gene+transferred+hematopoietic+cells+by+temperature-sensitive+mutant+of+recombinant+Sendai+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector.</a> Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).</li>
<li>Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+vectors+as+an+emerging+negative-strand+RNA+viral+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system.</a> J Gene Med. 5, 543-553 (2003).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).</li>
<li>Okano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus+vectors+for+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes.</a> Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).</li>
<li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Proteom+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).</li>
<li>Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+Using+Episomal+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors.</a> Methods Mol Biol. , (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende of tegenstrijdige belangen te onthullen.

We beschrijven een protocol voor het genereren van iPSC's uit humane perifere T-cellen in serum-vrije en feeder-vrije omstandigheden met behulp van een combinatie van matrigel, mTeSR medium en SeV-vectoren. Voor klinische toepassingen van iPSC's is het belangrijk om een protocol te hebben voor het stabiel genereren van iPSC's en een minder invasieve methode voor celbemonstering. Hoewel het genereren van iPSC's met de combinatie van matrigel en mTeSR medium een lagere herprogrammeringsefficiëntie vertoonde dan met knockout serum replacement (KSR) medium en feeder-cellen, bereikt deze combinatie een stabiele generatie van iPSC's uit donoren16. Stabiele iPSC-generatie en minder invasieve celbemonstering heeft het voordeel dat het aantal donoren voor iPSC-generatie kan worden verhoogd.
SeV-vectoren, een minus-streng RNA-virus, worden niet geïntegreerd in het gastheergenoom. Daarom kunnen de risico's van tumorigenesis worden vermeden in de fase van herprogrammeringsfactorinductie20-24. Bovendien maken de feeder-vrije omstandigheden, die gebruikmaken van een combinatie van gedefinieerd kweekmedium en matrigel in plaats van een feederlaag, het mogelijk om de potentiële risico's van blootstelling aan onbekende exogene factoren te minimaliseren. De fusie van deze technieken biedt een minder invasieve en veiligere iPSC-technologie voor regeneratieve geneeskunde16.
Belangrijke stappen in dit protocol zijn het activeren van humane T-cellen (Stap 1) en het infecteren van deze cellen met SeV-vectoren (Stap 2). Wanneer er geen ESC-achtige kolonie wordt verkregen in het kweekbakje op een optimaal tijdstip na SeV-infectie, moet het volgende worden overwogen. Ten eerste kan de confluency van de mononucleaire cellen vóór T-celactivatie niet geschikt zijn omdat optimale activering van T-cellen cruciaal is voor SeV-infectie25,26. Een te hoge dichtheid van mononucleaire cellen leidt tot celdood, wat de juiste activering van T-cellen verstoort. Een te lage dichtheid van mononucleaire cellen verstoort ook de juiste activering en proliferatie van T-cellen. Daarom moet de confluency van mononucleaire cellen worden gecontroleerd en dienovereenkomstig worden aangepast. Ten tweede kan de dosis SeV-vectoren mogelijk niet voldoende zijn. De inductie-efficiëntie van iPSC-kolonies hangt af van de dosis van het virus6. Als er geen ESC-achtige kolonie wordt waargenomen na SeV-infectie, moet de optie van het verhogen van de virusdosis tot een MOI van 15-20 worden overwogen. Als er tekenen van iPSC-koloniedifferentiatie worden waargenomen, kan de frequentie waarmee het medium wordt ververst worden verhoogd tot om de dag, of tot elke dag wanneer de kolonies groter zijn.
De beperking in dit protocol bestaat erin dat deze methode niet volledig viraal vrij is. Hoewel SeV voor celherprogrammering gemakkelijk commercieel verkrijgbaar is, moeten gebruikers apparatuur voorbereiden volgens het juiste bioveiligheidsniveau. Als een andere methode voor het genereren van integratievrije iPSC's zijn gebruikt tot nu toe episomale vectoren27-29. Hoewel episomale vectoren kunnen worden gebruikt met apparatuur met een lager bioveiligheidsniveau, kunnen episomale vectoren zich met extreem lage snelheid in het gastheergenoom invoegen. Daarom zijn aanvullende controles vereist om de verdwijning van transgenen te bevestigen, net als bij gebruik van SeV.
Er is nog een beperking in dat deze techniek niet absoluut vrij is van producten van dierlijke oorsprong. Sommige substraten, zoals matrigel, anti-CD3 mAb, dissociatieoplossing en SeV-oplossing zijn afgeleid van dierlijke producten en zijn daarom geassocieerd met een risico op overdracht van xenogene pathogeen. Echter, de vermindering van dierlijke substraten in het kweeksysteem is betekenisvol voor de klinische toepassing van iPSC-technologie vanwege het lagere risico.

iPSCs hebben aanzienlijke aandacht getrokken als een baanbrekende bron van cellen voor regeneratieve geneeskunde 1-3. Tot op heden hebben diverse werkwijzen voor het genereren iPSCs gemeld 4,5. Hiervan iPSCs gegenereerd uit humane T-cellen zijn van bijzonder belang vanwege de minder invasieve methode van celbemonstering 6-8. Bovendien iPSCs afgeleid van T-cellen bevatten herrangschikkingen van het T cel receptor (TCR) genen en derhalve een bron van antigen specifieke T-cellen 9,10. Daarom is het genereren van T-cel afgeleid iPSCs veilig is nuttig voor vordert regeneratieve geneeskunde. Deze methode is gebaseerd op het concept van het risico van onvoorspelbare pathogeniciteit. Voor een veilige klinische toepassing van iPSCs is het belangrijk om het risico op blootstelling aan pathogenen 11. Eerder in verschillende kweeksystemen van pluripotente stamcellen hebben foetaal runderserum en voedingscellen gebruikt essentieel reagenss 12. Het wegnemen van beide reagentia uit het kweeksysteem voorkeur dat iPSC genereren om het risico op onvoorspelbare pathogeniciteit verminderen. Bovendien heeft deze werkwijze het voordeel dat invasieve celbemonstering van patiënten en moeizame bereiding van voedingscellen. Omdat T cel afgeleid iPSCs reeds met succes toegepast bij ziekteonderzoek 13,14, deze werkwijze is ook toepasbaar en nuttig voor het genereren van ziektespecifieke iPSCs van patiënten. Onder T cel herprogrammering werkwijzen, met het Sendai-virus (SeV) vector een gen voertuig een methode die iPSCs kan genereren met een hoog rendement 7,16. Bovendien, omdat SeV is een enkelstrengs RNA-virus en geen DNA fase nodig voor replicatie, zijn gebruik in iPSC generatie voorkomt het breken van het gastheergenoom 17-19. Daarom hebben we vastgesteld protocollen voor het genereren iPSCs van humane perifere T-cellen in serum-free en voedingsvrije met gebruikmaking van een combinatie van Matrigel, mTeSR medium en SeV vectoren.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd NA/LE muis anti-menselijk CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>555336</td><td></td></tr><tr><td>Bovine albumine fractie V oplossing</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>STEM CELL</td><td>5850</td><td>Verwarm op kamertemperatuur voor gebruik</td></tr><tr><td>Dissociatieoplossing</td><td>ReproCELL</td><td>RCHETP002</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(&ndash;)</td><td>Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0</td><td>DNAVEC</td><td>DV-0303c</td><td>Ontdooi op ijs voor gebruik</td></tr><tr><td>100-mm weefselkweekschaal</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96-well weefselkweekplaat</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>6-well weefselkweekplaat</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>15&#160;ml Centrifugeerbuis</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50&#160;ml Centrifugeerbuis</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere t-cellen met behulp van sendai virus in feeder gratis voorwaarden

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Onlangs hebben iPSCs aandacht getrokken als een nieuwe bron van cellen voor regeneratieve therapieën. Hoewel de eerste werkwijze voor het iPSCs aangevoerde huidfibroblasten verkregen door invasieve biopsie en retrovirale genoom inbrengen van transgenen zijn er veel pogingen om deze nadelen te vermijden zijn. Humane perifere T-cellen zijn een unieke cel bron voor het genereren van iPSCs. iPSCs afgeleid van T-cellen bevatten herrangschikkingen van het T cel receptor (TCR) genen en zijn een bron van antigen specifieke T-cellen. Daarnaast T-celreceptor omlegging in het genoom heeft het potentieel om afzonderlijke cellijnen label en onderscheid maken tussen getransplanteerde en donorcellen. Voor een veilige klinische toepassing van iPSCs, is het belangrijk om het risico van blootstelling van nieuw gegenereerde iPSCs aan schadelijke agentia minimaliseren. Hoewel foetaal runderserum en voedingscellen essentieel voor pluripotente stamcellen celkweek zijn, verdient het de voorkeur om ze van het kweeksysteem te verwijderen om het risico te verminderenonvoorspelbare pathogeniciteit. Om dit aan te pakken, hebben we een protocol opgesteld voor het genereren iPSCs uit humane perifere T-cellen middels Sendai virus het risico van blootstelling iPSCs op undefined ziekteverwekkers te verminderen. Hoewel de behandeling van Sendai-virus vereist apparatuur met de juiste bioveiligheid niveau Sendai virus infecteert geactiveerde T-cellen zonder genoom inbrengen, maar met een hoog rendement. In dit protocol tonen we het genereren van iPSCs uit humane perifere T-cellen in voedingsvrije met gebruikmaking van een combinatie van geactiveerde T-celkweek en Sendai virus.

<html> Met behulp van dit protocol, kunnen gebruikers iPSCs uit menselijke perifere T-cellen stabiel te genereren. iPSC opwekking van T-cellen met SeV en matrigel vertoonden ongeveer 0,002% -. 0,005% rendement cel herprogrammering tussen verschillende donoren zaken en SeV werden niet gedetecteerd na een aantal passages 16 Figuur 1A toont een schema van het protocol voor het genereren van T cel-afgeleide iPSCs in feeder-vrije omstandigheden met behulp matrigel en mTeSR medium. Ongeveer 20-30 dagen na infectie met SeV worden iPSC kolonies te herkennen aan hun ESC kolonie-achtige morfologie (Figuur 1B). Immunofluorescentiekleuring onthulde uiting van typische pluripotente cel markers (NANOG, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, en TRA-1-81) in T-cel afgeleid iPSCs gegenereerd onder-feeder vrije omstandigheden (figuur 1C). &quot;Width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figuur 1. (A): Een schema van het protocol voor herprogrammering T cellen onder voedingsvrije omstandigheden in deze studie. (B): Een normale ESC-achtige iPSC kolonie op dag 27 na bloedafname onder feeder vrije omstandigheden. (C): ALP kleuring en immunofluorescentiekleuring voor pluripotentie en oppervlakte markers (NANOG, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, en TRA-1-81) in T-cel afgeleid iPSCs gegenereerd onder-feeder-vrije omstandigheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53225/53225fig1highres.jpg" target="_blank">Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden door gebruik te maken van een combinatie van matrigel en Sendai-virusvectoren die reprogrammeringsfactoren bevatten.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen of IPC's uit humane perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van regeneratieve geneeskunde, waaronder hoe IPS-cellen kunnen worden toegepast in klinisch gebruik. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat IPS-cellen kunnen worden gekweekt zonder de inclusie van mogelijke schadelijke factoren, wat het risico op pathogeniteit vermindert.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot klinisch relevante therapieën op basis van IPS-cellen, vanwege deze niet-invasieve celbemonstering in combinatie met het verminderde risico op blootstelling van de ontwikkelende IPS-cellen aan niet-gedefinieerde pathogenen. Deze methode kan dus inzicht bieden in klinische therapieën met IPS-cellen. Het kan ook worden toegepast op andere gebieden, zoals het modelleren van ziektecondities.Begin met het prepareren van geactiveerde humane T-cellen door 10 milliliters gehepariniseerd volbloed te verdunnen met 10 milliliters DPBS via een pipet. Breng 15 milliliters fol-oplossing over in een conische buis van 50 milliliters. Pipetteer het verdunde bloed langzaam langs de binnenwand van de buis zodat het als een laag bovenop de oplossing komt te liggen.Zorg ervoor dat de interface niet wordt verstoord. Centrifugeer de buis 30 minuten lang bij 400 ×g op kamertemperatuur. Observeer na centrifugatie drie lagen, bestaande uit een onderste heldere laag, een dunne witte laag met mononucleaire cellen en een bovenste melkachtige plasmalaag.Breng de mononucleaire cellaag over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter zonder enige oplossing uit het scheidingsgat over te brengen. Voeg vervolgens DPBS toe om het totale volume aan te vullen tot 10 milliliters. Centrifugeer de buis 5 minuten bij 200 ×g bij kamertemperatuur.Verwijder het supernatant, was de cellen met 10 milliliters DPBS, centrifugeer de buis bij 200 ×g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens één milliliter KBM 5 0 2 medium toe aan de cellen en tel deze met een hemocytometer. Om de kweekschaal voor te bereiden, worden de wells van een six well plate gecoat met 10 µg/mL anti-human CD3 antilichaamoplossing in PBS. Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 30 minuten.Verwijder na incubatie de antilichaamoplossing uit de plaat en was één keer met PBS. Zaai de mononucleaire cellen uit met een dichtheid van 2,5 × 10⁵ cellen per square centimeter in een totaalvolume van 2 mL KBM 502-medium in de gecoate six-well platen. Incubeer de cellen gedurende drie tot zeven dagen zonder het medium te verversen, waarna de T-cellen confluentie zouden moeten bereiken. Transfer na deze drie tot zeven dagen de geactiveerde T-cellen samen met het medium naar een 15 mL conische buis en centrifugeer bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en voeg 1 mL vers KBM 502-medium toe.Tel de cellen en zaai 1,5 × 10⁶ cellen in 2 mL KBM 5 0 2 medium in elke well van een met anti-CD3-antilichaam gecoate six-well plate. Ontdooi vervolgens de OC3-SOX2, KLF4, c-MYC en L-Sendai-virusoplossingen op ijs. Voeg elk gemanipuleerd Sendai-virus individueel toe aan elke well met een multiplicity of infection van 10. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Verzamel daarna de geïnfecteerde cellen met een pipet en breng deze over naar een conische buis van 15 mL.Centrifugeer de cellen bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en voeg twee milliliters vers KBM 5 0 2-medium toe. Plaats de cellen terug in de wells van een six-well plaat en incubeer deze gedurende 24 uur in een celkweekincubator.Om de cellen uit te zaaien, ontdooi eerst de basementmembraanmatrix-oplossing gedurende één nacht bij 4 °C. Los 0,2 ml van de ontdooide oplossing op in 10 ml DMEM/F12-medium en breng 5 ml van de basementmembraanmatrix-oplossing aan in 100 mm petrischalen. Laat de schalen ten minste 30 minuten op kamertemperatuur staan, zodat de matrix de schaal kan coaten voordat de cellen worden uitgezaaid. Verzamel ondertussen de met SAI-virus geïnfecteerde T-cellen in een 15 ml conische buis en centrifugeer deze 5 minuten bij 200 ×g.Resuspendeer vervolgens de pellet in één milliliter vers KBM 5 0 2-medium en tel de cellen met een hemocytometer na de incubatieperiode van 30 minuten. Verwijder de basement membrane matrix-oplossing uit de twee platen en resuspendeer vervolgens apart 1 x 10⁵ cellen en 1 x 10⁶ cellen in 10 milliliter vers M-T-E-S-R-medium, een feeder-celvrij kweekmedium voor ipsc. Pipetteer elke celsuspensie op een aparte 100 millimeter plaat.Incubeer de plaat in een celkweekincubator. Vervang het medium om de dag na 20 tot 30 dagen. Er zouden kolonies moeten verschijnen die lijken op embryonale stamcelkolonies.Bereid zes wandplaten voor voor de expansie van IPSC's door één milliliter basementmembraanmatrix-oplossing in elke well gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Bekijk ondertussen de kweekplaten met IPSC-koloniën onder een stereomicroscoop en isoleer individuele koloniën door deze af te krabben met een 20 microliter pipette. Transfer elke kolonie naar een well in een 96-wandsplaat die 20 microliters M-T-E-S-R-medium bevat.Voeg na het overbrengen van de kolonies 200 µL M-T-E-S-R-medium toe aan elke put en pipetteer dit op en neer om de kolonie te verbreken. Nadat de basement membrane matrix-oplossing uit de zesputjesplaten is verwijderd, worden cellen van een individuele kolonie naar elke put overgebracht; voeg vervolgens 2 mL M-T-E-S-R-medium toe, incubeer de cellen in een celkweekincubator en ververs het medium om de dag met gebruik van feeder-vrije kweek en serumvrije media. De iPSC's werden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen. Immunofluorescente kleuring onthulde expressie van typische pluripotente celmarkers, waaronder NanoS3, Oct4, SSEA4, TRA-1-60 en TRA-1-81.In deze afgeleide IPSE-lijnen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle stappen uit te voeren met inachtneming van alle belangrijke overwegingen met betrekking tot steriliteit en biologische veiligheid.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-peripheral-t

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Het doel van dit protocol is om het protocol te laten zien voor het herprogrammeren van in melanoom geïnfiltreerde tumorlymfocyten in geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Dit artikel beschrijft een procedure om iTenocyten te produceren door iPSC-afgeleide mesenchymale stromale cellen te genereren met gecombineerde overexpressie van Scleraxis met behulp van een lentivirale vector en uniaxiale rek via een 2D-bioreactor.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide iTenocyten via gecombineerde scleraxis-overexpressie en 2D uniaxiale spanning

Leer iPSCs genereren uit humane perifere T-cellen met Sendai-virus in feeder-vrije condities. Deze methode vermindert pathogeniciteit en biedt veilige toepassingen in regeneratieve geneeskunde en ziekte-modellering.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden (Video) | JoVE Journal

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Meer video's verkennen