Name: Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende a medir el metabolismo de herbicidas en malezas dicotiledóneas mediante un ensayo de hojas extirpadas. Este método reduce la variabilidad y permite analizar tasas precisas de metabolismo usando cromatografía líquida de alta resolución.

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Agradecemos a Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley y Brittany Janney por su ayuda con el crecimiento y las extracciones de las plantas, al Dr. Anatoli Lygin por su ayuda con los análisis cromatográficos y a Syngenta Crop Protection por su financiación.

1. Material Vegetal, condiciones de crecimiento, y vegetativo Clonación Nota: Tres poblaciones rudis fueron investigados en esta investigación: MCR (del condado de McLean, IL), ACR (de Adams County, IL), y WCS (de Wayne County, IL) (Tabla 1). <ol><li> Recoger y suspender semillas rudis en 0,1 g de agar L -1: solución de agua a 4 ° C durante al menos 30 días para mejorar la germinación. Nota: Algunas poblaciones rudis están latentes, pero este paso ayuda a superar la latencia y hacer germinar la semilla de manera más uniforme. </li><li> Germinar semillas de cada población rudis (como en la Tabla 1) en 12 x 12 cm bandejas que contienen un medio para macetas en el invernadero. <ol><li> Mantener condiciones de invernadero a 28/22 ° C temperatura día / noche en un fotoperiodo de 16/8 h 12. </li><li> Suplemento luz natural en el invernadero con la luz de las lámparas de haluro de mercurio para proporcionar un mínimo de 500 mol m -2 </sup&gt; flujo seg -1 fotones a nivel del dosel vegetal. </li></ol></li><li> Trasplante surgió plántulas cuando son 2 cm de altura en 80 cm 3 ollas en el invernadero. </li><li> Trasplantar las plántulas en 950 cm 3 ollas que contienen una mezcla 3: 1 de mezcla para macetas:: 1: 1 de suelo: turba: arena cuando las plántulas son de 4 cm de altura. Añadir 5 g de gránulos de fertilizante de liberación lenta a cada maceta y mezclar con esta mezcla de suelo. </li><li> Corte y retire el meristemo apical contiene las tres hojas más jóvenes a partir de 7 cm plantas altas para eliminar la dominancia apical. Nota: Este paso asegura que cada planta crecerá suficientes brotes axilares 3 cm de clonar. </li><li> Impuestos Especiales cinco brotes axilares (3 cm de longitud) cuando las plántulas son unos 14 cm de altura de cada población rudis (como en la Tabla 1). Eliminar la mayoría de las hojas de estos brotes axilares para disminuir la pérdida de agua a su posterior manipulación, pero conservan las dos hojas más jóvenes para permitir un mayor crecimiento en el trasplante. <br/&gt; Nota: Maneje con cuidado y tratar de no dañar los brotes cuando retire las hojas. Etiqueta de cada planta con una estaca. </li><li> Axilar Transplant dispara en 80 cm 3 macetas (una plántula por maceta) en medio de la maceta, que es el mismo medio usado para la germinación. Medio de la maceta debe ser saturada inicialmente hasta que se formen raíces en la cámara de crecimiento, a continuación, mantener constantes de humedad y colocar macetas en la cámara de crecimiento durante 7 días para establecer raíces. Nota: Las plantas son muy sensibles en este punto y no hay que destacar. <ol><li> Mantener las condiciones de cámara de crecimiento a 28/22 ° C temperatura día / noche en un fotoperiodo de 16/8 h 12. </li><li> Una combinación de las bombillas incandescentes y fluorescentes puede ser utilizado para proporcionar luz en la cámara de crecimiento y debe entregar al menos 550 mol m -2 s -1 flujo de fotones a nivel de copa de la planta 12. </li></ol></li><li> Trasplante de nuevo en 950 cm 3 macetas (una plántula por maceta) containing una mezcla 3: 1 de mezcla para macetas:: 1: 1 de suelo: la turba: arena (también incluirá 5 g de liberación lenta gránulos de fertilizante) cuando las plantas clonadas son 4 cm de altura, a continuación, transferir de nuevo al invernadero. </li><li> Clonar las plantas segunda vez utilizando el mismo método descrito anteriormente (es decir, repita los pasos 1,5 a 1,8, y luego vaya al paso 2.1). Para un estudio de tiempo-curso típico, generar clones de al menos seis plantas independientes de cada población rudis y grabarlos como líneas MCR 1-6, 1-6 y ACR WCS 1-6. <ol><li> Establecer al menos seis distintas &quot;padres&quot; líneas clonales con el fin de repetir el experimento y adecuadamente representar la variabilidad genética dentro de cada población rudis. </li><li> Dependiendo del número de puntos de tiempo se analizará, generar suficientes sub-clones de cada línea clonal &quot;padre&quot; para llevar a cabo un estudio del curso del tiempo. </li></ol></li></ol> 2. La realización de un estudio del metabolismo con extirpados WaterhemHojas p <ol><li> Extirpar las terceras más jóvenes hojas (de 2 a 3 cm de longitud; incluir 0,5 cm de peciolo adjunta) cuando las plantas rudis clonados son de 10 a 12 cm de altura para el metabolismo de los herbicidas y DT 50 análisis. </li><li> Pecíolos Cortar la hoja de cada planta rudis por segunda vez (asegurando que 0,3 cm de pecíolo permanece) bajo el agua, y colocar estos extremos cortados en 1,5 ml viales de plástico (una hoja por vial) 15. Nota: Cortar una segunda vez bajo el agua evita que las burbujas de aire que se formen y tapar los vasos del xilema. <ol><li> En primer lugar, sumerja parcialmente hojas cortadas con el corte del peciolo en tampón de pre-incubación (200 l) de 0,1 M Tris-HCl (pH 6) durante 1 hora. </li><li> En segundo lugar, mover cada hoja a un nuevo 1,5 ml vial que contiene un tampón de incubación (200 l) de 0,1 M Tris-HCl (pH 6), además de 150 mM [14 URL- C] herbicida, y se incuba a 28 ° C durante 1 hr a permitir la absorción del herbicida en las hojas. Nota: Tanto la 14 C-mesotriona y <shasta&gt; 14 C-primisulfuron-metilo se utiliza en nuestros estudios en las actividades específicas de aproximadamente 20 mCi mmol -1. Tanto la difusión y la absorción a través de la corriente de transpiración xilema contribuyen a la cantidad de herbicida tomado por hoja. Nota: El efecto de los inhibidores metabólicos sobre el metabolismo de los herbicidas se puede determinar mediante la modificación de los pasos 2.2.1 y 2.2.2 anteriormente. Añadir 100 mM del inhibidor a la memoria intermedia pre-incubación y dejar incubar durante 2 hr, luego se transfieren a tampón de incubación con el herbicida y otra vez Añadir 100 mM inhibidor. Por ejemplo, malatión y tetcyclacis inhiben ciertas actividades del citocromo P450 en plantas 15-17. </li><li> Lave la parte sumergida de hojas cortadas con agua desionizada y transferir hojas cortadas a un cuarto de la fuerza de Murashige y Skoog (MS) solución de sales (500 l) durante 0 horas, 5 horas, 11 horas, 23 horas o 35 horas, respectivamente, en la cámara de crecimiento para el estudio del metabolismo curso temporal. </li></ol></li><li> Cosecha quitando la licencias de la solución de incubación en el punto de tiempo apropiado y moler manualmente cada tejido de la hoja en nitrógeno líquido usando un tubo de polipropileno (15 ml) y una maja de vidrio. </li><li> Extraer herbicida radiomarcado y sus metabolitos a partir de cada hoja con 7 ml de 90% de acetona con un homogeneizador de tejidos de laboratorio en el mismo tubo de polipropileno como anteriormente. Enjuague homogeneizador de tejidos con un adicional de 7 ml de 90% de acetona, y continuar para homogeneizar hasta que el tejido se pulveriza a fondo (generalmente alrededor de 2 min). Nota: 90% de acetona se puede utilizar para la extracción de la mayoría de los herbicidas de los tejidos vegetales. Sin embargo, si este método es incapaz de extraer más de 90% de los compuestos radiomarcados absorbidos, a continuación, 90% de metanol o acetonitrilo al 90% pueden estar sustituidos como el disolvente de extracción. </li><li> Label 90% extractos de acetona (14 ml en total) y se almacena a 4 ° C durante 16 horas para permitir que se produzca la extracción adicional. Nota: Después de esta extracción de hojas tratadas, la cantidad de rad extraíbleioactivity es típicamente al menos 98% de compuestos radiomarcados absorbidos por la hoja tratada. Radiactividad no extraíble (residuos ligados) en las hojas cortadas en promedio sólo el 0,3% en todos los puntos de tiempo en nuestro estudio anterior 12, pero esta cantidad puede variar de acuerdo con el herbicida utilizado y el punto de tiempo examinado. </li><li> Se obtuvieron muestras de centrifugar a 5000 xg durante 10 min y el concentrado de sobrenadantes a 40 ° C con un evaporador giratorio hasta un volumen final de 0,5 ml. Transferencia este volumen a un tubo de plástico 2,0 ml. </li><li> Añadir acetonitrilo: agua (1: 1, en volumen) para ajustar el volumen final de la planta extrae a 1,25 ml y volver a centrifugar a 10.000 xg durante 10 minutos para eliminar cualquier partícula. </li><li> Medir la radioactividad total en una alícuota tomada de cada muestra (dpm l -1) por espectroscopía de centelleo líquido (LSS) 12 y normalizar cantidades de [14 C-etiquetados] compuestos inyectados para el análisis HPLC (por ejemplo, 10,000 total dpm / muestra / run) para y-ejes será uniforme entre las muestras al graficar los resultados. </li></ol> 3. Análisis de HPLC Herbicida Metabolismo en hojas extirpados Nota: Resolver total de radiactividad extraíble en herbicidas padres y herbicidas metabolitos utilizando las siguientes condiciones de RP-HPLC 12. <ol><li> Realizar RP-HPLC con una columna C 18 (4,6 x 250 mm, 5 micras de tamaño de partícula para HPLC analítica) a una velocidad de flujo de 1 ml min -1 para la mayoría de los herbicidas no polares. Nota: columnas C 4 o C 12 de RP-HPLC también se pueden utilizar para optimizar la separación del herbicida padre de sus metabolitos. Un filtro de pre-columna y / o columna de seguridad también se pueden usar para proteger y prolongar la vida de la columna de RP. <ol><li> Utilice la siguiente fase móvil para RP-HPLC: Eluyente A, 0,1% de ácido fórmico (v / v) en agua, y Eluyente B acetonitrilo de grado HPLC 100%. Nota: metanol grado HPLC también se puede utilizar como Eluente B para la resolución de los compuestos más polares y metabolitos, pero tenga en cuenta que los tiempos de retención también pueden cambiar. Nota: El perfil de elución se utiliza para resolver mesotriona o primisulfuron-metil de sus metabolitos polares en nuestra investigación 12 es: Paso 1, A: B (4: 1, v / v) a A: B (3: 2, v / v ) en un gradiente lineal (12 min); Paso 2, A: B (3: 2, v / v) a A: B (3: 7, v / v) en un gradiente lineal (5 min); Paso 3, A: B (3: 7, v / v) a A: B (1: 9, v / v) en un gradiente lineal de 2 min (que comprende un total de 19 min). Nota: Los degradados y pasos isocráticas pueden necesitar ser ajustado en base a las propiedades físicas del material original con el fin de optimizar la resolución. </li><li> Siga los pasos gradiente lineal anteriores con A: B (1: 9, v / v) a A: B (4: 1, v / v) en un gradiente lineal (3 min) y A: B (4: 1, v / v) etapa isocrática (por lo menos durante 2 min) para volver a equilibrar la columna de la RP antes de inyectar la próxima extracto de 12. </li></ol></li><li> Detectar y visualizar compuestos radiomarcados con un Scinti Flowlación Analizador. Registrar la cantidad de herbicida matriz restante en cada muestra como un porcentaje de la radiactividad total en cada muestra (detectado y cuantificado por el flujo Analizador de Centelleo de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para determinar las tasas de metabolismo de los herbicidas en cada población rudis durante el curso del tiempo. </li></ol> 4. Procedimientos estadísticos <ol><li> Organizar tratamientos en un diseño completamente al azar (u otro dispositivo adecuado para el análisis estadístico). </li><li> Realice dos experimentos independientes con cada tratamiento, compuesto de tres réplicas biológicas para cada experimento. Los dos experimentos independientes incluyen seis repeticiones biológicos en total. Si el efecto experimento es no significativa (α = 0,05), combinar y analizar los datos de cada experimento independiente. Si el efecto experimento es significativo, luego analizar cada experimento separado. Nota: Incluir los primeros tres repeticiones biológica in Experimento 1 y los próximos tres repeticiones biológica en el Experimento 2. Cada réplica biológica representa un &quot;padre&quot; clara línea clonal derivada de cada población (MCR 1-6, 1-6 ACR, y WCS 1-6) para que cada tiempo- análisis curso utiliza plantas genéticamente idénticas. Los dos experimentos independientes incluyen seis repeticiones biológicos en total, lo que permite una adecuada representación de la variabilidad genética y la determinación de una mediana DT 50 para cada población rudis. </li><li> Analizar los datos con el análisis no lineal de mínimos cuadrados de regresión y ajuste con una curva de primer orden sencilla con el fin de estimar DT 50 s. La ecuación siguiente se describe el modelo: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> donde en este modelo y representa el porcentaje del herbicida matriz restante en el tiempo t, μ i es el DT 50 para cadarudis población i, y el parámetro C 0 es la cantidad estimada de padres herbicida presente en t = 0 12. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de hoja extirpada descrito en este documento se ha utilizado anteriormente en la investigación del metabolismo primisulfuron en hojas de maíz 15, pero nuestros resultados demuestran que este protocolo también es eficaz, preciso y reproducible para medir el metabolismo de los herbicidas en una especie de maleza dicotiledóneas 12. Una ventaja importante de la técnica de hoja extirpada en comparación con los estudios de la planta entera es que una hoja extirpada es independiente de los patro...

Resistencia a los herbicidas en las malezas presenta una seria amenaza para la producción mundial de alimentos y fibras 1,2. Actualmente, miles de poblaciones y biotipos resistentes de más de un centenar de especies de malas hierbas en todo el mundo se han documentado y estudiado 3. Un mecanismo importante que confiere resistencia a los herbicidas en las plantas es la alteración de los herbicidas genes y las proteínas diana del sitio, incluyendo mutaciones genéticas que afectan a la cinética de unión de la proteína herbicida o la amplificación del gen diana del sitio 2. Desintoxicación metabólica a través de actividades elevadas de monooxigenasa citocromo P450 (P450) o glutatión S transferasa (GST) enzimas es otro mecanismo que confiere resistencia a herbicidas en las malas hierbas, que es distinta de varias formas de mecanismos basados ​​target-site-2. Resistencia basada en metabólico tiene ramificaciones importantes para si los costos de acondicionamiento físico planta (también conocido como la aptitud sanciones) pueden ser el resultado de las mechanis herbicida de resistenciam, así como sobre la posibilidad de un único mecanismo de desintoxicación para conferir resistencia cruzada o múltiples herbicidas en las poblaciones de malezas 1,2,4. Generalmente, el metabolismo de los herbicidas en las plantas se puede dividir en tres fases distintas 5. Fase I implica la conversión herbicida o de activación, tales como hidroxilación mediada por P450 de anillos aromáticos o grupos alquilo, o por N - o reacciones de desalquilación O-, lo que aumenta la polaridad y herbicida parcial desintoxicación 5,6. De reciente introducción de grupos funcionales en la fase I pueden proporcionar sitios de enlace para la conjugación de glutatión reducido por GST o glucosa por glicosiltransferasas UDP-dependientes en la Fase II de 5,7. Por ejemplo, el principal metabolito inicial de primisulfuron-metil en el maíz es hidroxi-primisulfuron-metil 8, que puede ser metabolizado adicionalmente a hidroxi-primisulfuron-glucósido (Fase II) y luego transportado a la vacuola para el almacenamiento a largo plazo o más metabólica proprocesamiento 5,6 (Fase III). Rudis (Amaranthus tuberculatus) es una especie anual dicotiledóneas de difícil control de malezas que dificulta la producción de maíz (Zea mays), soja (Glycine max) y el algodón (Gossypium hirsutum) en los Estados Unidos. El alto grado de diversidad genética de rudis se ve facilitada por su biología dioica y de larga distancia polinización por el viento, y una sola planta rudis hembra puede producir hasta un millón de semillas 9. Estas semillas son pequeñas y de fácil propagación, lo que naturalmente dotar rudis con un mecanismo de dispersión efectiva. Rudis muestra germinación continua durante todo el ciclo de cultivo 9, y sus semillas son capaces de germinar después de varios años de inactividad. Rudis es una planta C 4 que posee una tasa de crecimiento superior a la mayoría de las malezas de hoja ancha en los sistemas de cultivo de cultivo 10. Además, numerosas poblaciones rudis son resistentes a múltiples families de herbicidas 3. Una población de rudis (designado MCR) de Illinois es resistente a la 4-hidroxi-fenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) herbicidas -inhibiting 11, tales como mesotriona, así como a la atrazina y la acetolactato sintasa (ALS) herbicidas inhibidores, incluyendo primisulfuron-metil , debido a los mecanismos no basados ​​en meta-sitio 12,13. Una población diferente de rudis designada ACR 14, que es primisulfuron-metil-resistente (debido a una mutación en el gen ALS) y la atrazina resistentes pero sensibles a la mesotriona, y una población rudis designado WCS 14 que es sensible a primisulfuron-metil, mesotriona y atrazina se utilizaron en comparación con MCR en nuestra investigación previa 12 y los experimentos actuales (resumen en la Tabla 1). Los estudios iniciales no detectaron alteraciones en la secuencia del gen HPPD o niveles de expresión, o reducción de la absorción mesotriona, en el MCRpoblación, en comparación con las poblaciones-mesotriona sensibles 12. Sin embargo, los estudios de metabolismo con plantas enteras demostraron niveles significativamente más bajos de herbicida mesotriona padres en MCR en comparación con el ACR y WCS, que se correlacionaban con las respuestas fenotípicas anteriores para mesotriona 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Rudis Población </td><td> Abreviatura </td><td> Fenotipo de Mesotriona </td><td> Mecanismo de resistencia mesotriona </td><td> Fenotipo de primisulfuron </td><td> Mecanismo de resistencia primisulfuron </td></tr><tr><td> McLean County-resistente </td><td> MCR </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo * </td><td> Resistente </td><td> Metabolismo </td></tr><tr><td> Adams County-resistente </td><td> ACR </td><td> Sensithe </td><td> - </td><td> Resistente </td><td> Mutación de destino de las instalaciones en la ELA 14 </td></tr><tr><td> Wayne County-Sensible </td><td> WCS </td><td> Sensible </td><td> - </td><td> Sensible </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Mecanismos de resistencia no-objetivo del sitio, excepto el metabolismo mejorado, también pueden conferir resistencia mesotriona en la población MCR 12. Tabla 1: Descripción de la población rudis de Illinois utilizados en este estudio. Además de determinar las tasas de metabolismo de los herbicidas en las plantas de semillero rudis intactas, un enfoque experimental diferente fue desarrollado y empleado en nuestra investigación anterior para investigar el metabolismo mediante el uso de un ensayo extirpado rudis hoja 12, así como diversos inhibidores de P450 (por ejemplo, tetcyclacis y malatión). Este método fue adaptado específicamente para rudis de un Previous investigación del metabolismo primisulfuron-metil en el maíz extirpado hojas 15, puesto que el ensayo de la hoja extirpada aún no había sido reportado para la realización de investigaciones metabolismo de los herbicidas en una planta dicotiledónea. El insecticida malatión organophophosate se ha utilizado con frecuencia para in vivo y en la investigación herbicida metabolismo vitro para indicar la participación P450 16. Por ejemplo, la tolerancia y el rápido metabolismo de mesotriona en el maíz se deben a la hidroxilación del anillo catalizado-P450, que se verifica cuando el malatión aumento de la sensibilidad de maíz a la mesotriona 17. Del mismo modo, el malatión inhibe el metabolismo del inhibidor primisulfuron-metil ALS en el maíz extirpado deja 15. Una ventaja importante de la técnica de hoja extirpada es que los datos generados son independientes de los patrones de translocación planta entera, un factor importante a considerar al evaluar el metabolismo de los herbicidas de postemergencia, sistémicas en las plantas. Por consiguiente, este método permite cuantitativa ymetabólica análisis cualitativos para centrarse en una sola hoja tratada 12. Una estrategia de clonación vegetativa, en combinación con el protocolo de hoja extirpada, se utilizó previamente en rudis para llevar a cabo estudios de metabolismo 12. Debido a la naturaleza cruzamiento de rudis (varón separado y plantas femeninas), y en gran medida de la diversidad genética dentro de las especies de Amaranthus dioicas 9, este protocolo garantiza que se analizaron las plántulas rudis genéticamente idénticos dentro de los experimentos de tiempo-por supuesto. Este artículo demuestra la utilidad del método de la hoja extirpada para medir las tasas de metabolismo de los herbicidas en una mala hierba dicotiledónea (rudis). La cantidad de herbicida matriz restante se determinó en cada punto de tiempo (Figura 1) por análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal, y se ajuste con una curva de primer orden sencillo con el fin de estimar el tiempo para 50% de herbicida absorbido para degradar ( DT 50). Representativocromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) se muestran para ALS-resistentes y poblaciones rudis -sensibles, que indican la desaparición de los herbicidas de los padres y la formación concomitante de metabolito polar (s) durante un estudio de evolución temporal (Figura 2). El objetivo de nuestro artículo es describir y demostrar la utilidad de la prueba de la hoja extirpado en combinación con un método de clonación vegetativa para la determinación de las tasas precisas y reproducibles del metabolismo de los herbicidas en plantas dicotiledóneas, utilizando el anillo marcado (URL- 14 C) herbicidas uniformemente en tres poblaciones rudis que difieren en sus respuestas a la planta entera HPPD- y herbicidas inhibidores de ALS (Tabla 1).

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>para semillas pregerminadas</td></tr><tr><td>Medio para macetas</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>49040233</td><td>para el crecimiento de las plantas</td></tr><tr><td>Nutricote</td><td>Agrivert&nbsp;</td><td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td><td>fertilizante de liberación lenta</td></tr><tr><td>Cámara de crecimiento E15</td><td>Controlled Environments Limited</td><td>20207</td> cultivo <td>de plantas</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>tampón para hojas extirpadas</td></tr><tr><td>HCl (concentrado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144500</td><td>ajustar el pH de las sales tampón</td></tr><tr><td>Murashige y Skoog (MS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404</td><td>incubación de hojas extirpadas</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>lavados de hojas después de la incubación</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td>extracciones de plantas</td></tr><tr><td>Acetonitrilo (grado HPLC)</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MKH07610</td><td>HPLC fase móvil</td></tr><tr><td>ácido fórmico&nbsp;</td><td>Mallinckrodt Analítica</td><td>MK259205</td><td>acidificar fase móvil pH</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Tubos de 1,5 o 2,0 ml</td></tr><tr><td>Centrífuga (con control de temperatura)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Tubos de 15 o 50 ml Tubo</td></tr> de <tr><td>centrífuga de polipropileno</td><td>Corning Inc.</td><td>430790</td><td>15 ml, estéril</td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>B&Uuml; Muestras</td> de <td>plantas de concentrado</td>CHI <td>R200</td></tr><tr><td>Espectrometría de centelleo líquido (LSS)</td><td>Packard Instruments</td><td>104470</td><td>cuantificar 14C</td></tr><tr><td>Cromatografía líquida de alta resolución</td><td>Perkin Elmer</td><td>N2910401</td><td>resolver metabolitos de herbicidas</td></tr><tr><td>Analizador de centelleo de flujo&nbsp;</td><td>LabLogic System</td><td>1103303</td><td>para el análisis de HPLC de 14C</td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18 columna&nbsp;</td><td>Termocientífico</td><td>03-050-522&nbsp;</td><td>Fase reversa</td></tr><tr><td>Cóctel Ultima-Flo M</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013579</td><td>para analizador de centelleo</td></tr><tr><td>de flujo Cóctel de centelleo (ScintiVerse BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18</td><td>para LSS;</td></tr><tr><td>homogeneizador de laboratorio</td> biodegradable <td>Kinematica</td><td>CH-6010&nbsp;</td><td>Homogeneizar muestras de hojas</td></tr></tbody></table>

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Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Con el fin de aislar y determinar con precisión las tasas de metabolismo de herbicidas en una maleza dicotiledónea obligada, el cáñamo acuático (Amaranthus tuberculatus), desarrollamos un ensayo de hojas extirpadas combinado con una estrategia de clonación vegetativa para normalizar la absorción de herbicidas y eliminar la translocación como factores contribuyentes en las poblaciones de cáñamo acuático resistentes a herbicidas (R) y sensibles (S). Los análisis biocinéticos de plaguicidas orgánicos en plantas suelen incluir la determinación de la absorción, la translocación (entrega al sitio objetivo), el destino metabólico y las interacciones con el sitio objetivo. El metabolismo de los herbicidas es un parámetro importante que se mide en las malezas resistentes a los herbicidas y en los cultivos tolerantes a los herbicidas, y normalmente se logra con pruebas de planta entera utilizando herbicidas radiomarcados. Sin embargo, una dificultad con la interpretación de los parámetros biocinéticos derivados de los métodos de toda la planta es que la translocación a menudo se ve afectada por las tasas de metabolismo de los herbicidas, ya que los metabolitos polares generalmente no son móviles dentro de la planta después de las reacciones de desintoxicación de herbicidas. Las ventajas del protocolo descrito en este manuscrito incluyen la determinación reproducible, precisa y rápida de las tasas de degradación de herbicidas en poblaciones R y S, una disminución sustancial en la cantidad de herbicida radiomarcado consumido, una gran reducción en los materiales vegetales radiomarcados que requieren mayor manipulación y eliminación, y la capacidad de realizar experimentos con herbicidas radiomarcados en el laboratorio o en la cámara de crecimiento en lugar de en un invernadero. A medida que la resistencia a los herbicidas continúa desarrollándose y extendiéndose en las poblaciones de malezas dicotiledóneas en todo el mundo, el método de ensayo de hojas extirpadas desarrollado y descrito en este documento proporcionará una técnica invaluable para investigar la resistencia basada en sitios no objetivo debido a las tasas mejoradas de metabolismo y desintoxicación de herbicidas.

Se detectaron grandes diferencias en las tasas de metabolismo mesotriona entre cualquiera WCS o ACR y MCR (Figura 1). En cada punto de tiempo, MCR había metabolizado mesotriona más rápidamente que las dos poblaciones-mesotriona sensible, WCS y ACR, que se correlaciona con las respuestas fenotípicas planta entera anteriores 11. Por clonación suficientes plantas desde una única planta parental de cada población, los análisis tiempo-por supuesto metabolismo herbicida son uniformes y reproducible...

Este manuscrito describe cómo las tasas de metabolismo de herbicidas se pueden cuantificar de manera efectiva con hojas extirpadas de una maleza dicotiledónea, reduciendo así la variabilidad y eliminando cualquier posible efecto de confusión de la absorción o translocación de herbicidas típicamente observada en ensayos de plantas enteras.

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In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

El objetivo general de este procedimiento es medir el metabolismo de herbicidas en una mala hierba dicotiledónea utilizando un ensayo con hojas excizadas. Esto se logra primero plantando y clonando poblaciones de amaranto acuático en invernadero y cámara de crecimiento. El segundo paso consiste en incubar hojas excizadas de amaranto acuático con herbicida marcado radiactivamente y realizar un estudio de curso temporal. A continuación, se extrae el herbicida y sus metabolitos de las hojas incubadas. El paso final es el análisis del herbicida y sus metabolitos mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa. En última instancia, este ensayo con hojas excizadas se utiliza para determinar tasas precisas de metabolismo del herbicida en diferentes poblaciones o especies de malezas.La principal ventaja de esta técnica o de métodos existentes como el marcado radiactivo de herbicidas aplicados sobre hojas o plantas completas es que se analizan plántulas genéticamente idénticas o intactas mediante la translocación independiente o de toda la planta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica vegetal, como determinar los mecanismos de re

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