Interrupción Anti-virulenta de patógenos biopelículas utilizando Engineered Quórum para saciar lactonasas

El objetivo general de este experimento es demostrar la eficacia de las enzimas que apagan el quórum en la disrupción de la biopelícula bacteriana. Este método ayudará a responder preguntas clave en el campo de la terapéutica antibacteriana y a comprender el efecto de las lactonasas que apagan el quórum en las bacterias patógenas dentro de un entorno de biopelícula. La principal ventaja de esta técnica es que las lactonasas que apagan el quórum se pueden añadir directamente en un entorno in vitro.

Por lo tanto, su efecto sobre la disrupción de la biopelícula es fácilmente cuantificable. Quien demuestra este procedimiento es Terrence Tay, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar, cultive un cultivo de 5 mililitros de A.baumannii S1 en LB a 30 grados centígrados en una incubadora agitadora durante 16 horas.

Ajuste el cultivo a un diámetro exterior de 600 de 0,8. A continuación, utilice LB fresco que contenga 4 miligramos por mililitro de enzima GKL purificada para diluir el cultivo de uno a 100. Y agregue 100 microlitros a los pocillos de una placa de 96 pocillos.

Use las tapas para cubrir los platos y colóquelos en un recipiente de plástico de 10 litros. Selle el recipiente e incube a 30 grados centígrados durante tres horas, antes de retirar suavemente el medio. Agregue otros 100 microlitros de medio LB fresco a los pocillos e incube la placa a 30 grados centígrados durante 21 horas.

Después de retirar suavemente el medio, utilice 200 microlitros de agua estéril para lavar suavemente las células de las bacterias planctónicas. Coloque la punta de la pipeta en el fondo del pocillo y retire con cuidado el medio líquido para garantizar que las perturbaciones en la biopelícula sean mínimas entre la interfaz de aire y líquido. A continuación, añada 100 microlitros de solución de violeta cristalina al 1% a cada pocillo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Retire la solución de violeta cristalina usando 200 microlitros de agua estéril para lavar los pocillos tres veces. Agregue 100 microlitros de ácido acético al 33% a cada pocillo e incube agitando suavemente durante 15 minutos para disolver el tinte. Cuantifique la cantidad de biopelícula midiendo la absorbancia del cristal violeta a 600 nanómetros.

La cantidad de cristal violeta es proporcional a la cantidad de biopelícula formada. Para llevar a cabo la microscopía de barrido láser confocal, o CLSM, de biopelículas de A.baumannii S1, se cultivó un cultivo de cinco mililitros de A.baumannii S1 en LB a 30 grados centígrados en una incubadora agitadora durante 16 horas. Ajuste el cultivo de A.baumannii S1 a un OD 600 de 0,8.

A continuación, utilice LB fresco que contenga 1,2 miligramos por mililitro de enzima GKL purificada para diluir el cultivo, de uno a 100, y añada un mililitro a una microplaca con fondo de vidrio de 35 mililitros. Cubra la microplaca con una tapa y colóquela en un recipiente de plástico de 10 litros y séllela antes de incubar la placa a 30 grados centígrados durante tres horas. Después de retirar suavemente el medio, agregue un mililitro de medio fresco que contenga 30 microlitros de enzima GKL purificada y luego incube a 30 grados centígrados durante otras 21 horas.

Retire suavemente el medio por segunda vez y reemplácelo con otro mililitro de enzima GKL en medio fresco. Incubar a 30 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, retire suavemente el medio y agregue 500 microlitros de cinco microgramos por mililitro de aglutinina de germen de trigo conjugado Alexa Fluor 488 disuelto en HBSS.

Incubar la microplaca a 37 grados centígrados durante 30 minutos para teñir los biofilms. Para fijar los biofilms, añadir 500 microlitros de formaldehído al 3,7% disuelto en HBSS e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Use dos mililitros de HBSS para lavar la microplaca una vez, luego retire la solución por completo.

Guarde el plato en la oscuridad a cuatro grados centígrados antes de la toma de imágenes CLSM. Para el procesamiento de imágenes y análisis CLSM, utilice un objetivo 63X para generar 97 pilas por imagen con un intervalo de 0,21 micras por pila. En el experimento de cuantificación de violeta cristalino, se utilizaron GKL de tipo salvaje y una enzima de extinción de quórum de doble mutación GKL mejorada para la actividad de la lactona contra tres hidroxidecanoils l homoserina lactona o 3OHC10HSL, la molécula de quórum principal utilizada por A. baumanii S1.As se muestra aquí, ambas enzimas pudieron reducir significativamente la formación de biopelículas en A. baumanii S1 de tipo salvaje pretratado. El grado de disrupción de las biopelículas por ambas enzimas no es proporcional a su eficacia contra 3OHC10HSL.

Como se ve en esta tabla, la tasa de renovación del GKL mutante es seis veces más rápida que la GKL de tipo salvaje contra 3OHC10HSL. Sin embargo, la diferencia en el grado de ruptura de las biopelículas entre las enzimas es solo doble. En este experimento, se utilizó para la comparación la enzima mutante GKL mejorada y su enzima inactiva catecolía.

Esta imagen DIC muestra que el tratamiento con la enzima mutante GKL mejorada resultó en una disminución en el tamaño de la biopelícula en comparación con la enzima inactiva. El análisis de las imágenes de fluorescencia también reveló que hubo una reducción en el área de superficie, la biomasa y el espesor promedio de las biopelículas, cuando se trataron con la enzima mutante GKL mejorada. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas, excluyendo el tiempo de incubación, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar la eliminación y la interrupción de la biopelícula durante los pasos de lavado. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el recuento de células y los ensayos de estabilidad enzimática. Esto responderá a preguntas adicionales como los efectos de las lactonasas que apagan el quórum en la población celular dentro de la biopelícula, así como su duración de acción.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tratamiento de enfermedades infecciosas exploraran los efectos de las posibles lactonasas que apagan el quórum en la biopelícula producida por bacterias patógenas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la interrupción de la biopelícula mediante la tinción de violeta cristalino y evaluar los cambios morfológicos en la biopelícula mediante imágenes confocal. No olvide que trabajar con material patógeno puede ser extremadamente peligroso.

Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de instalaciones adecuadas de contención de riesgos biológicos mientras se realiza este procedimiento.