Name: Inducida microbiológicamente Calcita precipitación mediada por Sporosarcina pasteurii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a inducir precipitación de calcita mediante Sporosarcina pasteurii para biomineralización y ciencia de materiales. Este protocolo estandarizado mejora la resistencia compresiva de esponjas mediante carbonato de calcio.

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Deseamos agradecer a los socios de la Iniciativa Helmholtz-Alberta, a la Asociación Helmholtz y a la Universidad de Alberta, por el apoyo resultante de la participación en esta colaboración. La financiación de la investigación es proporcionada por el Fondo de Iniciativas y Redes de la Asociación Helmholtz, los Centros Helmholtz participantes y por el Gobierno de Alberta a través del programa ecoTrust del Medio Ambiente de Alberta.
La Dra. Tanushree Ghosh es reconocida con gratitud por sus aportes críticos en una serie de etapas cruciales.

NOTA: Realice los protocolos experimentales en el orden que se describe a continuación. El protocolo de cultivo bacteriano se discute en la Sección 1 (véase también la figura 1). Sección 2 se describe el protocolo para enriquecer el medio de cultivo utilizando aditivos externos. Sección 3 describe los protocolos para la microscopía de multi-modo. Los pesos de todos los componentes individuales se puede medir usando una balanza analítica. Volumen de cada solución se puede medir usando un cilindro volumétrico. NOTA: los protocolos adecuados de bioseguridad debe ser seguido por las secciones 1 - 2. Consultar la oficina de seguridad institucional para obtener más detalles. 1. bacteriana Cultura <ol><li> Las bacterias Cultura - agar placa de medio Preparación <ol><li> Montar equipo y los ingredientes tales como placas de Petri, frasco, Tris-base, HCl, agar, Millipore agua, pH-metro etc.Sterilize todos los contenedores en autoclave a 121 ° C antes de su uso. </li><li> Preparar 1 L de 0,1solución 3 M acuosa de tampón Tris mezclando 15,75 g de Tris-base con 1 L de agua Millipore. Para bajar el nivel de pH de la solución original (pH 10,4) añadir 2.800 l de HCl (concentración 50%). Comprobar continuamente usando un pH-metro para ajustar pH = 9. </li><li> Dividir la solución tampón 1 L en dos partes como sigue: <ol><li> Tomar 800 ml de esta solución. Divida igualmente en dos partes de 400 ml cada uno. Disolver 8 g (NH 4) 2 SO 4 a una solución y 16 g de extracto de levadura a la otra solución. </li><li> Tomar las restantes (200 ml de) solución y se divide de nuevo en dos partes de 100 ml cada uno. Mezclar 2 g (NH 4) 2 SO 4 a uno. Añadir 4 g de extracto de levadura y 4 g de agar a la otra. </li></ol></li><li> Autoclave las 4 soluciones por separado después de concluir los respectivos frascos de lámina de aluminio y se pegue cintas de autoclave. NOTA: Si se utiliza un equipo de mesa autoclave, el volumen debe establecerse en 500 ml (temperatura y presión autómatacamente especificado como una función del volumen). </li><li> Después de sacarlos del autoclave, ajustar las dos soluciones de 400 ml a un lado para el paso 1.3.1 (a continuación). Mezclar las dos soluciones de 100 ml para tener una solución de 200 ml. Verter la mezcla en 10 - 12 placas de Petri. </li></ol></li><li> Las bacterias Cultura - placa de agar Preparación de muestras <ol><li> Retire la acción bacteriana del congelador (-80 ° C) y deje que se descongele. Después de descongelar correctamente, coloque la población bacteriana y la placa de agar dentro de una campana de bioseguridad. </li><li> Seleccione la micropipeta de menor dimensión disponible (0,5 - 10 l es una buena opción) para infestar la punta con el caldo de pasteurii Sporosarcina. Racha de una placa de agar con la punta de la micropipeta. Coloque la placa de agar con rayas dentro de una incubadora no agitación a 31 ° C durante 48 horas. </li><li> Después de 48 horas, retire la placa de la incubadora y examinar visualmente para detectar la existencia de colonias individuales. Si no hay colonias individuales, luego se coloca en tél incubadora durante otras 24 horas. </li><li> Repita el proceso hasta que se detectan colonias individuales. No exceda de 7 días de prueba. NOTA: Si no aparecen incluso después de una semana, entonces se concluye que las medidas no se han aplicado correctamente y todo el proceso debe repetirse desde el paso 1 colonias individuales. </li></ol></li><li> Las bacterias Cultura - Muestra final Preparación <ol><li> Mezclar las dos soluciones de 400 ml (tampón de Tris + (NH 4) 2 SO 4 y tampón de Tris + extracto de levadura (1.5.1) entre sí para obtener una solución de 800 ml. De transferencia de 125 ml de esta solución en un matraz. </li><li> Realizar un examen visual de la superficie de la placa de agar para identificar regiones con alta concentración de colonias individuales. empujar suavemente y romper una de las colonias con una punta de micropipeta. </li><li> Moje la misma punta de la micropipeta en el matraz de 125 ml y se remueve a fondo para asegurar que un número suficiente de células para la multiplicación robusta ser transferido. Colocar el matraz en un incubador con agitación a 150 rpm, 30 ° C durante 2 - 3 días. Después de 2 - 3 días, retirar el matraz de la incubadora. </li></ol></li><li> Las bacterias Cultura - Recuento de Células final <ol><li> Realizar dilución en serie de la solución de cultivo no diluido con PBS para alcanzar una dilución de al menos diez millones (10 -7) para asegurar aparecen colonias individuales contables. Dibuje siete líneas equidistantes paralelas sobre una de las placas de agar. <ol><li> Para ello, dibujando líneas en negrita en la superficie inferior de la placa de Petri, lo suficientemente prominente como para ser visible desde la parte superior. Caída de 3 pequeñas gotas de solución no diluida en un segmento. Añadir 1 ml de solución no diluida a 9 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una dilución de 1:10. </li></ol></li><li> Tomar una pequeña alícuota (~ 0,1 ml) de esta solución recién diluida con una pipeta y colocar 3 gotas más pequeñas en el siguiente segmento. Transferir la solución recién diluida a un nuevo matraz y más diluidas diez veces (10x) porla adición de PBS. Esto hace bajar la dilución de 10 -2 o 1: 100. <ol><li> Utilice esta solución 1: 100 en el siguiente segmento. Repita este se procesa con pequeños volúmenes de las soluciones diluidas por ellos recién transferir sucesivamente a nuevos frascos y diluyendo de forma continua de diez veces (10x) en conjunto con PBS para obtener más y más muestras diluidas de 10 -3 ó 1: 1.000 de todo el camino hasta 10 -7 o 1:10 millones en el último segmento. </li></ol></li><li> Realizar formadoras de colonias recuento Unidad (CFU) Placa para contar el número de células presentes en la placa de agar después de incubar la placa durante 1 - 2 días a 31 ° C. Esto da una medida cuantitativa de la recuento de bacterias en la muestra sin diluir. NOTA: El valor CFU se mide en base a la capacidad del sistema para dar lugar a colonias en las condiciones específicas de medio nutriente, temperatura y tiempo asumiendo que todas las colonias es independiente y fundada por una sola célula microbiana viable. </li><li> Sellolas placas de Petri con la película de cierre automático y tienda de artículos restante en un refrigerador para su uso futuro. </li></ol></li></ol> 2. Protocolo para el enriquecimiento de nutrientes para acelerar la precipitación <ol><li> Transferencia de 9 ml de líquido de cultivo preparada (células + medio) en varios tubos de centrífuga estériles, cada una de 10 ml de volumen. </li><li> Preparar una solución madre de 100 ml del enriquecimiento externo que consta de cuatro componentes en las siguientes concentraciones en medio fresco: Urea: 2 g / L, cloruro de amonio: 1 g / L, bicarbonato de sodio: 212 mg / L, cloruro de calcio: 280 mg / L. medir cuidadosamente todos los ingredientes usando una balanza analítica y se mezcla todo, pero la urea con medio fresco en un vaso de precipitados y el lugar en el autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min). <ol><li> Después de autoclave, se mezcla la cantidad requerida de urea (2 mg) con 1 ml de medio fresco y pasar a través de una jeringa equipada con filtro de jeringa de 0,22 micras para completar el proceso de enriquecimiento. </li><li> Añadir 1ml de este medio de enriquecimiento con aditivos a los tubos de centrífuga estériles que contienen 9 ml de líquido de cultivo preparada (células + medio) (véase el paso 2.1). NOTA: de todos estos componentes, urea ser degradable a temperaturas elevadas, no puede ser esterilizado en un autoclave. Por lo tanto, después de que los otros componentes han sido tratado en autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min), se añade urea pasado a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. </li></ol></li><li> Vortex cada tubo a fondo usando un agitador vorticial mecánica. Coloque los líquidos enriquecidos (células + aditivos + medio) en una incubadora no agitación a 30 ° C. Supervisar todas las unidades con regularidad para la iniciación de la precipitación. El uso de un microscopio de luz, comenzar observaciones microscópicas una vez que se detecta inicio de la precipitación con el ojo desnudo. Esto es por lo general entre 30 - 36 hr después del inicio de los experimentos. </li></ol> 3. Protocolo de Microscopía varios modos de funcionamiento <ol><li> Transferir un volumen pequeño (~ 1 ml) de líquido a una alta magníficatión sistema cubreobjetos microscopio de la recámara para realizar observaciones iniciales con el modo de campo claro. Para empezar, iniciar todas las observaciones con el aumento más bajo (4X). que proporciona una amplia área de cobertura y, por tanto, la información sobre la distribución mundial de precipitados. </li><li> Seleccionar áreas particulares con volúmenes significativos de precipitaciones y un zoom (20X, 40X, 60X) aumentando progresivamente el aumento. NOTA: Ya que es imposible resolver adecuadamente las células de la sustancia polimérica extracelular (EPS) en el marco de campo brillante (debido a los índices de refracción muy cerca), cambiar el modo de contraste de fase siempre que sea necesario. En este modo, sólo los contornos de las membranas celulares (siendo una fase diferente de la célula a granel) son visibles, lo que permite la diferenciación visual. </li><li> Por último, algunas cámaras de manchar con tinción Live / Dead que tiñe selectivamente los componentes vivos como verde, mientras que la coloración de los componentes de muertos en rojo. Remitirse a los protocolos estándar 28 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Activar el modo fluorescente para distinguir correctamente entre las regiones rojas y verdes. Rojo (filtro de cubo rojo con la excitación de longitud de onda de 540 - 580 nm, espejo dicroico de 595 nm y Barrera filtro de 600 - 660 nm) y de paso largo GFP verde (filtro de cubo verde con excitación de longitud de onda de 440 - 480 nm, espejo dicroico de 505 nm y filtro de barrera de 510 nm cubos) de filtro se utilizan para facilitar micrografías fluorescentes. </li><li> Una vez que todos los datos multimodo se han reunido, seleccionar las mejores imágenes y superposición de forma manual (campo claro individual, de contraste de fases y las imágenes fluorescentes) para obtener el mejor contraste y la claridad posible. </li><li> Realizar SEM de las muestras sólidas secas de entender las estructuras de cristal. Este es un procedimiento bien establecido y estándar. 22 Realizar XPS para identificar las firmas químicas de los grupos funcionales (carbonatos). Este es un procedimiento bien establecido y estándar, así. 23 </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos: Este manuscrito describe en detalle los protocolos para el cultivo de una muestra viable de S. pasteurii. Una vez que el cultivo ha sido preparado, que debe ser enriquecida adecuadamente. Este es un paso clave fundamental para el éxito del experimento debido a una falta de proporcionar el ambiente químico adecuado conduce a cualquiera de las escalas de tiempo muy largos de precipitación o una falta completa de la misma. S. pasteurii es bastante sensible a varios org...

Sporosarcina pasteurii es una bacteria gram-positiva capaces de sobrevivir en entornos altamente alcalinas (pH ~ 10) 1 y es uno de las especies bacterianas que pueden convertirse en un agente causal de un fenómeno llamado inducida microbiológicamente Calcita Precipitación (MICP) 2-4. MICP es un proceso en el que la precipitación de carbonato de calcio es inducido por ciertos microbios en condiciones ambientales adecuadas. S. pasteurii ha cobrado importancia en los últimos años debido a su identificación como un posible agente para inducir un volumen significativo de MICP bajo ciertas condiciones. Esta posibilidad surge del hecho de que S. pasteurii tiene la capacidad única de secretar grandes cantidades de la enzima ureasa. Esta enzima actúa como un catalizador, la promoción de una lisis acelerada de urea (un compuesto orgánico que existe de forma natural con el suministro generalizada y abundante) en presencia de moléculas de agua. A través de una cascada de reacciones, este proceso finalLy conduce a la generación de iones carbonato con carga negativa. Estos iones, a su vez, reaccionan con iones metálicos positivos como el calcio para formar finalmente precipitados de carbonato de calcio (calcita); por lo tanto, la etiqueta MICP 5-9. El proceso de MICP ha sido conocido y estudiado durante varias décadas 10,11. En los últimos años, se ha investigado MICP para una amplia gama de aplicaciones ambientales, incluyendo la construcción verde de abajo hacia arriba 12, la mejora de las estructuras a gran escala 13,14 y la captura de carbono y almacenamiento 15,16 ingeniería y. Por ejemplo, Cunnigham 17 et. Al diseñado un reactor de flujo temperatura moderada a alta presión que contiene un núcleo de arenisca Berea. El reactor se inoculó con las bacterias S. fridgidimarina y en condiciones de inyección de dióxido de carbono supercrítico a alta presión, una acumulación masiva de biomasa dentro del poro volse observó umes, lo que condujo a la reducción de más de 95% de la permeabilidad. Jonkers y Schlangen 18 estudiaron el efecto de ciertas cepas especiales de bacterias en el proceso de auto-sanación en el hormigón. Se espera externa de agua transportada en la red de poros entra a través de los poros de la superficie para activar las bacterias inactivas que a su vez ayudan a la resistencia estructural a través de MICP. Tobler 19 et al. han comparado la actividad de S. ureolíticas pasteurii con un agua subterránea microcosmos ureolíticas indígena en condiciones que favorecen MCIP a gran escala y se encontró que S. pasteurii tiene una capacidad constante para mejorar la precipitación de calcita incluso cuando las comunidades indígenas carecían de actividad de la ureasa antes. Mortensen 20 et.al han estudiado los efectos de los factores externos, como el tipo de suelo, la concentración de cloruro de amonio, salinidad, concentración de oxígeno y la lisis de las células en MICP. Su demostración de que el proceso de tratamiento biológico es muy robusto con respect a una amplia variación en el espacio de parámetros corrobora la idoneidad de este proceso para diversas aplicaciones de remediación a gran escala proporciona un proceso de enriquecimiento adecuado para reforzar las bacterias se lleva a cabo. Phillips 21 et. al diseñado experimentos para estudiar los cambios en la permeabilidad y la fuerza de una columna de arena y un núcleo de arenisca después de haber sido inyectados con S. culturas pasteurii. Ellos encontraron que mientras que la permeabilidad disminuyó 2 - 4 veces, mientras que la resistencia a la fractura aumentó tres veces. S. pasteurii y su papel en MICP son temas de investigación activa y varias cuestiones relacionadas con el mecanismo de precipitación química todavía no se entienden completamente. A la luz de esto, es muy importante contar con un conjunto de protocolos estandarizados coherentes con la cultura con precisión una población enriquecida de manera adecuada S. pasteurii para lograr MICP. A continuación, se describe un protocolo riguroso que garantice la repetibilidad y la reproducibilidad. esta manuscript describe los protocolos detallados para el cultivo de S. pasteurii y adecuadamente el enriquecimiento del medio de cultivo para inducir la precipitación. El proceso se investigó a través de diversas técnicas microscópicas tales como óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM) y X-Ray Photo-electrón Spectroscopy (XPS). El foco del manuscrito está en el proceso de MICP. Los procedimientos como SEM y SIMS, siendo protocolos estándar bien establecidos, no se describen por separado.

<table><tbody><tr><td>Petridish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Petridish que se utiliza como placa de agar</td></tr><tr><td>Ferrex Flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63268</td><td>Corning Erlenmeyer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Promega</td><td>H5133</td><td>que se utiliza para hacer Tris-Buffer</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td>1.0 N, biorreactivo, adecuado para cultivo celular</td></tr><tr><td>Agar Powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>microbiología probada, cultivo de células vegetales probado, cultivo celular probado,</td></tr><tr><td>polvo Sulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td>para biología molecular</td></tr><tr><td>Extracto de levadura en polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de medición</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP08559GC</td><td>Cole-Parmer Clase A Cilindro graduado con Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk</td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>OHAUS</td><td>AX124E</td><td>que se utiliza para medir el peso de los reactivos</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Brinkmann</td><td>58619000</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de autoclave</td><td>VWR</td><td>52428864</td><td></td></tr><tr><td>papel de aluminio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z185140</td><td>se utiliza para sellar el matraz antes de colocarlo en Autoclave</td></tr><tr><td>Stock Bacteriano</td><td>Cedarlane</td><td>11859</td><td>-80 &deg; C stock de S. pasteurii, ATCC No. se menciona contra el nº de cat. No.</td></tr><tr><td>Pipetas mecánicas monocanal Mline, volumen variable</td><td>Biohit</td><td>725010</td><td>Comercializado por VWR con el número de catálogo 14005976</td></tr><tr><td>Punta de micropipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>212772B</td><td>Se utiliza para rascar placas de agar</td></tr><tr><td>Aglutinante</td> de<td>incubadora</td><td>80079098</td><td>Incubadora de microbiología, BF Series</td></tr><tr><td>Incubadora de agitación</td><td>VWR</td><td>14004300</td><td>VWR Signature Batido de sobremesa Incubadoras</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino (PBS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Express Pipet-Aid Dispositivo de pipeteo</td><td>BD Biosciences</td><td>357590</td><td>Comercializado por VWR con el número de catálogo 53106220</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Se utiliza para sellar placas de agar</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>Enriquecimiento para medio nutriente</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td>Enriquecimiento para medio nutritivo</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Enriquecimiento para medio nutritivo</td></tr></tbody></table>

inducida microbiológicamente calcita precipitación mediada por<em&gt; sporosarcina pasteurii</em

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

La bacteria en particular bajo investigación aquí (S. pasteurii) es único en su capacidad, en las condiciones adecuadas, para inducir la hidrólisis de la urea (ureolysis) en entornos naturales a través de la secreción de una enzima ureasa. Este proceso de ureolysis, a través de una cadena de reacciones químicas, conduce a la formación de precipitados de carbonato de calcio. Esto se conoce como inducida microbiológicamente Calcita Precipitación (MICP). Los protocolos de cultivo adecuados para MICP se detallan aquí. Por último, se realizaron experimentos de visualización en diferentes modos de microscopía de comprender diversos aspectos del proceso de precipitación. Técnicas como la microscopía óptica, se emplearon Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y X-Ray Photo-electrón Spectroscopy (XPS) para caracterizar químicamente el producto final. Además, la capacidad de estos precipitados a obstruir los poros dentro de un medio poroso naturales se demostró a través de un experimento cualitativo donde esponjabarras se utilizan para imitar un poro de la red con una gama de escalas de longitud. Una barra de esponja sumergido en el medio de cultivo que contiene las células bacterianas se endurece debido a la obstrucción de sus poros resultantes del proceso continuo de precipitación química. Esta barra de esponja endurecido exhibe una resistencia superior en comparación con una barra de esponja de control que se comprime y apretó bajo la acción de una carga externa aplicada, mientras que la barra de endurecido es capaz de soportar el mismo peso con poca deformación.

S. pasteurii ser un Alcalófilo 24 puede sobrevivir en condiciones relativamente duras. Cuando el protocolo de cultivo antes mencionado se siguió, y S. pasteurii se cultiva dentro de una cámara, las bacterias lleva a la precipitación de carbonato de calcio con el tiempo (Figura 2A). La figura 2 (b) muestra una imagen microscópica óptica de contraste de fases de la población de células bacterianas en el medio de cultivo. Las cé...

Aquí se presentan los protocolos para la precipitación de calcita inducida microbiológicamente (MICP) utilizando la bacteria Sporosarcina pasteurii. El carbonato de calcio precipitado se caracterizó mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM). También se ha demostrado que la exposición al MICP aumenta la resistencia a la compresión de la esponja.

Inducida microbiológicamente Calcita precipitación mediada por<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

El objetivo general de este protocolo es inducir la precipitación de calcita en un cultivo estancado de Sporosarcina pasteurii. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave de biofísica sobre la precipitación de calcita mediada por Sporosarcina pasteurii, como las escalas de longitud y tiempo pertinentes. La principal ventaja de esta técnica es el hecho de que estandariza los pasos complejos implicados en el cultivo y enriquecimiento adecuado de Sporosarcina pasteurii, lo que garantiza una precipitación confiable de calcita.Para comenzar, reúna placas de Petri, matraces, base de Tris, HCl, agar, agua Millipore y un pH-metro. Esterilice todos los recipientes mediante autoclave a 121 grados Celsius antes de usarlos. Prepare un litro de una solución acuosa 0,13 molar de tampón Tris mezclando 15,75 gramos de base de Tris con un litro de agua Millipore.Agregue aproximadamente 2.8 mililitros de HCl al 50 % para ajustar el tampón a un pH de nueve. Una vez que el cultivo esté listo, debe enriquecerse adecuadamente con el tampón adecuado. Este paso es fundamental para el éxito del experimento, ya que la falta de proporcionar el entorno químico adecuado puede provocar escalas de tiempo muy largas de precipitación o incluso la ausencia total de esta.A continuación, divida el litro de tampón en dos partes de la siguiente manera. En una alícuota de 400 mililitros, disuelva ocho gramos de sulfato de amonio. En una segunda alícuota de 400 mililitros, disuelva 16 gramos de extracto de levadura.En 100 mililitros del tampón, mezcle dos gramos de sulfato de amonio, y en los últimos 100 mililitros de tampón, agregue cuatro gramos de extracto de levadura y cuatro gramos de agar. Después de envolver los matraces en papel de aluminio, esterilice las cuatro soluciones en autoclave. Inmediatamente después de la esterilización en autoclave, aparte las dos soluciones de 400 mililitros.Combine las dos soluciones de 100 mililitros, mezcle bien y reparta entre 10 y 12 placas de Petri. Para cultivar muestras bacterianas, retire el stock bacteriano del congelador a menos 80 grados Celsius y déjelo descongelar adecuadamente. Luego colóquelo junto con una placa de agar en la cabina de seguridad biológica.Seleccione una micropipeta con el volumen más bajo posible y sumerja la punta de micropipeta en el cultivo de Sporosarcina pasteurii antes de usarla para sembrar en forma de rayas una placa de agar. Incube la placa a 31 grados Celsius durante 48 horas y luego examine visualmente la presencia de colonias aisladas. Si no están presentes, incube durante 24 horas adicionales.Repita la verificación y las incubaciones hasta que se detecten colonias aisladas. Para preparar las muestras finales de cultivo bacteriano, mezcle las dos soluciones de 400 mililitros autoclavadas previamente en un vaso de precipitados esterilizado y transfiera 125 mililitros a un matraz. Realice un examen visual de la placa de agar para identificar las regiones con altas concentraciones de colonias aisladas.Con la punta de una micropipeta, empuje suavemente y rompa una de las colonias. Luego sumerja la misma punta en el matraz de 125 mililitros y agite bien para asegurar que se transfiera un número suficiente de células. Coloque el matraz en un incubador con agitación a 30 grados Celsius y 150 rpm durante dos o tres días.Para determinar un recuento celular final, dibuje siete líneas paralelas equidistantes y gruesas en la parte inferior de una de las placas de agar de modo que sean visibles desde la parte superior. Coloque tres gotas pequeñas de aproximadamente diez microlitros de cultivo no diluido en un segmento. Añada un mililitro de cultivo no diluido a nueve mililitros de PBS esterilizado para obtener una dilución uno a diez.Luego, coloque tres gotas pequeñas de la dilución sobre un segundo segmento de la placa. Transfiera la cultura diluida a un matraz nuevo y utilice PBS para diluir adicionalmente diez veces hasta diez a la menos dos. Repita el proceso de siembra y dilución hasta generar una dilución de al menos diez a la menos siete para asegurar la obtención de colonias individuales.Incube la placa a 31 grados Celsius durante uno o dos días antes de contar las colonias en cada sección de la placa. Transfiera nueve mililitros del cultivo líquido preparado a varios tubos de centrífuga esterilizados de diez mililitros. Prepare 100 mililitros de la solución stock de enriquecimiento externo utilizando una balanza analítica para pesar cuidadosamente dos gramos por litro de urea, un gramo por litro de cloruro de amonio, 212 miligramos por litro de bicarbonato de sodio y 280 miligramos por litro de cloruro de calcio.En un vaso de precipitados con medio fresco, combine todos los ingredientes excepto la urea y esterilice en autoclave. Después de la esterilización en autoclave, mezcle la urea con un mililitro de medio fresco y pase la solución a través de una jeringa equipada con un filtro de 0,2 micrómetros antes de añadirla al medio de enriquecimiento. Añada un mililitro del medio de enriquecimiento con aditivos a los tubos de centrífuga esterilizados que contienen nueve mililitros del cultivo preparado.Vortex cada tubo e incube en un incubador sin agitación a 30 grados Celsius. Monitoree todas las unidades regularmente para detectar el inicio de la precipitación. Una vez que se detecte la precipitación a simple vista, transfiera un pequeño volumen de líquido a un sistema de cubreobjetos con cámara para microscopía de alta magnificación.Observe inicialmente con un aumento de 4X para ver una amplia zona de cobertura antes de aumentar progresivamente el aumento. Realice las tinciones y los experimentos de MEB según el protocolo descrito en el texto. Cuando S.pasteurii se cultiva siguiendo el protocolo mostrado en este video, las bacterias provocan la precipitación de carbonato de calcio que se sedimenta en el fondo del tubo con el tiempo.Esta figura muestra imágenes de contraste de fase de una población bacteriana claramente diferenciada, con forma de bastón, dentro del medio. Aquí pueden observarse las líneas de escisión bien definidas, característica distintiva de la cristalinidad. Este gráfico de espectroscopía fotoelectrónica de rayos X para la misma muestra contiene picos correspondientes a grupos carbonato que indican la presencia de carbonato de calcio.En este panel se muestra una esponja sin tratar que se comprime fácilmente cuando se le aplica un peso de un kilogramo. Cuando se sumergió una esponja en una solución precipitante de calcita con S.pasteurii durante siete días y luego se secó, se endureció y mostró una mayor resistencia a la compresión debido al bloqueo de poros por la precipitación de calcita. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en unas pocas horas si todos los pasos se realizan correctamente.Sin embargo, aunque los pasos individuales toman solo unos pocos minutos cada uno, existen períodos de inactividad más largos entre ellos, durante los cuales la muestra debe incubarse durante horas o incluso días. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar varias técnicas adicionales, como caracterizaciones complementarias, para responder otras preguntas sobre, por ejemplo, la distribución estadística de las formas polimorfas en el carbonato de calcio. Después de ver este video, debería tener una comprensión adecuada y clara de cómo cultivar adecuadamente Sporosarcina pasteurii para enriquecerla de forma que garantice la precipitación de calcita, y también de cómo observar el proceso mediante microscopía de múltiples modos.No olvide que trabajar con autoclaves de alta presión puede ser extremadamente peligroso, por lo tanto, se deben tomar todas las precauciones, como la ventilación completa de la cámara y el uso de EPP, antes de realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Bhaduri, S., et al., Precipitación de calcita inducida microbiológicamente mediada por Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra el método de enriquecimiento de Sporosarcina pasteurii con urea y cloruro de calcio para desencadenar la actividad de la ureasa, lo que lleva a la formación de cristales de calcita visibles a través de la precipitación de calcita inducida microbiológicamente o MICP.

Precipitación de calcita inducida microbiológicamente por Sporosarcina pasteurii

Se desarrolló un método para identificar endosporas bacterianas de comunidades microbianas complejas para realizar estudios moleculares o de cultivo personalizados de este grupo de bacterias.

El aislamiento físico de endosporas de muestras ambientales por Targeted lisis de las células vegetativas

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Dos vías de valorización de escoria de alto horno: Síntesis de carbonato de calcio precipitado y zeolíticos adsorbente de metales pesados

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Caracterización de la calcificación Eventos en vivo mediante técnicas ópticas y microscopía electrónica en un Gusano Tubícola Marina

Describimos un protocolo para la precipitación y caracterización de cristales de carbonato de calcio que se forman en presencia de biopolímeros.

Formación de carbonato de calcio en presencia de aditivos biopoliméricos

Aquí, la tecnología de precipitación de calcita inducida microbianamente (MICP) se presenta para mejorar las propiedades del suelo por inmersión.

Mejora del suelo de arena a través de la precipitación de calcita inducida microbiana (MICP) por inmersión

El método de verificación descrito aquí es adaptable para monitorear el secuestro inorgánico de carbono pedogénico en varios suelos agrícolas modificados con rocas alcalinas que contienen silicato de metal de tierra, como wollastonita, basalto y olivino. Este tipo de validación es esencial para los programas de crédito de carbono, que pueden beneficiar a los agricultores que secuestran carbono en sus campos.

Monitoring Pedogenic Inorganic Carbon Accumulation Due to Weathering of Amended Silicate Minerals in Agricultural Soils.

El aislamiento de microbios resistentes a metales pesados de las fuentes geotérmicas es un tema candente para el desarrollo de biosistemas de biorremediación y monitoreo ambiental. Este estudio proporciona un enfoque metodológico para aislar e identificar bacterias tolerantes a metales pesados de aguas termales.

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Sporosarcina pasteurii es una bacteria ureolítica que descompone la urea en carbonato y amonio. El carbonato se combina con el calcio para formar carbonato de calcio, creando una red cristalina que ancla las partículas circundantes para producir biocemento. Este es un protocolo conveniente para usar moldes impresos en 3D para crear ladrillos de biocemento adecuados para pruebas de compresión.

Producción y análisis de ladrillos de biocemento Sporosarcina pasteurii utilizando moldes personalizados impresos en 3D para ensayos de compresión no confinados

Hemos sintetizado nanoestrellas en forma de estrella de oro con una mediada de plata de semillas método de crecimiento. El diámetro de la nanoestrellas oscila entre 200 y 300 nm y el número de consejos varían de 7 a 10. Las nanopartículas tienen una superficie amplia de plasmones modo de resonancia centrada en el infrarrojo cercano.

Síntesis de oro Nanostar con un método de la Simiente de Plata crecimiento mediada por

Aprende a inducir precipitación de calcita mediante Sporosarcina pasteurii para biomineralización y ciencia de materiales. Este protocolo estandarizado mejora la resistencia compresiva de esponjas mediante carbonato de calcio.

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