Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas

El objetivo general de este nuevo método de cribado fluorométrico de fármacos es determinar la afinidad de unión de pequeñas moléculas de fármaco a una proteína diana mediante la formación de nanogrupos de nano de oro fluorescente dentro de la plantilla de proteínas cargada de fármaco. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los descubrimientos de fármacos dirigidos a proteínas, como por ejemplo cómo la fuerza de vidding de las moléculas de fármacos puede afectar a la estabilidad de las proteínas para que no se desplieguen, lo que conduce a la formación de nanogrupos de oro fluorescente de diferentes intensidades. La principal ventaja de este tenix es que podemos convertir una proteína diana en un biosensor fluorescente para permitir un cribado rápido de fármacos moleculares pequeños sin la necesidad de un instrumento sofisticado y tediosos pasos de etiquetado.

La combinación de mi propio conocimiento, así como el descubrimiento de la coautora de la proteína, tiene un efecto de estabilización distinto en el plasmónico. La nanopartícula inspiró la idea de este método. Comience este procedimiento con la preparación de los reactivos químicos para el cribado de drogas como se detalla en el protocolo de texto para preparar la albúmina sérica humana o los nano clústeres de oro con plantilla de HSA, colocados dos viales de vidrio cada uno con una barra de agitación micromagnética en dos agitadores magnéticos separados controlables por temperatura.

Ajuste la temperatura de un agitador magnético a 60 grados centígrados. A continuación, agregue 200 microlitros de solución de albúmina sérica humana, 200 microlitros de agua ultrapura y 200 microlitros de solución de cloruro de oro a cada vial bajo agitación constante para permitir la encapsulación de iones de oro dentro de la plantilla de proteína, dos minutos después, agregue 20 microlitros de solución de hidróxido de sodio a cada vial para activar la capacidad reductora de la albúmina sérica humana que informa a los nano grupos de oro. Comience a registrar el tiempo de reacción a cero minutos cada 20 minutos.

Extraiga 50 microlitros de cada muestra y transfiéralos a una placa negra de 384 pocillos. Mida el espectro de emisión con un lector de microplacas. Detenga la agitación magnética después de 100 minutos.

Enfríe los frascos de vidrio con agua corriente en un fregadero. Traza los espectros de fotoemisión en todo momento para cada muestra para adquirir la cinética de formación de nanoclústeres de oro en diferentes condiciones de temperatura. Para preparar la albúmina sérica bovina o los nano clústeres de oro con plantilla BSA, coloque un vial de vidrio que contenga una barra de agitación micromagnética en la parte superior de una agitación magnética.

Deje la temperatura como temperatura ambiente. Mezcle 200 microlitros de solución de BSA, 200 microlitros de urea y 200 microlitros de solución de cloruro de oro en el vial de vidrio bajo agitación constante. Dos minutos después a 20 microlitros de solución de hidróxido de sodio.

Para activar la capacidad reductora de BSA para formar nano grupos de oro y comenzar a registrar el tiempo de reacción como cero minutos. Mida el espectro de fotoemisión de la mezcla de reacción cada hora. Coloque cinco viales de vidrio, cada uno con una barra de agitación magnética y preetiquetados con un medicamento o HSA puro, encima de un agitador magnético multipunto de temperatura controlable.

Agregue 200 microlitros de HSA a cada vial. A continuación, añada un microlitro de cada solución de fármaco previamente preparada a los cuatro archivos correspondientes. Además, agregue un microlitro de DMSO al interruptor de control en el agitador.

Ajuste la velocidad de centrifugado a 360 RPM e incube durante una hora para permitir que el medicamento se una a HSA una hora más tarde a 200 microlitros de agua mili Q y 200 microlitros de solución de cloruro de oro en cada vial bajo agitación constante. Ajuste la temperatura a 60 grados centígrados bajo agitación constante durante 10 minutos. A los 10 minutos a 20 microlitros de hidróxido de sodio 1,5 molar a cada lima y empezar a registrar el tiempo de reacción a los cero minutos.

Las soluciones de reacción conjunta para la medición deben seguir la misma secuencia de adición de fármacos y deben practicarse lo más rápido posible para minimizar el efecto de retraso de tiempo: Extraiga rápidamente 50 microlitros de solución de cada vial. Transfiera a una placa negra de 384 pocillos y mida el espectro de emisión. Registre los espectros de emisión de cada muestra cada 10 minutos, recopilando al menos cuatro espectros en cuatro momentos diferentes.

Repita estos pasos varias veces para obtener resultados con una tendencia consistente. Represente los espectros de fotoemisión resueltas en el tiempo para cada muestra. Identifique la intensidad máxima de todas las muestras y trace en función del tiempo para comparar la cinética de formación de nanogrupos de oro en diferentes plantillas de proteínas cargadas de fármacos para medir la constante de unión entre cada fármaco y la HSA.

Reemplace las soluciones de medicamentos con soluciones de ibuprofeno en cuatro concentraciones diferentes. 10 minutos después, enfríe los frascos de vidrio con agua corriente en un fregadero. Extraiga 50 microlitros de las soluciones anteriores de cada vial en una placa negra de 384 pocillos y mida el espectro de emisión.

Repita estos pasos dos veces más para obtener otros dos conjuntos de resultados a diferentes concentraciones del fármaco antes de detener la agitación magnética. A continuación, trace los espectros de fotoemisión y analice los resultados de la materia prima obtenida en cada lote individual. Traza los espectros de fotoemisión de cada muestra en un software como Origin Pro y determina la intensidad máxima.

Calcule y trace la intensidad relativa de fluorescencia frente a la concentración del fármaco. A continuación, calcule la constante de enlace ajustando los datos a un modelo de enlace de un solo sitio. Usando la ecuación de cementina de Mics para hacer esto en software como Origin Pro.

Seleccione el menú ajuste de curva no lineal de ajuste de análisis y, a continuación, seleccione la función de granizo de la categoría sigmoidal de crecimiento en la página de selección de la función de configuración. Haga clic en ajustar para mostrar. Los resultados ajustados que se muestran aquí son resultados representativos de los espectros de fotoemisión resueltos en el tiempo de nano clústeres de oro producidos en diferentes condiciones de desnaturalización de proteínas.

Se puede observar que en el oro se forman nano grupos más rápido a mayor temperatura. La condición de desnaturalización de la urea también puede facilitar la síntesis directa de nano clústeres de oro utilizando la proteína BSA como plantilla. A continuación se muestran los resultados típicos del cribado rápido de fármacos fluorométricos basados en la intensidad de fluorescencia de nanogrupos de oro utilizando HSA cargado con fármaco como plantilla.

Cuanto mayor sea la intensidad fluorescente, más débil será la fuerza de unión de una molécula de fármaco a HSA. Estos espectros muestran el efecto de la concentración de carga del fármaco en la tasa de formación de nano grupos de oro fluorescente dentro del HSA cargado de ibuprofeno. Cuanto mayor sea la concentración del fármaco, menor será la señal fluorescente de los nanogrupos de oro resultantes, que se muestra aquí como un resultado representativo de la determinación de la constante de unión al fármaco de proteínas.

Se calcula ajustando la intensidad de fluorescencia relativa de los nano clusters de oro sintetizados en la plantilla HSA precargada con ibuprofeno de concentraciones variadas utilizando la ecuación de cementina de las UCIM. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos para el cribado de múltiples fármacos en paralelo si se realiza correctamente. Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar rein, ir a nano clúster en la proteína cargada con fármaco y determinar la afinidad de unión de los fármacos a una proteína objetivo según lo detectable por la señal fluorescente emitida por los nano clústeres de oro resultantes.