Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas

El objetivo general de este nuevo método de cribado de fármacos basado en mediciones fluorométricas consiste en determinar la afinidad de unión de pequeñas moléculas farmacéuticas a una proteína diana mediante la formación de nanoaglomerados fluorescentes de oro dentro de una plantilla proteica cargada con el fármaco. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de fármacos dirigidos a proteínas, como la forma en que la fuerza de unión de las moléculas farmacéuticas puede afectar la estabilidad de las proteínas frente al desdoblamiento, lo que conduce a la formación de nanoaglomerados de oro fluorescentes con distintas intensidades. La principal ventaja de esta técnica es que permite convertir una proteína diana en un biosensor fluorescente, lo que posibilita el cribado rápido de fármacos de bajo peso molecular sin necesidad de instrumentos sofisticados ni de pasos tediosos de marcado.

La combinación de mis propios conocimientos, así como del descubrimiento de la coautora, quien identificó que la proteína tiene un efecto de estabilización distinto sobre la plasmonica, inspiró la idea de este método. Comience este procedimiento con la preparación de los reactivos químicos para la selección de fármacos, tal como se describe en el protocolo escrito, para preparar los nanoaglomerados de oro templados con albúmina sérica humana o HSA. Coloque dos viales de vidrio, cada uno conteniendo una barra magnética microscópica, sobre dos agitadores magnéticos independientes con control de temperatura.

Configure la temperatura de un agitador magnético a 60 grados Celsius. A continuación, agregue 200 microlitros de solución de albúmina sérica humana, 200 microlitros de agua ultrapura y 200 microlitros de solución de cloruro de oro a cada vial bajo agitación constante para permitir la encapsulación de iones de oro dentro de la plantilla proteica; dos minutos después, agregue 20 microlitros de solución de hidróxido de sodio a cada vial con el fin de activar la capacidad reductora de la albúmina sérica humana y formar nanoaglomerados de oro. Comience a registrar el tiempo de reacción desde cero minutos, cada 20 minutos.

Retire 50 microlitros de cada muestra y transfiera a una placa negra de 384 pocillos. Mida el espectro de emisión con un lector de microplacas. Detenga la agitación magnética después de 100 minutos.

Enfríe los viales de vidrio bajo agua corriente en un fregadero. Represente los espectros de emisión fotónica en todos los momentos para cada muestra con el fin de obtener la cinética de formación de los nanoaglomerados de oro en diferentes condiciones de temperatura. Para preparar los nanoaglomerados de oro templados con albúmina sérica bovina o BSA, coloque un vial de vidrio que contenga una barra magnética microstiradora en la parte superior de un agitador magnético.

Deje la temperatura a temperatura ambiente. Mezcle 200 microlitros de solución de BSA, 200 microlitros de urea y 200 microlitros de solución de cloruro de oro en el vial de vidrio bajo agitación constante. Dos minutos después, agregue 20 microlitros de solución de hidróxido de sodio.

Para activar la capacidad reductora de la BSA y formar nanoaglomerados de oro, comience a registrar el tiempo de reacción como cero minutos. Mida el espectro de emisión fotónica de la mezcla de reacción cada hora. Coloque cinco viales de vidrio, cada uno conteniendo una barra magnética de agitación y previamente etiquetados con un fármaco o HSA pura, sobre un agitador magnético multipunto con control de temperatura.

Agregue 200 microlitros de HSA a cada vial. Luego agregue un microlitro de cada solución de fármaco previamente preparada a los cuatro viales correspondientes. Además, agregue un microlitro de DMSO al interruptor de control en el agitador r.

Establezca la velocidad de rotación en 360 RPM e incube durante una hora para permitir la unión del fármaco a la HSA. Una hora después, agregue 200 microlitros de agua milli Q y 200 microlitros de solución de cloruro de oro a cada vial bajo agitación constante. Establezca la temperatura en 60 grados Celsius bajo agitación constante durante 10 minutos. Después de 10 minutos, agregue 20 microlitros de hidróxido de sodio 1,5 molar a cada vial y comience a registrar el tiempo de reacción en cero minutos.

Las soluciones de reacción conjunta para la medición deben seguir la misma secuencia de adición de fármacos y deben realizarse lo más rápidamente posible para minimizar el efecto del retraso temporal. Aspire rápidamente 50 microlitros de solución de cada vial. Transfiera a una placa negra de 384 pocillos y mida el espectro de emisión. Registre los espectros de emisión de cada muestra cada 10 minutos, obteniendo al menos cuatro espectros en cuatro momentos diferentes.

Repita estos pasos varias veces para obtener resultados con una tendencia consistente. Trace los espectros de emisión fotónica resueltos en el tiempo para cada muestra. Identifique la intensidad máxima de todas las muestras y represéntelas en función del tiempo para comparar la cinética de formación de nanoaglomerados de oro en diferentes plantillas proteicas cargadas con fármacos, con el fin de medir la constante de unión entre cada fármaco y la HSA.

Sustituya las soluciones de fármaco por soluciones de ibuprofeno en cuatro concentraciones diferentes. Diez minutos después, enfríe los viales de vidrio bajo agua corriente en un fregadero. Aspire 50 microlitros de las soluciones anteriores de cada vial hacia una placa negra de 384 pocillos y mida el espectro de emisión.

Repita estos pasos otras dos veces para obtener otros dos conjuntos de resultados a diferentes concentraciones del fármaco antes de detener la agitación magnética. Luego grafique los espectros de emisión fotónica y analice los resultados obtenidos en bruto en cada lote individual. Represente los espectros de emisión fotónica de cada muestra en un software como Origin Pro y determine la intensidad máxima.

Calcule y grafique la intensidad de fluorescencia relativa frente a la concentración del fármaco. Luego, calcule la constante de unión ajustando los datos a un modelo de unión a un solo sitio. Utilice la ecuación de cementina Mics para realizar esto en software como Origin Pro.

Seleccione en el menú análisis el ajuste de curva no lineal, luego seleccione la función hail dentro de la categoría sigmoide de crecimiento en la página de selección de funciones de configuración. Haga clic en ajustar para mostrar. Los resultados ajustados aquí mostrados son resultados representativos de los espectros de emisión fotoeléctrica resueltos en el tiempo de nanoaglomerados de oro producidos bajo diferentes condiciones de desnaturalización proteica.

Puede observarse que los nanoagregados de oro se forman más rápidamente a temperaturas más elevadas. Las condiciones desnaturalizantes con urea también pueden facilitar la síntesis directa de nanoagregados de oro utilizando la proteína BSA como molde. Aquí se muestran resultados típicos de un cribado fluorométrico rápido de fármacos basado en la intensidad de fluorescencia de nanoagregados de oro, utilizando HSA cargada con fármacos como molde.

Cuanto mayor es la intensidad fluorescente, más débil es la fuerza de unión de una molécula de fármaco a la HSA. Estos espectros muestran el efecto de la concentración de carga del fármaco sobre la velocidad de formación de nanoaglomerados de oro fluorescentes dentro de la HSA cargada con ibuprofeno. Cuanto mayor es la concentración del fármaco, menor es la señal fluorescente de los nanoaglomerados de oro resultantes; aquí se muestra un resultado representativo de la determinación de la constante de unión fármaco-proteína.

Se calcula ajustando la intensidad de fluorescencia relativa de los nanoagregados de oro sintetizados en la plantilla de HSA pre-cargada con concentraciones variables del fármaco ibuprofeno, utilizando la ecuación de cementina MICUs. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos para el cribado paralelo de múltiples fármacos, siempre que se realice adecuadamente. Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanoagregados de oro en una proteína cargada con fármacos y de cómo determinar la afinidad de unión de los fármacos a una proteína diana, detectable mediante la señal fluorescente emitida por los nanoagregados de oro resultantes.