Name: Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende un método fluorimétrico rápido para evaluar la afinidad de unión de fármacos a proteínas usando nanoclústeres de oro fluorescentes en plantillas de albúmina sérica humana.

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Y.N.T. desea agradecer a la Agencia para la Ciencia, la Tecnología y la Investigación (A*STAR), Singapur por el apoyo financiero en el marco de la subvención JCO CDA 13302FG063.

Precaución: Por favor, consulte las hojas de datos de seguridad (FDS) de todos los productos químicos implicados antes de su uso. El experimento de detección de drogas implica la síntesis y la manipulación de los nanomateriales, que puede tener riesgos adicionales en comparación con su contraparte granel. Por favor, garantizar todas las medidas de control necesarias para practicar durante todo el experimento, incluyendo el uso de controles de ingeniería (campana extractora de gases) y equipo de protección personal (PPE, por ejemplo, los pantalones de la longitud de seguridad, zapatos cerrados, guantes resistentes a productos químicos y gafas protectoras). 1. Preparación de los reactivos químicos para Pruebas De Drogas <ol><li> Los precursores para la síntesis de Au CN <ol><li> Disolver 30 mg de cloruro de solución de oro (III) (99,99% base metales traza, 30 wt.% En HCl diluido) en 6,9 ml de agua ultrapura para preparar 15 mM de oro (III) solución de cloruro. Precaución: solución de cloruro de oro es corrosivo e irritante. Use PPE adecuado para evitar el contacto directo con los ojos y la piel. </li><li> Dissolve 74 mg de HSA o BSA en 1 ml de agua ultrapura para preparar 74 mg / ml de solución de proteína de valores. </li></ol></li><li> Soluciones de drogas <ol><li> Disolver la cantidad deseada de fármaco, por ejemplo, 1,9 mg para (a) el ibuprofeno, 2,8 mg de (b) la warfarina, 2,3 mg de (c) la fenitoína, y 1,5 mg de (d) sulfanilamida en 20 l de DMSO para preparar 450 mM de soluciones de drogas de las acciones. Nota: se selecciona DMSO como disolvente ya que estos medicamentos son hidrófobos y tienen una mala solubilidad en agua. </li></ol></li><li> Otros reactivos <ol><li> Disolver 600 mg de gránulos de NaOH en 10 ml de agua ultrapura para preparar 1,5 M de solución de NaOH. Disolver 2,4 g de urea en 2 ml de agua ultrapura para preparar 20 M de solución de urea. </li></ol></li></ol> 2. Síntesis de Proteína-Templated Au CN <ol><li> Con plantilla-HSA Au CN (HSA-Au CN) <ol><li> Coloque dos viales de vidrio, conteniendo cada uno una micro barra de agitación magnética en ella, en dos de temperatura independiente de agitación magnética controlableRPR. </li><li> Ajuste la temperatura de un agitador magnético a 60 ° C, y la etiqueta del frasco de vidrio en la parte superior de la misma como &quot;60 ° C&quot;; mientras que el otro agitador magnético se mantiene a temperatura ambiente (RT) donde el vial de vidrio en la parte superior de ella se etiqueta como &quot;RT&quot;. </li><li> Añadir 200 l de solución de HSA, 200 l de agua ultrapura, y 200 l de solución de oro cloruro de (III) a cada vial bajo agitación constante (establecido como 360 rpm a menos que se especifique lo contrario) para permitir la encapsulación de Au iones dentro de la plantilla de proteínas. </li><li> 2 min después, añadir 20 l de solución de NaOH a cada vial de manera que para activar la capacidad reductora de HSA en la formación de Au NCs y empezar a grabar el tiempo de reacción como 0 min. </li><li> Cada 20 min, dibujar 50 l de soluciones de cada uno de la muestra a una placa de color negro de 384 pocillos y medir el espectro de emisión con un lector de microplacas. La configuración de exploración típica: λ ex = 370 nm, λ em = 410-850 nm. </li><li> Detenga el agitador magnético después de 100 min. </li><li> Enfriar los frascos de vidrio con agua corriente en un fregadero. Precaución: Los viales de vidrio están calientes. Use guantes resistentes al calor para evitar la quema. </li><li> Trazar los espectros de fotoemisión en todo momento para cada muestra para adquirir la cinética de formación de Au NCs en diferentes condiciones de temperatura. </li></ol></li><li> Con plantilla-BSA Au CN (BSA-Au CN) <ol><li> Colocar un vial de vidrio que contiene un micro barra de agitación magnética en la parte superior de un agitador magnético. Deja la temperatura como la temperatura ambiente. </li><li> Mezclar 200 l de solución de BSA, 200 l de urea, y 200 l de solución de cloruro de oro (III) en el vial de vidrio con agitación constante. </li><li> 2 min después, añadir 20 l de solución de NaOH para activar la capacidad reductora de BSA para formar Au NCs y empezar a grabar el tiempo de reacción como 0 min. Medir el espectro de fotoemisión de la mezcla de reacción por hora. Nota: se mide el espectro de fotoemisión de BSA-Au CNcon menos frecuencia debido a que la tasa de formación de BSA-au NCs es más lenta que la de HSA-Au a la misma temperatura debido a la menor eficacia de urea para desplegar la proteína. </li><li> Detenga el agitador magnético después de 7 h. Trazar los espectros de fotoemisión en todo momento para ver la cinética de formación de Au CN por desnaturalización urea. </li></ol></li></ol> Proyección 3. Pequeño Molecular de Drogas <ol><li> Pantalla afinidad de unión relativa de los diferentes fármacos moleculares pequeños a HSA <ol><li> Coloque cinco viales de vidrio, conteniendo cada uno una barra de agitación magnética en ella, en la parte superior de un agitador magnético multipunto temperatura controlable. Etiqueta de estos viales como A, B, C y D, respectivamente, para cada fármaco, es decir, ibuprofeno, warfarina, fenitoína y sulfanilamida. Etiqueta de la una con HSA puro como control. </li><li> Añadir 200 l de HSA a cada vial. Añadir 1 l de solución de fármaco a las cuatro viales correspondientes. Añadir 1 l de DMSO al control. Encender el agitador y ajustar la velocidad de giro de 360rpm e incubar durante 1 hora para permitir la unión a HSA para completar la droga. </li><li> 1 hr después, añadir 200 l de agua Milli-Q y 200 l de solución de cloruro de oro (III) a cada vial bajo agitación constante. Ajuste la temperatura a 60 ° C bajo agitación constante durante 10 min. Añadir 20 l de NaOH 1,5 M a cada vial y empezar a grabar el tiempo de reacción como 0 min. </li><li> Dibujar rápidamente 50 l de solución de cada vial a un plato negro 384 pocillos y medir el espectro de emisión (resultados etiquetados como 0 min). Registre los espectros de emisión de cada muestra cada 10 min. Recoge al menos cuatro espectros a cuatro tiempo diferentes, es decir 0, 10, 20, y 30 min. </li><li> Repita los pasos 3.1.1 - 3.1.4 varias veces para obtener resultados con una tendencia constante. Detenga el agitador magnético. </li><li> Trazar los espectros de fotoemisión resuelta en el tiempo para cada muestra (a - d, y control). Identificar la intensidad máxima de todas las muestras y complot contra el tiempo para comparar la cinética de formación de Au CN en diferentes plantillas de proteínas cargadas con fármaco. </li></ol></li><li> Medir la constante de unión de un fármaco específico para HSA <ol><li> Repita los pasos 3.1.1 - 3.1.4. Reemplazar la solución de fármaco con soluciones de ibuprofeno a cuatro concentraciones diferentes (incluyendo una muestra de control usando HSA sólo sin carga de fármaco). Etiquetar el vial de vidrio de acuerdo con la concentración de fármaco correspondientemente. </li><li> 10 minutos más tarde, enfriar los viales de vidrio con agua corriente en un fregadero. Precaución: Los viales de vidrio están calientes. Use guantes resistentes al calor para evitar la quema. </li><li> Dibujar 50 l de las soluciones anteriores de cada vial a un plato negro 384 pocillos y medir el espectro de emisión. </li><li> Repita los pasos 3.2.1 - 3.2.3 dos veces más para obtener otros dos conjuntos de resultados a diferentes concentraciones del fármaco. </li><li> Detenga el agitador magnético. Trazar los espectros de fotoemisión y analizar los resultados. <ol><li> Para los datos brutos obtenidos en cada lote individual, trazar los espectros de fotoemisión de cadamuestra en el software como el software OriginPro y averiguar la intensidad máxima. </li><li> Calcular y representar gráficamente la intensidad de fluorescencia relativa [(I 0 - I) / I 0] en contra de la concentración de fármaco, donde I y I 0 refiero a la intensidad de fluorescencia de Au NCs formado en HSA y HSA pura cargada de fármaco, respectivamente. </li><li> Calcula la constante de unión por ajuste de los datos a un modelo único sitio de unión usando la ecuación de Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), donde R max indica la señal de respuesta máxima, C es la concentración de ligando y K D es la constante de unión. Realice esto en software como OriginPro. Seleccione el menú de ajuste no lineal Análisis de la curva de ajuste, a continuación, seleccione la función Hill Crecimiento / categoría sigmoidal. En la configuración: página Selección de Función, haga clic en Ajustar para mostrar los resultados de armarios. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Shortridge, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nuclear+Magnetic+Resonance+Affinity+Screening+Methods+for+Functional+Annotation+of+Proteins+and+Drug+Discover%22">Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover</a>. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios pasos críticos que deben ser destacados en este método. En el protocolo de la detección de la afinidad de unión relativa de los diferentes fármacos moleculares pequeños, Etapas 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 y son críticos para obtener buenos resultados que muestran tendencia constante para la fuerza de unión relativa. En estos pasos, las acciones de adición de productos químicos y el dibujo soluciones de reacción para la medición deben ser lo más rápidamente posible para minimizar el efecto tiempo de retardo y la misma...

Albúminas séricas tales como albúmina de suero humano (HSA) y albúmina de suero bovino (BSA) son la proteína más abundante en el plasma y juegan un papel vital en el mantenimiento de la presión osmótica del compartimiento de sangre. También son reconocidos como proteínas portadoras para las pequeñas moléculas de baja solubilidad en agua, tales como esteroides, ácidos grasos, hormonas tiroideas, y una amplia variedad de fármacos. La propiedad de unión (por ejemplo, sitios de unión, afinidad o fuerza de unión) de estas moléculas a suero albúminas forma un tema importante en la farmacocinética. 1-4 Varios métodos analíticos se han desarrollado para estudiar las propiedades de unión de diferentes fármacos al suero albúminas, tales como cristalografía de rayos X, 5,6 resonancia magnética nuclear (RMN), 7-11 y resonancia de plasmón superficial (SPR), 12,13 etc. Sin embargo, estos métodos están limitados ya sea por un proceso de análisis tedioso y requiere mucho tiempo (por ejemplo, el crecimiento del cristal único para Crystallo de rayos Xestudio gráfico), requerimiento de equipo especializado y caro (SPR), o en necesidad de etiquetado de isótopos costosa (RMN) para la detección. Por tanto, es altamente deseable desarrollar métodos alternativos para la detección de drogas molecular pequeña de una manera rápida y directa, y rentable. Nanoclusters oro (Au CN) son un tipo especial de nanomaterial, que contienen varias decenas de átomos de metal con tamaños menores de 2 nm. 14-17 Ellos han atraído amplios intereses de investigación debido a su estructura electrónica discreta y dependiente del tamaño, 18, 19 y molecular como absorciones y emisiones. 20-23 Tales propiedades materiales únicos, en particular, la fuerte fluorescencia, han encontrado diversas aplicaciones tales como detección y proyección de imagen en los sistemas biológicos. ultrapequeño de 24-32 fluorescente Au NCs se puede sintetizar utilizando proteínas funcionales, tales como albúminas séricas, como plantilla. 33 En un típico síntesis de proteínas con plantilla de<html> Au NCs, una cierta cantidad de sales de Au están encapsulados dentro de la primera proteína y posteriormente reducida por la propia proteína. La capacidad reductora de la proteína se atribuye a Constituyente residuos de aminoácidos funcionales (por ejemplo, tirosina) que se pueden activar mediante el aumento del pH de la solución a alcalino. Despliegue de la estructura de la proteína se considera como un paso fundamental para la formación de Au CN. Esto es porque en una proteína desplegada, los grupos funcionales más reductores pueden estar expuestos a las sales de Au encapsulados. Desplegamiento de la proteína se puede lograr mediante tratamiento térmico o la exposición a agentes desnaturalizantes. La introducción de pequeños drogas moleculares también puede afectar el proceso de desarrollo, es decir, la modificación de la temperatura de desnaturalización punto medio y la entalpía de despliegue. 34,35 El efecto de todos estos factores, a su vez, puede ser reflejada por la cinética de formación de fluorescente Au CN y se manifiesta en la intensidad de fluorescencia de las resultantes Au CN. 36 e_content &quot;&gt; Este video demuestra el método de cribado de fármacos mediante la síntesis de Au NCs en las proteínas de albúmina cargadas con fármaco a una temperatura más alta (60 ° C) o en presencia de agentes desnaturalizantes (por ejemplo, urea). La intensidad de fluorescencia de resultante Au NCs es la lectura de la señal. En primer lugar, Au NCs se sintetizan en HSA y BSA plantillas tratadas a 60 ° C o en presencia de urea para mostrar cómo desplegamiento de la proteína (inducida por tratamiento térmico o desnaturalizantes) afecta a la cinética de formación de Au NCs. En segundo lugar, Au NCs se sintetizan en las plantillas de proteínas precargado con diferentes fármacos, y el efecto de carga de fármaco en las intensidades de fluorescencia relativas de resultante Au NCs se estudia, que proporcionan la medida de la fuerza de unión relativa. Finalmente, el protocolo de cribado Au NC-fármaco se modifica para medición cuantitativa de la proteína-fármaco constante de unión (K D) mediante la variación del contenido de fármaco precargado en la proteína de una concentración fija.

<table><tbody><tr><td>Solución de cloruro de oro (III), 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484385</td><td>Corrosivo, irritante</td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana, 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1887</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofeno, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4883&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>warfarina, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2250</td><td></td></tr><tr><td>fenitoína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1139</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamida, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>221465</tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>IKA</td><td>RT5</td><td></td>Lector</tr> de <tr><td>microplacas</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 384 pocillos</td><td>Corning</td> 5 ml pipeta <td></td><td></td></tr><tr><td>de desplazamiento de aire</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; l pipeta de desplazamiento de aire</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &#956; l pipeta de desplazamiento de aire</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5,000 &#956; l Puntas</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>1,000 &#956; l Consejos</td><td></td><td></td><td></td>de Eppendorf</tr><tr><td>100 &#956; l Puntas</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>Micro tubo de 1,5 ml</td><td>Frasco de vidrio Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 20 ml con tapón</td><td></td><td></td><td></td>de rosca</tr><tr><td>Frasco de vidrio de 4 ml con tapón</td><td></td><td></td><td></td> de rosca</tr></tbody></table>

una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-targeting pequeña molécula de drogas

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Se demuestra un nuevo método de detección de drogas para determinar la afinidad de unión de pequeñas moléculas de fármacos a una proteína diana mediante la formación de nanoclusters fluorescentes oro (Au CN) dentro de la proteína cargada con fármaco, basados ​​en la señal diferencial de fluorescencia emitida por el Au NCs. Proteínas tales como albúmina de suero de albúmina humana (HSA) y albúmina de suero bovino (BSA) se seleccionan como las proteínas modelo. Cuatro pequeños fármacos moleculares (por ejemplo, ibuprofeno, warfarina, fenitoína y sulfanilamida) de diferentes afinidades de unión a las proteínas de albúmina se ponen a prueba. Se encontró que la tasa de formación de Au NCs fluorescentes dentro de la proteína albúmina cargadas de fármaco en condiciones desnaturalizantes (es decir, 60 ° C o en presencia de urea) es más lento que el formado en la proteína prístina (sin drogas). Por otra parte, la intensidad fluorescente de la CN como formado se encontró que se correlaciona inversamente con las afinidades de unión de estos fármacos a las proteínas de albúmina. Particularmente,cuanto mayor es la afinidad de unión a proteína de drogas, más lenta será la velocidad de formación de Au CN, y por lo tanto se observa una intensidad de fluorescencia inferior de la resultante Au NCs. La intensidad de fluorescencia de la resultante Au NCs por lo tanto, proporciona una medida sencilla de la fuerza de unión relativa de los diferentes fármacos ensayados. Este método también es extensible para medir la constante de unión específica de proteína-fármaco (K D) simplemente variando el contenido de fármaco precargado en la proteína a una concentración de proteína fija. Los resultados medidos coinciden bien con los valores obtenidos utilizando otros métodos de prestigio pero más complicados.

Desplegamiento de la proteína es un procedimiento importante para la formación de proteínas con plantilla Au NCs porque los grupos funcionales más reactivos (por ejemplo, residuos de tirosina) de una proteína pueden estar expuestos a reducir los iones Au encapsulados y por lo tanto acelerar la velocidad de formación de Au NCs. Agentes de calefacción y de desnaturalización externa son dos medios comunes para promover el proceso de desarrollo de proteínas. La Figura 1 muestra el efecto del calent...

Se presenta un protocolo para el cribado de fármacos moleculares pequeños basado en la síntesis in situ de nanoclusters de oro fluorescentes ultrapequeños (Au NCs) utilizando proteínas cargadas con fármacos como plantilla. Este método es sencillo para determinar la afinidad de unión de los fármacos a una proteína diana mediante una señal fluorescente visible emitida por los Au NC con plantilla de proteínas.

Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

El objetivo general de este nuevo método de cribado de fármacos basado en mediciones fluorométricas consiste en determinar la afinidad de unión de pequeñas moléculas farmacéuticas a una proteína diana mediante la formación de nanoaglomerados fluorescentes de oro dentro de una plantilla proteica cargada con el fármaco. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de fármacos dirigidos a proteínas, como la forma en que la fuerza de unión de las moléculas farmacéuticas puede afectar la estabilidad de las proteínas frente al desdoblamiento, lo que conduce a la formación de nanoaglomerados de oro fluorescentes con distintas intensidades. La principal ventaja de esta técnica es que permite convertir una proteína diana en un biosensor fluorescente, lo que posibilita el cribado rápido de fármacos de bajo peso molecular sin necesidad de instrumentos sofisticados ni de pasos tediosos de marcado.La combinación de mis propios conocimientos, así como del descubrimiento de la coautora, quien identificó que la proteína tiene un efecto de estabilización distinto sobre la plasmonica, inspiró la idea de este método. Comience este procedimiento con la preparación de los reactivos químicos para la selección de fármacos, tal como se describe en el protocolo escrito, para preparar los nanoaglomerados de oro templados con albúmina sérica humana o HSA. Coloque dos viales de vidrio, cada uno conteniendo una barra magnética microscópica, sobre dos agitadores magnéticos independientes con control de temperatura.Configure la temperatura de un agitador magnético a 60 grados Celsius. A continuación, agregue 200 microlitros de solución de albúmina sérica humana, 200 microlitros de agua ultrapura y 200 microlitros de solución de cloruro de oro a cada vial bajo agitación constante para permitir la encapsulación de iones de oro dentro de la plantilla proteica; dos minutos después, agregue 20 microlitros de solución de hidróxido de sodio a cada vial con el fin de activar la capacidad reductora de la albúmina sérica humana y formar nanoaglomerados de oro. Comience a registrar el tiempo de reacción desde cero minutos, cada 20 minutos.Retire 50 microlitros de cada muestra y transfiera a una placa negra de 384 pocillos. Mida el espectro de emisión con un lector de microplacas. Detenga la agitación magnética después de 100 minutos.Enfríe los viales de vidrio bajo agua corriente en un fregadero. Represente los espectros de emisión fotónica en todos los momentos para cada muestra con el fin de obtener la cinética de formación de los nanoaglomerados de oro en diferentes condiciones de temperatura. Para preparar los nanoaglomerados de oro templados con albúmina sérica bovina o BSA, coloque un vial de vidrio que contenga una barra magnética microstiradora en la parte superior de un agitador magnético.Deje la temperatura a temperatura ambiente. Mezcle 200 microlitros de solución de BSA, 200 microlitros de urea y 200 microlitros de solución de cloruro de oro en el vial de vidrio bajo agitación constante. Dos minutos después, agregue 20 microlitros de solución de hidróxido de sodio.Para activar la capacidad reductora de la BSA y formar nanoaglomerados de oro, comience a registrar el tiempo de reacción como cero minutos. Mida el espectro de emisión fotónica de la mezcla de reacción cada hora. Coloque cinco viales de vidrio, cada uno conteniendo una barra magnética de agitación y previamente etiquetados con un fármaco o HSA pura, sobre un agitador magnético multipunto con control de temperatura.Agregue 200 microlitros de HSA a cada vial. Luego agregue un microlitro de cada solución de fármaco previamente preparada a los cuatro viales correspondientes. Además, agregue un microlitro de DMSO al interruptor de control en el agitador r.Establezca la velocidad de rotación en 360 RPM e incube durante una hora para permitir la unión del fármaco a la HSA. Una hora después, agregue 200 microlitros de agua milli Q y 200 microlitros de solución de cloruro de oro a cada vial bajo agitación constante. Establezca la temperatura en 60 grados Celsius bajo agitación constante durante 10 minutos. Después de 10 minutos, agregue 20 microlitros de hidróxido de sodio 1,5 molar a cada vial y comience a registrar el tiempo de reacción en cero minutos.Las soluciones de reacción conjunta para la medición deben seguir la misma secuencia de adición de fármacos y deben realizarse lo más rápidamente posible para minimizar el efecto del retraso temporal. Aspire rápidamente 50 microlitros de solución de cada vial. Transfiera a una placa negra de 384 pocillos y mida el espectro de emisión. Registre los espectros de emisión de cada muestra cada 10 minutos, obteniendo al menos cuatro espectros en cuatro momentos diferentes.Repita estos pasos varias veces para obtener resultados con una tendencia consistente. Trace los espectros de emisión fotónica resueltos en el tiempo para cada muestra. Identifique la intensidad máxima de todas las muestras y represéntelas en función del tiempo para comparar la cinética de formación de nanoaglomerados de oro en diferentes plantillas proteicas cargadas con fármacos, con el fin de medir la constante de unión entre cada fármaco y la HSA.Sustituya las soluciones de fármaco por soluciones de ibuprofeno en cuatro concentraciones diferentes. Diez minutos después, enfríe los viales de vidrio bajo agua corriente en un fregadero. Aspire 50 microlitros de las soluciones anteriores de cada vial hacia una placa negra de 384 pocillos y mida el espectro de emisión.Repita estos pasos otras dos veces para obtener otros dos conjuntos de resultados a diferentes concentraciones del fármaco antes de detener la agitación magnética. Luego grafique los espectros de emisión fotónica y analice los resultados obtenidos en bruto en cada lote individual. Represente los espectros de emisión fotónica de cada muestra en un software como Origin Pro y determine la intensidad máxima.Calcule y grafique la intensidad de fluorescencia relativa frente a la concentración del fármaco. Luego, calcule la constante de unión ajustando los datos a un modelo de unión a un solo sitio. Utilice la ecuación de cementina Mics para realizar esto en software como Origin Pro.Seleccione en el menú análisis el ajuste de curva no lineal, luego seleccione la función hail dentro de la categoría sigmoide de crecimiento en la página de selección de funciones de configuración. Haga clic en ajustar para mostrar. Los resultados ajustados aquí mostrados son resultados representativos de los espectros de emisión fotoeléctrica resueltos en el tiempo de nanoaglomerados de oro producidos bajo diferentes condiciones de desnaturalización proteica.Puede observarse que los nanoagregados de oro se forman más rápidamente a temperaturas más elevadas. Las condiciones desnaturalizantes con urea también pueden facilitar la síntesis directa de nanoagregados de oro utilizando la proteína BSA como molde. Aquí se muestran resultados típicos de un cribado fluorométrico rápido de fármacos basado en la intensidad de fluorescencia de nanoagregados de oro, utilizando HSA cargada con fármacos como molde.Cuanto mayor es la intensidad fluorescente, más débil es la fuerza de unión de una molécula de fármaco a la HSA. Estos espectros muestran el efecto de la concentración de carga del fármaco sobre la velocidad de formación de nanoaglomerados de oro fluorescentes dentro de la HSA cargada con ibuprofeno. Cuanto mayor es la concentración del fármaco, menor es la señal fluorescente de los nanoaglomerados de oro resultantes; aquí se muestra un resultado representativo de la determinación de la constante de unión fármaco-proteína.Se calcula ajustando la intensidad de fluorescencia relativa de los nanoagregados de oro sintetizados en la plantilla de HSA pre-cargada con concentraciones variables del fármaco ibuprofeno, utilizando la ecuación de cementina MICUs. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos para el cribado paralelo de múltiples fármacos, siempre que se realice adecuadamente. Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanoagregados de oro en una proteína cargada con fármacos y de cómo determinar la afinidad de unión de los fármacos a una proteína diana, detectable mediante la señal fluorescente emitida por los nanoagregados de oro resultantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este video, describimos la técnica de anisotropía de fluorescencia para estudiar las interacciones entre la proteína del síndrome de Shwachman-diamond (SBDS) marcada con fluoróforos y la 1 GTPasa similar al factor de elongación (EFL1). En la incubación de proteínas SBDS con concentraciones gradualmente crecientes de EFL1, se observa un aumento constante de la anisotropía, lo que indica una interacción exitosa entre las dos proteínas.

Detección de interacciones proteína-proteína basada en anisotropía de fluorescencia

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

La fluorimetría diferencial de barrido es un método ampliamente utilizado para el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de interacciones con proteínas. Aquí, presentamos un método sencillo para ampliar estos análisis para proporcionar una estimación de la constante de disociación entre una molécula pequeña y su proteína asociada.

Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

En este estudio, mejoramos las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar.

Un ensayo semicuantitativo de estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de drogas (DARTS, por sus) para estudiar la interacción con Rapamicina/mTOR

Este estudio tenía como objetivo presentar una estrategia para identificar las interacciones entre fármacos y péptidos. La estrategia consiste en la biopanning de péptidos cortos que reconocen fármacos basados en un biosensor de micropeso de cristal de cuarzo (QCM), seguido de análisis bioinformática para evaluar cuantitativamente la información obtenida para el reconocimiento de fármacos y la anotación de los sitios de unión a fármacos sobre proteínas.

Estrategia de análisis bioaformático y bioinformática basada en biosensores para la validación global de interacciones entre fármacos y proteínas

El monitoreo de los cambios en la temperatura de fusión de una proteína objetivo(es decir,el ensayo de cambio térmico, TSA) es un método eficiente para examinar bibliotecas de fragmentos de unos pocos cientos de compuestos. Presentamos un protocolo TSA que implementa la fluorimetría de escaneo nano-diferencial asistida por robótica (nano-DSF) para monitorear la fluorescencia intrínseca de triptófano y la retrodisparión de luz para la detección de fragmentos.

Fluorimetría de barrido nanodes diferencial para el cribado en el descubrimiento de plomo basado en fragmentos

El presente protocolo describe un procedimiento para realizar cromatografía de exclusión de tamaño fluorescente (FSEC) en proteínas de membrana para evaluar su calidad para el análisis funcional y estructural posterior. Se presentan resultados representativos de FSEC recopilados para varios receptores acoplados a proteínas G (GPCR) en condiciones de solubilización detergente y sin detergente.

Evaluación rápida de la calidad de la proteína de membrana mediante cromatografía de exclusión de tamaño fluorescente

El experimento utilizado aquí muestra un método de acoplamiento molecular combinado con un ensayo de desplazamiento térmico celular para predecir y validar la interacción entre moléculas pequeñas y proteínas objetivo.

Predicción y validación de dianas proteicas de compuestos de moléculas pequeñas

El ensayo cuantitativo de anclaje irreversible (qIT) es un método basado en fluorescencia para identificar fragmentos covalentes que interactúan selectivamente con una proteína objetivo. Aquí, se describe un protocolo detallado para describir el ensayo qIT, con resultados de ejemplo incluidos.

Cribado de fragmentos covalentes mediante el ensayo cuantitativo de anclaje irreversible

Este protocolo introduce una metodología de cribado fluorométrico optimizada para identificar inhibidores naturales de productos o pequeñas moléculas en la síntesis de proteínas. Su viabilidad la hace adecuada tanto para la enseñanza de grado en técnicas de descubrimiento de fármacos como para su implementación en campañas de química medicinal.

Un protocolo basado en fluorescencia para el cribado preliminar de inhibidores de síntesis de proteínas de fuentes naturales

Aprende un método fluorimétrico rápido para evaluar la afinidad de unión de fármacos a proteínas usando nanoclústeres de oro fluorescentes en plantillas de albúmina sérica humana.

Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas

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