Usando Ex Vivo Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

El objetivo general de este procedimiento es examinar los efectos de los inhibidores de moléculas pequeñas en el desarrollo de órganos fetales utilizando una técnica de cultivo de gotas ex vivo. Esto se logra abriendo primero el peritoneo de una rata embarazada y extrayendo el embrión que contiene útero. A continuación, los embriones se extraen del útero y se liberan de la yema y los sacos amnióticos.

A continuación, se disecciona el complejo goad me neph y se aísla del embrión. Por último, el complejo Meris se cultiva en una gota con o sin un inhibidor de molécula pequeña. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia se utiliza para mostrar cambios en la arquitectura de los órganos utilizando anticuerpos específicos del tipo de célula.

Por lo tanto, la ventaja de nuestro cultivo de gotas verticales ex vivo de todo el órgano en comparación con, por ejemplo, las líneas de cultivo celular, es que tiene la ventaja de tener una estructura tridimensional que da lugar a interacciones celulares debido a la localidad, así como a la señalización matricial extracelular que puede ser importante para la formación y el modelado de órganos. Además, nuestra técnica de gota vertical permite utilizar menos reactivos, lo que reduce el costo y la toxicidad potencial debido a los efectos secundarios. Esta es una ventaja sobre otras técnicas de órgano completo, y aún permite la difusión de agentes farmacológicos al órgano objetivo.

Aunque esta técnica puede proporcionar información sobre el desarrollo vascular de los testículos fetales, también se puede aplicar a otros órganos fetales como el pulmón, y también podemos utilizarla para investigar diversos procesos biológicos. Existen otras vías de señalización celular durante el desarrollo fetal At E 11.5. Después de sacrificar a la rata embarazada, según el texto, use etanol al 70% para rociar el abdomen con tijeras finas.

Haga una incisión en forma de V para abrir la piel del abdomen y el peritoneo, y retire el colgajo de tejido para exponer los órganos anteriores. Localice los ovarios en ambos extremos del cuerno uterino, luego con unas tijeras corte el ovario y el tejido conectivo para separar el útero que contiene los embriones del cuerpo de la madre. A continuación, abra la pared uterina cortando suavemente el lado opuesto a la placenta, exponiendo los sacos vitelinos.

Tenga cuidado de no perforar el saco vitelino para evitar dañar o perder embriones. A continuación, corte cerca de la placenta para extraer el embrión que contiene sacos vitelinos y colóquelos en un plato que contenga PBS con calcio y magnesio, lo que ayudará a soportar las moléculas de adhesión celular para mantener la arquitectura del tejido y evitar que el tejido se pegue a las herramientas Con pinzas, retire el saco vitelino y el amnios del embrión perforando cuidadosamente el saco vitelino para crear un agujero en el que el embrión pueda deslizarse. Una vez que un embrión está fuera del saco vitelino, se corta el cordón umbilical.

A partir de este momento, utilice un microscopio ubicado en una campana de cultivo de tejidos estéril. Retire la cabeza del embrión usando fórceps para pellizcar a cada lado del cuello, deseche la cabeza, retire la cola y colóquela en un nuevo tubo de microcentrífuga para el análisis X-Y-P-C-R para determinar el sexo del embrión. Ahora asegure el embrión en posición supina contra el fondo de la placa de cultivo usando un par de pinzas para sujetar las axilas del embrión con otro par de pinzas.

Retire la piel que cubre el abdomen y extraiga suavemente el hígado, los intestinos y otros órganos para exponer la pared posterior del cuerpo donde se encuentra la cresta urogenital. Use las pinzas para colocar debajo de la cresta urogenital abriendo cuidadosamente las pinzas y levantándolas. Extirpa la cresta urogenital.

Tenga cuidado de no dañar las gónadas. Transfiera la cresta urogenital a una placa de C-D-M-E-M para aclimatar el tejido al medio utilizando agujas de calibre 27 para separar el complejo Sphs de la gónada del resto del puente urogenital. Utilice una aguja para cortar presionando hacia abajo y la otra para guiar el tejido correctamente para permitir una separación óptima para el cultivo.

La gónada con un inhibidor de molécula pequeña ajustó dos pipetas de 20 microlitros a 15 microlitros cada una usando una cuchilla de afeitar limpia y esterilizada. Corte aproximadamente uno o dos milímetros de una de las puntas de pipeta de barrera para la transferencia de las gónadas y la adición del control C-D-M-E-M. Alinee las gónadas con su eje largo paralelo a la punta de la pipeta para que puedan pipetearse fácilmente con una punta de corte Etiquete un lado de la tapa de un plato de 35 milímetros como la gota de control y el otro como la gota que contiene el fármaco.

Asegúrese de que las etiquetas de las tapas coincidan con las etiquetas del tejido de la cola que contiene tubos de microcentrífuga. Pipetear 15 microlitros de C-D-M-E-M que contienen una sola gónada en una gota en el párpado. Teniendo cuidado de que las gónadas no se peguen al interior de la punta de la pipeta y repita con la segunda gota en el otro lado.

Compruebe al microscopio que las gónadas se han transferido a la gotita designada como control. Utilice la pipeta de control para añadir 15 microlitros adicionales de C-D-M-E-M que contenga DMSO para llegar a una gota de 30 microlitros con la otra gota. Utilice la pipeta designada para el medicamento para agregar 15 microlitros de TKI dos en C-D-M-E-M usando la pipeta.

Extienda las gotas en un patrón circular en expansión hasta que tengan aproximadamente 15 a 18 milímetros de diámetro y la gónada se encuentre aproximadamente en el medio. Oriente la gónada de modo que quede de lado y el aguijón y los messines sean fácilmente distinguibles. Oriente los pulmones de modo que los dos lóbulos queden planos y se mantengan en su lugar por la tensión superficial sin tocarse entre sí.

Coloque con cuidado la tapa de la placa de cultivo con las gotas en posición vertical y plana sobre la superficie del agua en una placa humidificadora grande, asegurándose de que no haya burbujas atrapadas debajo y que no entre agua en la tapa. Para crear una pequeña cámara humidificada, cubra inmediatamente el plato grande con su tapa, asegurándose de que las tapas de los platos pequeños puedan moverse libremente en el plato más grande y que pueda producirse el intercambio de aire. Una vez que las dos tapas pequeñas se colocan en la cámara, coloque inmediatamente la cámara en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante 48 horas.

Realizar PCR e inmunofluorescencia según el protocolo de texto. Cuando se cultivan utilizando el sistema de cultivo por gotas Exvivo, los complejos de gona sphs fetales tienen una alta tasa de supervivencia, como se muestra aquí. Las comparaciones de las gónadas E 11.5 en la incubación inicial frente a las 24 o 48 horas en cultivo revelan un cambio dramático en la forma de la gónada y la aparición de estructuras de cordón en forma de rayas en la gónada XY de control, como se ve aquí.

El sistema de cultivo de gotitas puede recrear eventos de diferenciación de testículos ex vivo, ya que es posible visualizar nueve células de Sertoli positivas para SOX en gónadas XY que se forman en cordones en forma de tubo y vasculatura que se forman en todo el órgano. En los pulmones, el cultivo de 48 horas da como resultado un aumento de la ramificación de las ramas epiteliales dobles positivas de SOX nine eco herrin. Si bien hay cierto aumento de células apoptóticas en los pulmones, en las mismas condiciones de cultivo, se observan niveles similares de apoptosis en el cultivo de control y en el útero.

Las gónadas sugieren que la gónada es particularmente susceptible a las condiciones de cultivo. Para examinar los efectos de la vascularización y la remodelación vascular en la morfogénesis de los testículos, se utilizó el inhibidor de molécula pequeña TKI dos, que bloquea la actividad de los receptores de VEGF. Los resultados demuestran que la interrupción de la remodelación vascular en el testículo fetal es efectiva en el sistema de cultivo de gotas, y los defectos posteriores en la morfogénesis de la médula testicular se pueden visualizar siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la PCR cuantitativa en tiempo real, la secuenciación de ARN de próxima generación o la citometría de flujo, para responder a preguntas adicionales, como cómo afectan los diferentes reactivos farmacológicos a la expresión de proteínas o genes de interés. Además, podemos utilizar imágenes en vivo de lapso de tiempo para visualizar la dinámica celular en tiempo real si se utilizan embriones fluorescentes transgénicos. Además, se dispone de una amplia gama de reactivos para dirigirse a las vías de señalización candidatas que pueden estar implicadas en la organogénesis fetal.

Estas técnicas nos ayudarán a comprender los mecanismos subyacentes que impulsan el desarrollo fetal. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de realizar cultivos de gotitas verticales ex vivo de todo el órgano para dilucidar las vías de señalización durante la organogénesis fetal. Esta técnica implica la disección de embriones a mitad de gestación, el aislamiento de los órganos diana y la preparación de cultivos de gotitas en posición vertical para la incubación de estos órganos con reactivos farmacéuticos.