Name: Usando Ex Vivo Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprende el cultivo ex vivo en gota vertical para estudiar la organogénesis fetal en ratón. Este método permite examinar inhibidores de moléculas pequeñas y analizar cambios en la arquitectura de órganos mediante inmunofluorescencia.

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Los autores fueron apoyados por: una Beca de Investigación CancerFree KIDS, un Premio Basil O'Connor Starter Scholar de March of Dimes (#5-FY14-32), un Premio de Subvención del Fideicomisario del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC); un Premio de Innovación en Investigación y Financiamiento Piloto de CCHMC; y fondos de desarrollo de CCHMC. Los autores también reconocen al laboratorio Capel por la optimización inicial de esta técnica.

Todos los ratones utilizados en estos estudios fueron ratones CD-1 obtenidos de Charles River Laboratories. Experimentos de cultivo anteriores también se han realizado en otras cepas, tales como C57BL / 6J (datos no presentados), pero cualquier cepa se puede utilizar. Hembras adultas embarazadas fueron de aproximadamente 2-3 meses de edad y se sacrificaron mediante inhalación de CO2, seguido por dislocación cervical y toracotomía bilateral antes de la eliminación del embrión. Los animales fueron alojados de conformidad con las directrices del NIH, y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati. 1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo y Platos <ol><li> Preparar una solución de etanol al 70%. Agua desionizada Autoclave (para la fabricación de cámaras humidificadas y para hacer soluciones / dilución). Esterilizar las herramientas de disección (pinzas, tijeras, y 27 g jeringas de aguja) rociando abajo con etanol al 70%. </li><li> PrepararSolución salina tamponada con fosfato 10X (PBS) que contiene calcio y magnesio (80 g NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4, 6,75 ml de 1 M CaCl 2, 3,75 ml de 1 M de MgCl 2 ). Revuelva para disolver en 1 l de agua estéril en autoclave y luego filtrar con papel de filtro. Diluir 10 veces con agua para hacer 1X PBS. </li><li> Heat inactivar suero bovino fetal (FBS) a 55 ° C durante 30 min y el filtro de esterilizar con un filtro de jeringa de 0,22 micras. </li><li> Preparar 38 ml 1X medio de cultivo completo (llamado DMEM completo, cDMEM), que consiste en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), 10% filtró dilución FBS inactivado por calor y un centésimo de penicilina-estreptomicina de valores. Esto por lo general se debe utilizar fresco, pero se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes. </li><li> Reconstituir el VEGFR tirosina quinasa Inhibidor II (TKI II) en DMSO para una concentración de solución madre de 5 mg / ml, y diluir la acción con cDMEM para hacer una solución de trabajo. El aire acondicionado de últimacentración para este estudio es 1,875 g / ml en cDMEM. De acuerdo a las recomendaciones de la empresa, soluciones de reserva son estables durante un máximo de 6 meses a -20 ° C. En cuanto a las soluciones de trabajo, hacer fresco y utilización en el mismo día. Nota: La concentración de este fármaco en la solución de trabajo debe ser de dos veces mayor que la concentración final deseada (ya que se diluirá de dos veces en la gotita). Al mismo tiempo, preparar el mismo volumen de cDMEM que contiene el mismo volumen de DMSO para el tratamiento de &quot;control&quot;. </li><li> Preparar los reactivos de digestión cola (NaOH 50 mM y 1 M Tris-HCl [pH 8,0]) por separado en agua destilada. </li><li> Hacer un balance de los cebadores de PCR XY 25 M (XY adelante 5&#39;-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 &#39;y 5&#39; XY Reverse-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3 &#39;) junto con agua libre de nucleasa. </li><li> Preparar tampón 50X TAE (242 g Base Trizma, 57,1 ml de ácido acético glacial, 100 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,5, y añadir agua a 1 l fivolumen final). Preparar tampón de corrida TAE 1X (20 ml 50X TAE diluyó con agua hasta 1 L de volumen total). </li><li> Para crear una solución al 2,5% de agarosa (0,625 g de agarosa, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml de agua), solución de agarosa de calor en el microondas hasta que hierva, luego dejar enfriar hasta alrededor de 55 a 65 ° C (capaz de tocar). Una vez frío, añadir 2 l de solución de bromuro de etidio 1%, y se vierte en gel. ¡CUIDADO! El bromuro de etidio es un mutágeno y teratógeno; por favor, utilice guantes de nitrilo y adecuado protocolo de seguridad al manejar. Alternativamente, se pueden usar otros agentes o colorantes gel de resolución potencialmente menos tóxicos. </li><li> Preparar solución de bloqueo (PBS con 0,1% Triton X-100, 10% de suero bovino fetal [FBS], y 3% de albúmina de suero bovino [BSA]) para inmunofluorescencia. </li><li> Preparar la solución de lavado (PBS con 0,1% Triton X-100, 1% de FBS, y 3% de BSA) para inmunofluorescencia. </li><li> Preparar PbTx (PBS con 0,1% Triton X-100) para inmunofluorescencia. </li><li> Preparar las cámaras de incubación para culture. Llenar platos grandes (100 mm de diámetro) de Petri con 35 ml de agua en autoclave. Coloque cerca del lugar donde se llevará a cabo la disección y culturas. </li></ol> 2. Aislamiento de Fetal Testículos de Mus musculus <ol><li> Compruebe el ratón hembra de tapones vaginales cada mañana. Mediodía en el día en el que se detecta el tapón vaginal se considera E0.5. La eutanasia del ratón hembra embarazada en E11.5, de una manera consistente con los animales protocolos aprobados. </li><li> Rocíe abdomen del ratón con etanol al 70%. </li><li> Abra la piel del vientre y el peritoneo con una incisión en forma de V con unas tijeras finas y tire hacia atrás colgajo de tejido para exponer los órganos interiores. </li><li> Localice los ovarios en ambos extremos de la trompa uterina. Con unas tijeras, corte en el ovario y el tejido conectivo para separar el útero que contiene los embriones desde el cuerpo de la madre. </li><li> Abra la pared uterina cortando suavemente el lado opuesto a la placenta, la exposición de las bolsas de la yema. Sea cuidadoso para no pusaco vitelino ncture para evitar embriones dañar o perder. </li><li> Cortar cerca de la placenta para eliminar las bolsas de la yema contiene embrión y colocarlos en un plato que contiene PBS con calcio y magnesio. La presencia de iones de calcio y magnesio ayudará a moléculas de adhesión celular apoyo para mantener la arquitectura del tejido e impiden que el tejido se pegue a las herramientas de disección. </li><li> Con unas pinzas, retire el saco vitelino y amnios del embrión mediante la punción con cuidado el saco vitelino para crear un agujero en el que el embrión se puede deslizar hacia fuera. Una vez que el embrión se encuentra fuera del saco vitelino, cortar el cordón umbilical. </li><li> Desde este punto en adelante, utilizar un microscopio ubicado en una campana de cultivo de tejido estéril. Retire la cabeza del embrión y deseche pellizcando con pinzas a cada lado del cuello. </li><li> Retire la cola y colocar en un nuevo tubo de microcentrífuga para el análisis XY PCR para determinar el sexo del embrión. Nota: Si bien es óptimo para gónadas cultura tan pronto como sea posible después de la cosecha, también es possible para eliminar ADN de la cola y realizar XX / XY genotipado antes del cultivo, de modo que el sexo de cada embrión es conocido y sólo el sexo deseado tiene que ser cultivado. Si bien la determinación del genotipo se está haciendo, los embriones pueden mantenerse separados (de modo que puedan ser seguidos) a 4 ° C o en hielo hasta que esté listo para la cultura. Una advertencia es que este periodo fuera en el útero o condiciones de cultivo puede afectar potencialmente a la viabilidad de la cultura o el desarrollo posterior durante el cultivo. </li><li> Asegurar el embrión en una posición supina en contra de la parte inferior de la placa de cultivo fijando las axilas de embrión con un par de pinzas (por lo general el fórceps mantenidos en la mano débil). Mantener estas pinzas en lugar de mantener el embrión quieto durante todo el proceso de disección. </li><li> Con otro par de pinzas, quite la piel del abdomen y cubre eliminar suavemente el hígado, los intestinos y otros órganos para exponer la pared posterior del cuerpo. </li><li> Como las gónadas se encuentran en la pared del cuerpo de vuelta a cada lado de la aorta dorsal,un vaso sanguíneo grande que recorre la línea media del cuerpo, cucharada por debajo de la cresta urogenital con pinzas cerradas y retire la cresta urogenital mediante la apertura de la pinza y levantando. Como las gónadas serán libremente fijadas a la pared, tenga cuidado de no tirar demasiado rápido sin quitar estas conexiones o las gónadas pueden estirar, causando daños a los órganos. </li><li> Mueva la cresta urogenital en cDMEM en un plato para aclimatarse tejido para los medios de comunicación. </li><li> Separar el complejo gónada-mesonefros del resto de la cresta urogenital utilizando 27 g agujas. Use una aguja para cortar presionando hacia abajo, y utilizar la otra para guiar el tejido correctamente para permitir la separación óptima. Evite el uso de un movimiento de aserrado contra el fondo del plato, como agujas afiladas crearán fragmentos de plástico que se adhieren a los tejidos. Asegúrese de mantener el mesonefros completamente unidos a la gónada. </li></ol> 3. El cultivo de gónadas con un inhibidor de molécula pequeña <ol><li> Establecer dos 20 μl pipetas a 15 l cada uno. Cortar unos 1-2 mm de una de las puntas de pipeta de barrera utilizando una hoja de afeitar limpia, esterilizada para la transferencia de las gónadas y además del control cDMEM, mientras que la otra pipeta se utilizará únicamente para cDMEM tratado con el fármaco. </li><li> Alinear gónadas con su eje longitudinal paralelo a la punta de la pipeta por lo que fácilmente se pueden pipeta con la punta de corte. Tenga cuidado de las gónadas se pegan en el interior de la punta de pipeta. </li><li> Etiquetar un lado como la gotita de control y el otro como la gotita que contiene el fármaco. Sólo dos gotitas pueden caber en una tapa de placa de 35 mm. Asegúrese de que las etiquetas de los párpados se ajustan a las etiquetas de los tubos de microcentrífuga que contiene la cola de los tejidos. </li><li> Pipeta 15 l de cDMEM que contienen una sola gónada en una gotita en la tapa de una pequeña (35 mm) placa de cultivo (utilizar sólo las tapas, ya que los fondos son demasiado alto para caber dentro de una cámara humidificada placa de Petri). Coloque dos gotas que contienen las gónadas-separadas a ambos lados del plato, fr bien separadoom uno del otro. Compruebe bajo el microscopio para asegurar que las gónadas se han transferido a las gotas. </li><li> Para la gotita designado como el control, agregar un adicional de 15 l de cDMEM que contienen DMSO (realizada en el paso 1.5) para hacer una gota con un volumen total 30 l. Utilice sólo la pipeta &quot;control&quot; que no va a ponerse en contacto con la droga. </li><li> Para la otra gotita (muestra tratada con fármaco), añadir 15 l de TKI-II que contiene cDMEM para hacer una gota con un volumen total de 30 l. Utilice sólo la pipeta designado para las muestras tratadas con el fármaco. </li><li> Usando la pipeta, extender las gotas en un patrón circular expansión hasta que estén cerca de 15-18 mm de diámetro y la gónada se encuentra aproximadamente en el centro. Orientar la gónada para que quede en su lado y la gónada y mesonefros son fácilmente distinguibles. Orientar el pulmón de manera que los dos lóbulos en posición plana. <ol><li> Aunque diámetro de gota puede variar ligeramente, asegúrese de que las gónadas no son floating y se mantiene en su lugar por la tensión superficial. Asegúrese de que las gotitas no se toquen entre sí o con el lado de la tapa. Sin la tensión de la superficie, los órganos crecerán en la tapa durante el cultivo y aplanar, distorsionando así la morfología de órganos. </li></ol></li><li> Colocar con cuidado la tapa de la placa de cultivo que contenía las gotitas en posición vertical sobre la superficie del agua en el grande (100 mm) plato humidificador. Asegúrese de que no haya burbujas atrapadas debajo de la parte inferior de la tapa y que está acostado sobre la superficie del agua. No invierta la tapa y tener cuidado de no dejar que el agua toque la parte superior de la tapa donde se encuentran las gotas. </li><li> Para crear una pequeña cámara húmeda, cubrir inmediatamente con la tapa del plato humidificador grande para encerrar las culturas gónadas. Actuar lo más rápidamente posible para minimizar cualquier evaporación de medios de comunicación. Asegúrese de que el plato más pequeño tiene espacio entre ella y la tapa del plato más grande para moverse libremente; de lo contrario, la condensación puede hacer un sello y bel intercambio de aire de bloqueo para el tejido. </li><li> Una vez que dos pequeñas tapas se colocan en la cámara, coloque inmediatamente la cámara en la incubadora. Incubar las culturas de gotas durante 48 horas en un humidificado incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li></ol> Reacción en Cadena de la Polimerasa 4. para determinar el sexo de los embriones <ol><li> Añadir las colas embrionarias para fondo de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir a cada tubo 200 l de NaOH 50 mM. </li><li> Coloca a 95 ° C durante 15 minutos o hasta que el tejido se haya disuelto completamente. </li><li> Añadir 50 l de 1 M Tris-HCl y agitar ligeramente y brevemente. </li><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, hacer una mezcla maestra de PCR fresca multiplicando cada volumen por el número total de muestras: 0,5 l de 25 mM solución Primer, 2,5 l de 10X Taq Buffer, 0,5 l mM dNTPs 10 (nucleótidos), 19,3 l nuclease- agua libre, 0,2 l de ADN polimerasa Taq. Mezclar bien. </li><li> Añadir 23l de mezcla maestra de PCR a PCR tubos que contienen 3 l de lisado de colas digeridos. </li><li> Tubos Flick para mezclar ellos, a continuación, realizar un breve centrifugado para llevar las muestras a la parte inferior del tubo. </li><li> Ejecutar XY programa (Short) PCR (Tabla 1). </li><li> Cargar las muestras (con tinte 5x) y la escalera en un gel de agarosa al 2,5% en tampón TAE 1X. </li><li> Ejecute la electroforesis en gel de agarosa hasta XX y XY bandas se pueden resolver. </li><li> Imagen del gel con la captura de imágenes de luz UV y. </li><li> Analizar el X-cromosoma específico vs Y bandas del cromosoma específico (cromosoma X = 331 pares de bases [pb] y XY = 302 pb) 13; XY muestras (masculinas) tendrán dos bandas de 331 y 302 pb, mientras XX (femeninos) muestras aparecerán como una única banda de 331 pb. </li></ol> 5. Toda la inmunofluorescencia Monte Organ Día 1: <ol><li> Retire las gónadas de la cultura con una pipeta 1.000 l con una punta de corte. Si se desea, pueden estarcolocado en un plato de PBS para lavar medios y reactivos. Coloque en PBS en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. El tamaño de tubo más pequeño conservará reactivos y hacer más fácil hacer un seguimiento de las muestras en el tubo. <ol><li> Asegúrese de mantener el control y las muestras tratadas, así como muestras XX y XY, en tubos separados y eliminarlos de la cultura con conjuntos separados de pipetas para evitar la contaminación potencial de drogas. </li></ol></li><li> Lávese las gónadas dos veces con PBS. A partir de ahora, este protocolo puede utilizar 1X PBS que carecen de calcio y magnesio. Para lavar ellos, permiten que las gónadas para hunden hasta el fondo del tubo (por gravedad) y luego eliminar el líquido anteriormente. Tenga cuidado de no perder gónadas pipeteando demasiado cerca de ellos. </li><li> Eliminar la mayor cantidad PBS como sea posible desde el tubo. Añadir 250 l de paraformaldehído al 4% en PBS que contenía 0,1% de Triton X-100, y dejar incubar O / N a 4 ° C en un agitador. Alternativamente, esta fijación se puede realizar durante 2 horas a 4 ° C en un agitador. ¡CUIDADO! Paraformaldehyde es una sustancia tóxica, por lo que sigue el protocolo de seguridad al manejar. </li></ol> Dia 2: <ol start="4"><li> Enjuague las gónadas dos veces en 250 l PbTx a RT. </li><li> Lávese las gónadas 3 veces con 250 l PbTx durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Bloquee las gónadas al menos 1 hora en 250 l de solución de bloqueo a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Teñir las gónadas O / N a 4 ° C en un rockero en 250 l de anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo. </li></ol> Día 3: <ol start="8"><li> Enjuague las gónadas dos veces en 250 Solución de lavado l. </li><li> Lávese las gónadas 3 veces con 250 l solución de lavado durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en una mecedora. </li><li> Bloquee las gónadas 1 h en 250 ml de solución de bloqueo a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Cubra el tubo de microcentrífuga con papel de aluminio para proteger secundaria de anticuerpos fluorescentes de la luz. </li><li> Incubar las gónadas 04.02 horas a RT en arocker en 250 l de anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo que contiene Hoechst 33342. Alternativamente, realice anticuerpo secundario y Hoechst 33342 incubación O / N a 4 ° C en eje de balancín. </li><li> Enjuague las gónadas dos veces en 250 l PbTx. </li><li> Lávese las gónadas 3 veces en 250 l PbTx durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Usando una punta de pipeta de corte, transferir gónadas en un portaobjetos con el líquido mínimo. Retire el exceso de líquido con la pipeta, pero asegúrese de que el tejido no se seque. </li><li> Orientar las gónadas en forma deseada con unas pinzas, y añadir rápidamente una gota de medio de montaje para montar las gónadas de la diapositiva. Asegúrese de que los abrigos de los medios de montaje todas las muestras por completo; es fundamental para evitar que las muestras se sequen. </li><li> Use cubreobjetos (número 1.5 del estilo) de tamaño adecuado para cubrir suavemente muestras. Deje de montaje propagación medios de comunicación para ponerse en contacto con toda la superficie del cubreobjetos. Si es necesario, pulse muy ligeramente en las esquinas de modo que el cubreobjetosno hay grandes burbujas de aire. </li><li> Sellar las diapositivas con claro esmalte de uñas en los bordes para reducir la evaporación de los medios de montaje. Tienda diapositivas montadas en la oscuridad a 4 ° C. </li></ol>

<ol><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).</li>
<li>Maatouk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+beta-catenin+in+XY+gonads+causes+male-to-female+sex-reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).</li>
<li>DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk-sac-derived+macrophages+regulate+fetal+testis+vascularization+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).</li>
<li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ%2C+the+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).</li>
<li>Walton, K. D., Kolterud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fetal+whole+intestine+culture+system+for+ex+vivo+manipulation+of+signaling+pathways+and+three-dimensional+live+imaging+of+villus+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development.</a> J. Vis. Exp. (91), e51817(2014).</li>
<li>Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+culture+system+to+study+thyroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An ex vivo culture system to study thyroid development.</a> J. Vis. Exp. (88), e51641(2014).</li>
<li>Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+embryonic+mouse+kidney%2C+culture+in+vitro%2C+and+imaging+of+the+developing+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).</li>
<li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. (66), e3979(2012).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).</li>
<li>Combes, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Endothelial+cell+migration+directs+testis+cord+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation.</a> Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).</li>
<li>Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+and+kinase+domain+region+receptor+are+involved+in+both+seminiferous+cord+formation+and+vascular+development+during+testis+morphogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat.</a> Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).</li>
<li>Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-mesenchymal+cross-talk+through+Vegf+and+Pdgf+drives+organ+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).</li>
<li>Clapcote, S. J., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplex+PCR+assay+for+sex+determination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Simplex PCR assay for sex determination in mice.</a> BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).</li>
<li>Nel-Themaat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Morphometric+Analysis+of+Testis+Cord+Formation+in%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in.</a> Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).</li>
<li>Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+male-specific+role+for+SOX9+in+vertebrate+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination.</a> Development. 122, 2813-2822 (1996).</li>
<li>Morais da Silva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Sox9+expression+during+gonadal+development+implies+a+conserved+role+for+the+gene+in+testis+differentiation+in+mammals+and+birds%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds.</a> 14, 62-68 (1996).</li>
<li>Rockich, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9+plays+multiple+roles+in+the+lung+epithelium+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).</li>
<li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+and+development+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).</li>
<li>Brennan, J., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+tissue%2C+two+fates%3A+Molecular+genetic+events+that+underlie+testis+versus+ovary+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development.</a> Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).</li>
<li>Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-specific+cell+migration+into+the+developing+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Male-specific cell migration into the developing gonad.</a> Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).</li>
<li>Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+spermatogenesis+using+an+organ+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro spermatogenesis using an organ culture technique.</a> Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li>
<li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este estudio demuestra un método ex vivo gotita entera órgano que tiene muchas aplicaciones potenciales para el estudio del desarrollo fetal. Esta técnica se puede utilizar para múltiples órganos, y permite al investigador para abordar cuestiones biológicas que son difíciles de examinar usando enfoques in vivo debido a la inaccesibilidad de los embriones y el potencial letalidad embrionaria. Este método de cultivo tiene beneficios adicionales sobre otros enfoques in vitro, tales como líneas ce...

La regeneración de órganos in vivo en los seres humanos es muy limitada; Por lo tanto, la ingeniería de tejidos, el desarrollo de tejidos y órganos a partir de células individuales donados por un anfitrión, se está convirtiendo en una terapia potencial atractivo para el reemplazo de órganos. Sin embargo, para que esta estrategia terapéutica para tener éxito, los factores y las interacciones celulares implicados en la morfogénesis del órgano deben ser estudiados a fondo y bien entendidos. Debido a la incapacidad para estudiar el desarrollo de los órganos específicos con los enfoques tradicionales, los investigadores han recurrido a embrión conjunto alternativo o cultivos de órganos enteros. Kalaskar et al. 1 han demostrado que la cultura embriogénesis ex vivo toda produce resultados comparables (en el 58% de los embriones cultivados) en el desarrollo del útero, lo que sugiere que los métodos de cultivo ex vivo son una alternativa viable para los estudios de organogénesis. Un sistema de cultivo de órganos individualizado, como este ex vivo droPlet sistema de cultivo, permite el análisis de órganos conjunto independiente de los efectos sistémicos, al tiempo que permite la manipulación de una vía de señalización específica o interacciones celulares a través de la adición de reactivos farmacológicos o anticuerpos. Tradicionalmente, el estudio de desarrollo de los órganos del feto se ha limitado a las tecnologías transgénicas y knockout de ratón, además de reactivos farmacológicos entregados por vía materna. Sin embargo, hay cuestiones técnicas que implican estas técnicas y tratamientos in vivo; la mayoría de las preocupaciones giran en torno a los efectos de influir en varios órganos simultáneamente que a menudo resulta en letalidad embrionaria. Una preocupación adicional de estudios de manipulación de desarrollo fetal farmacológicamente es el efecto materno de los fármacos sobre el desarrollo embrionario in utero (por ejemplo, el metabolismo maternal de la droga antes de que alcance el embrión) y si tales reactivos pueden pasar a través de la barrera placentaria. La técnica de cultivo de órganos toda describióaquí fue adaptada de un protocolo descrito por primera Maatouk et al. 2, en la que las gónadas fetales enteros se incuban en cultivos ex vivo de gotas en posición vertical. Una ventaja significativa de cultivo de gónadas fetales es que los inhibidores de molécula pequeña pueden acceder fácilmente todo el órgano por difusión simple. . DeFalco et al han demostrado que la utilización de este método de cultivo gotita ex vivo en combinación con inhibidores de molécula pequeña se puede utilizar para estudiar los procesos y las interacciones que se producen durante el desarrollo de las gónadas 3 de señalización; estos procesos serían difíciles de examinar in vivo debido a problemas técnicos (por ejemplo, el paso de drogas a través de la placenta o letalidad de afectar a múltiples órganos utilizando enfoques genéticos o farmacológicos). La cultura gotita no es sólo una mejora en algunos aspectos más de la experimentación en el útero, pero también es una mejora con respecto in vitro y ex visistemas vo también. El uso de líneas celulares para estudiar la morfogénesis es extremadamente difícil porque carecen de los diversos tipos de células, carecen de la matriz extracelular (ECM) componentes críticos que permiten la formación de la arquitectura de órganos, y pueden exhibir artefactos en las cascadas de señalización. Aunque la ingeniería de tejidos ha hecho mejoras significativas en la creación de andamios que simulan ECM, la falta de conocimiento con respecto a la cual las señales son requeridos por cada tipo de célula durante la organogénesis hace que sea difícil para construir un sistema de órganos in vitro. Otros sistemas ex vivo han sido establecidos previamente para estudiar la organogénesis, o más específicamente la morfogénesis y han sido muy exitoso para imágenes en vivo de los órganos fetales en agar 4, transwells 5, 6, filtros y otras matrices de andamio 7,8. La ventaja del sistema de cultivo gotita es que permite el estudio de la morfogénesis, proporcionando la capacidad de utilizar menos reactivos, que son often caro, pero también dando la tensión superficial de órganos, lo cual es importante para el crecimiento y la señalización de capacidades 9. En el ratón, la morfogénesis inicial testículo tiene lugar entre embrionario (E) etapas E11.5 y E13.5; estas etapas comprenden la ventana de tiempo óptimo para los factores que influyen en la diferenciación de sexo-específicas de instrucción. Entre los procesos críticos que ocurren durante la formación de los testículos son la generación de la arquitectura cable de testículo y la formación de una red vascular-testículo específico. La utilización de este órgano vivo todo el sistema de cultivo ex gotita, uno es capaz de alterar la vascularización-masculina específica e inhibir la morfogénesis testículo mediante el uso de un inhibidor de pequeña molécula que bloquea la actividad de los receptores de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); La remodelación vascular mediada por VEGF es crítico para el desarrollo testicular 10-12. Esta técnica se puede aplicar con éxito a otros órganos y puede apuntar tiempo específicoventanas de desarrollo. Formación de imágenes de órganos Todo el montaje permite la visualización de las estructuras vitales así como los cambios estructurales y celulares resultantes de la administración de diversos inhibidores. Es importante destacar que este sistema es ventajoso en que el investigador puede pasar por alto posibles efectos de confusión de la administración del fármaco materna o la interrupción sistémica in vivo durante estrategias gen diana. Por lo tanto, todo este órgano ex vivo sistema de cultivo de gota puede mejorar significativamente la capacidad de entender las interacciones y la señalización que se producen específicamente en determinados órganos durante el desarrollo fetal.

<table><tbody><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cubrevases: Cuadrados (22 mm x 22 mm, n.º 1,5)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Sally Hansen Xtreme Wear Esmalte de uñas, invisible</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 tiras 0,2 ml Tubos de PCR & Tapas planas desmontables</td><td>GeneMate</td><td>T3218-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 FST</td><td></td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml</td><td>Denville</td><td>C2176</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l Puntas de barrera de precisión SHARP</td><td>Denville</td><td>P1096FR</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l Puntas de barrera de precisión SHARP</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Puntas de barrera de precisión SHARP</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 ml con agujas de calibre 27</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>305559</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; M Filtro de jeringa PES</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Grado 3 Papel de filtro cualitativo Grado estándar, círculo, 185 mm</td><td>Whatman</td><td>1003-185</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 35 mm Plato de cultivo celular estilo fácil agarre</td><td>Falcon/Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, estériles (100 mm x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora New Brunswick Galaxy 14 S CO2</td><td>Eppendorf</td><td>CO14S-120-0000</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de bioseguridad</td><td>Nuare</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrífuga&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td><td>GeneMate</td><td>R-3200-1XL</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Termociclador con panel de control</td><td></td><td></td> Microscopio estereoscópico Eppendorf 950040015 <td></td></tr><tr><td>SMZ445</td><td>Nikon</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de luz multiimagen con software AlphaEase Alpha</td><td>Innotech Corporation</td><td>Descontinuado</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto de 200 grados</td><td>Fisher</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio (Dibásico MW 142) Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio (monobásico MW 136) KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nucleasa Tecnologías de vida de agua libre de nucleasas</td><td></td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cartilla de PCR XY&nbsp;</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP2482-1</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bromuro de etidio al 1%</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Agarosa tóxica</td></tr><tr><td></td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 100 mM Soluciones</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td></td></tr><tr><td>DNA Choice Taq polimerasa con tampón 10x</td><td>Denville</td><td>CB-4050-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>FluorMount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de hidrógeno ( HCl)</td><td></td><td></td>Albúmina sérica bovina de Fisher A144212 <td></td></tr><tr><td>(BSA), polvo, fracción V, aislamiento de choque térmico</td><td>Bioexpress</td><td>0332-100g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS), triple filtrado de 100 nm</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>Inactivación por calor antes de usar</td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Uso a 1:100</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO), Hybri-max, filtrado estéril</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VEGFR Inhibidor de tirosina quinasa II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td><td>EMD Millipore</td><td>676481</td><td></td></tr><tr><td>Conejo Anticuerpo Anti-Sox9</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>Uso en dilución: 1:4.000</td></tr><tr><td>Rata Anti-Ratón PECAM1 (CD31) Anticuerpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Uso en dilución: 1:250</td></tr><tr><td>Conejo Hendido Caspasa-3 (Asp175) Anticuerpo</td><td>Señalización Celular</td><td>9661S</td><td>Uso en dilución: 1:250</td></tr><tr><td>Rata E-cadherina / CDH1 Anticuerpo (ECCD-2)</td><td>Life Technologies</td><td>13-1900</td><td>Uso en dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 3342, triclorhidrato, trihidrato</td><td>Invitrogen (sondas moleculares)</td><td>H1399</td><td>Uso en 2 ug/ml</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-165-153</td><td>Uso en dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-605-153</td><td>Uso en dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-Conejo IgG (H+L) de Burro, conjugado Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A31572</td><td>Uso en la dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-IgG (H+L) anti-Conejo de Burro, conjugado Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>Uso en la dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario Anticuerpo IgG (H+L) anti-Rata Anti-Rata IgG (H+L), conjugado Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td>Uso en la dilución: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 647 conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>Uso en la dilución: 1:500</td></tr></tbody></table>

usando<em&gt; ex vivo</em&gt; culturas upright gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante ratón organogénesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

La investigación de la organogénesis en el útero es un proceso técnicamente difícil en los mamíferos placentarios, debido a la inaccesibilidad de los reactivos a los embriones que se desarrollan dentro del útero. Un método de cultivo de gotas recién desarrollado ex vivo en posición vertical ofrece una alternativa atractiva a los estudios realizados en el útero. El cultivo ex vivo gotita proporciona la capacidad de examinar y manipular las interacciones celulares y diversas vías de señalización a través del uso de diversos bloqueo y compuestos activadores; Además, los efectos de diversos reactivos farmacológicos sobre el desarrollo de órganos específicos pueden ser estudiados sin efectos secundarios no deseados de la administración de fármacos sistémico en el útero. En comparación con otros sistemas in vitro, el cultivo de gota no sólo permite la capacidad de estudio de tres dimensiones morfogénesis y las interacciones célula-célula, que no puede ser reproducida en líneas celulares de mamíferos, sino que también requiere significativamente menos reagents que otros ex vivo e in vitro. protocolos Este trabajo demuestra la disección del ratón correcto fetal órgano y técnicas de cultivo de gotita en posición vertical, seguido por inmunofluorescencia órgano completo para demostrar la eficacia del método. El método de cultivo gotita ex vivo permite la formación de la arquitectura de órganos comparable a lo que se observa in vivo y puede ser utilizado para estudiar los procesos de otro modo difíciles de estudio debido a la letalidad embrionaria en modelos in vivo. Como un sistema de solicitud de modelo, un inhibidor de molécula pequeña se utilizará para investigar el papel de la vascularización en la morfogénesis testicular. Este método de cultivo gotita ex vivo es ampliable a otros sistemas de órganos fetales, como el de pulmón y posiblemente otros, aunque cada órgano debe ser ampliamente estudiados para determinar las modificaciones órgano-específicas en el protocolo. Este sistema de cultivo de órganos ofrece flexibilidad en la experimentación con los órganos fetales, y resulta obtained usando esta técnica ayudará a los investigadores a obtener conocimientos sobre el desarrollo fetal.

El cultivo ex vivo de gota le permite a uno para manipular órganos enteros, como el de las gónadas, para estudiar las interacciones celulares y dinámicas. La figura 1 muestra de manera gradual cómo preparar una cultura E11.5 gonadal gotas. Los primeros pasos en el protocolo de cultivo incluyen la eliminación inicial del útero que contiene embrión del ratón madre (Figura 1A y 1B). Después de la extracción del útero de la madre, la pared uterina se corta y los embriones se liberó...

El cultivo de gotas verticales ex vivo es una alternativa a las técnicas experimentales actuales in vitro e in vivo. Este protocolo es fácil de realizar y requiere cantidades más pequeñas de reactivo, a la vez que permite la capacidad de manipular y estudiar la vascularización, morfogénesis y organogénesis fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar los efectos de inhibidores de moléculas pequeñas en el desarrollo de órganos fetales mediante una técnica de cultivo ex vivo en gotas. Esto se logra primero abriendo el peritoneo de un ratón preñado y extrayendo el útero que contiene embriones. A continuación, los embriones se extraen del útero y se separan de las membranas vitelina y amniótica.Luego, el complejo goad me neph se disecciona y aísla del embrión. Finalmente, el complejo goad Meris se cultiva en una gota con o sin un inhibidor de molécula pequeña. En última instancia, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia para mostrar los cambios en la arquitectura del órgano mediante anticuerpos específicos de tipo celular.Entonces, la ventaja de nuestro cultivo ex vivo de órganos completos en gotas verticales, en comparación con líneas de cultivo celular, es que conserva la estructura tridimensional, lo que favorece las interacciones celulares debido a la localización, así como las señales de la matriz extracelular que podrían ser importantes para la formación y el patrón del órgano. Además, nuestra técnica de gotas verticales permite utilizar menos reactivos, reduciendo a

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el protocolo para el aislamiento y cultivo de explantes del cerebro anterior del ratón desde el primer día embyonic 12 ratones. Procedimientos para la extirpación del útero, los embriones del útero, y la disección de los embriones se les da. Además de la metodología para la transferencia de estos explantes en las membranas especializadas en las que se cultivan se demuestra. El desarrollo del cerebro anterior se puede estudiar in vitro utilizando esta preparación, así como...

Ratón cerebro anterior dorsal de aislamiento del explante

Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un...

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

Los estudios de desarrollo en el ratón se ven obstaculizados por la falta de acceso al embrión durante la gestación. Para promover la cultura a largo plazo del corazón embrionario en las últimas etapas de gestación, se desarrolló un protocolo en el que el corazón extirpado se cultiva en un semi-sólido, Matrigel diluido.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

El suero utilizado en los cultivos de embriones contiene componentes desconocidos que pueden afectar el resultado de los experimentos sobre todo en los estudios que involucran interacciones de señalización. Aquí hemos utilizado un sistema de cultivo oxigenada libre de suero y mostramos que los embriones mitad de la gestación de ratón en cultivo de 16-40 horas exhiben desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero.

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

La tecnología de imagen mejorada está permitiendo la obtención de imágenes tridimensionales de los órganos durante el desarrollo. Aquí describimos un sistema de cultivo de órganos completo que permite obtener imágenes en vivo de las vellosidades en desarrollo en el intestino fetal del ratón.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para Ex Vivo Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Se describe un método simple para establecer la placenta humana primaria (vellosidades) y cultivos de órganos de la decidua. cultivos de órganos de las vellosidades y decidua son herramientas muy valiosas para el estudio de la patogénesis en la interfase materno-fetal humano. La infección con la bacteria intracelular Listeria monocytogenes facultativos se demuestra.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

Se presenta un método para el aislamiento y cultivo de conducto de Wolff ratón (WD). También demostramos un procedimiento detallado para toda la inmunotinción monte de WDS cultivadas / recién aisladas con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio del desarrollo de WD, bobinado, y la diferenciación.

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

Presentamos los protocolos para examinar el desarrollo del corazón de ratón utilizando microscopía epifluorescente Monte todo en embriones de ratón disecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones. Este método nos permite visualizar directamente cada etapa de la formación del ventrículo durante el desarrollo del corazón de ratón sin mano de obra intensiva métodos histoquímicos.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

Una plataforma mejorada para el cultivo de embriones enteros permite el desarrollo continuo y robusto ex utero de embriones de ratón postimplantación durante un máximo de seis días, desde las etapas de pregastrulación hasta la organogénesis avanzada. En este protocolo, detallamos el procedimiento estándar para el cultivo exitoso de embriones utilizando placas estáticas y sistemas de botellas giratorias.

Ex Utero Cultivo de embriones de ratón desde la pregastrulación hasta la organogénesis avanzada

Aprende el cultivo ex vivo en gota vertical para estudiar la organogénesis fetal en ratón. Este método permite examinar inhibidores de moléculas pequeñas y analizar cambios en la arquitectura de órganos mediante inmunofluorescencia.

Usando Ex Vivo Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis (Video) | JoVE Journal

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