Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC)
24 de diciembre de 2015
Las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC) aparecen cada vez más relevante para la aplicación clínica. El uso de un sistema de co-cultivo de MSCs y leucocitos de sangre periférica pre-manchado con la succinimidil éster colorante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), se describe la evaluación in vitro de MSC sobre la proliferación de leucocitos inmunomodulación efector y subpoblaciones específicas.
El objetivo general de este experimento es evaluar las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimatosas humanas o msc. Este método puede ayudar a esclarecer los mecanismos implicados en la inmunomodulación por células madre mesenquimatosas humanas, un proceso que podría tener relevancia terapéutica. La principal ventaja de esta técnica es que tanto la ocurrencia de la proliferación de linfocitos efector como el número de divisiones celulares pueden evaluarse, demostrando que el procedimiento será por zapato.
Un técnico de mi laboratorio para aislar PBMC comienza diluyendo 25 mililitros de una muestra de sangre completa heparinizada con 25 mililitros de PBS en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, añada 15 mililitros de gradiente de densidad Ficoll-Paque a un nuevo tubo de 50 mililitros. Luego, sosteniendo el tubo en un ángulo, superponga lentamente la suspensión celular diluida sobre el gradiente de densidad.
Al tener cuidado con eso, no se produce mezcla entre las capas. Uno de los pasos más críticos en este experimento es la superposición de la sangre sin perturbar el gradiente de densidad. Esto asegura una alta pureza y una baja contaminación con glóbulos rojos en los pbmc aislados.
Ahora, separe las células mediante centrifugación. Deberían observarse tres capas distintas: la capa superior de plasma, la capa inferior del gradiente de densidad del fial pack y una delgada capa media de PBMC.
Utilizando una pipeta PE, retire la capa superior teniendo cuidado de no aspirar la capa de interfase. Luego, use una pipeta de 10 mililitros para transferir cuidadosamente los pbmc a un tubo cónico de 50 mililitros. Mezcle las células con 20 mililitros de PBS y luego centrifúgelas para eliminar cualquier rastro del gradiente de densidad.
Luego, lave el sedimento con otros 20 mililitros de PBS para eliminar las plaquetas. Re_suspenda el segundo sedimento en medio completo para leucocitos a una concentración de uno por diez elevado a siete células por mililitro. Para preparar un cultivo co-cultivo de MSC y leucocitos, caliente previamente el medio completo para MSC a 37 grados Celsius durante no más de 30 minutos.
Luego, siembre cinco veces 10 a la cuarta CMM por un mililitro de medio completo para CMM por pocillo en placas de 24 pocillos para la adhesión nocturna a 37 grados Celsius, permitiendo que las células alcancen el 80 % de confluencia. A la mañana siguiente, aspire el medio y agregue el número apropiado de PBMC marcados con CFSE a las CMM en un mililitro de medio completo para leucocitos. A una relación de una a 10 de CMM respecto a PBMC, active las células con 10 microgramos de PHA por mililitro de medio completo para leucocitos.
Luego, en los días tres y cinco del co-cultivo, transfiera el número adecuado de co-cultivo a tubos cónicos y evalúe la proliferación de los leucocitos marcados con CFSE mediante análisis citométrico de flujo para realizar un ensayo de supresión de efector. Comience estableciendo un co-cultivo de M-S-C-P-B-M-C como se acaba de demostrar, con 2,5 × 10⁶ p BMCs en co-cultivo con 250.000 MSCs. Para asegurar suficientes p BMCs en co-cultivo con MSCs para la selección de subpoblaciones.
Después de 48 a 72 horas a 37 grados Celsius, seleccione los leucocitos inmunomoduladores inducidos por las MSC de interés con las microesferas magnéticas apropiadas. Luego, agregue células T alógenas positivas para CD cuatro marcadas con CFSE en un mililitro de medio completo para leucocitos por pocillo, en diversas proporciones experimentales. A continuación, agregue microesferas conjugadas con anti-CD3/28 en una proporción de uno a uno de microesferas por célula para estimular las células T positivas para CD cuatro.
El tercer día de co-cultivo, evalúe la proliferación de las células T CD4 positivas marcadas con CFSE mediante citometría de flujo. Las CMM son células adherentes con una morfología fusiforme fibroblástica, mientras que los PBMC y los leucocitos son células pequeñas, redondas y no adherentes, lo que permite distinguir claramente estas dos poblaciones celulares. En un co-cultivo, cuando no hay proliferación, las células marcadas con CFSE se observan como un solo pico altamente positivo y con fluorescencia nítida cuando las células han sido activadas.
La proliferación se manifiesta como múltiples picos más pequeños con una pérdida y un desplazamiento hacia la izquierda de la intensidad de fluorescencia cuando ha ocurrido la supresión de la proliferación. Por ejemplo, en un cultivo celular conjunto de MSC, el número de picos más pequeños disminuye con un aumento concomitante en la intensidad de fluorescencia, evidenciado por el desplazamiento de los picos hacia la derecha y el aumento en la nitidez del pico más a la derecha, que representa las células no divididas en un ensayo de supresión por células efectoras. El efecto supresor de los MSC sobre la proliferación de linfocitos T CD4 positivos puede evaluarse además de manera dependiente de la dosis.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la inmunomodulación de las células madre mesenquimales humanas. No olvide que trabajar con células humanas puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones.
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Descripción general
Este estudio investiga las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSCs) mediante un sistema de co-cultivo con leucocitos de sangre periférica. La evaluación se centra en la proliferación de leucocitos efectorores y subpoblaciones específicas, destacando la relevancia terapéutica potencial de las MSCs.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Investigación con Células Madre
- Proliferación Celular
Antecedentes
- Las células madre mesenquimales humanas (MSC) tienen propiedades inmunomoduladoras.
- Comprender las interacciones entre las MSC y los leucocitos es fundamental para aplicaciones terapéuticas.
- La proliferación de leucocitos efector es un aspecto clave de la respuesta inmunitaria.
- Los sistemas de co-cultivo pueden modelar eficazmente estas interacciones in vitro.
Objetivo del estudio
- Evaluar los efectos inmunomoduladores de las CMM sobre la proliferación de leucocitos.
- Elucidar los mecanismos de la inmunomodulación por CMM.
- Explorar la relevancia terapéutica de las CMM en aplicaciones clínicas.
Métodos Utilizados
- Sistema de co-cultivo de células madre mesenquimales (MSC) y leucocitos de sangre periférica.
- Uso del éster succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) para el seguimiento celular.
- Evaluación de la proliferación de leucocitos efectorores.
- Análisis de subpoblaciones específicas de leucocitos.
Resultados principales
- Se demostró la modulación inducida por CMM sobre la proliferación de leucocitos.
- Se identificaron subpoblaciones específicas afectadas por las CMM.
- Se aportaron conocimientos sobre los mecanismos de inmunomodulación de las CMM.
- Se destacó el potencial de las CMM en contextos terapéuticos.
Conclusiones
- Las CMM exhiben efectos inmunomoduladores significativos sobre los leucocitos.
- Los hallazgos respaldan el uso terapéutico de las CMM en entornos clínicos.
- Se necesita más investigación para comprender completamente los mecanismos implicados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación de la función inmunomoduladora de las CMM mediante ensayos de proliferación de leucocitos basados en CFSE proporciona un método cuantitativo y reproducible para evaluar el potencial terapéutico en enfermedades inmuno-mediadas. Este enfoque apoya la validación del blanco al permitir la reducción de riesgos mecanicistas de la inmunosupresión mediada por CMM antes de la inversión preclínica. La adaptabilidad del ensayo a subpoblaciones específicas de leucocitos mejora la confianza predictiva en la selección de candidatos líderes para las líneas de desarrollo inmunomoduladoras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la supresión mediada por MSC de la proliferación de leucocitos efectorores como una lectura funcional de la actividad inmunomoduladora.
- Valor operativo: Proporciona un método estandarizado, basado en etiquetas, para cuantificar la historia de divisiones y la cinética de proliferación sin utilizar radioactividad.
- Valor científico: Facilita el cribado fenotípico de donantes de MSC o estrategias de preacondicionamiento mediante la medición de la supresión de la proliferación de leucocitos marcados con CFSE.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Permite el aislamiento y seguimiento de subpoblaciones específicas de leucocitos (por ejemplo, células T CD4+) mediante selección con microesferas magnéticas antes del co-cultivo, posibilitando el perfilado de inmunomodulación específico por subpoblación.
- Valor operativo: Los perfiles de dilución de CFSE generados por citometría de flujo proporcionan datos cuantitativos y multiparamétricos sobre la supresión de la proliferación y el historial de divisiones.
- Valor científico: Facilita la evaluación de la respuesta dosis-dependiente de la inmunomodulación por células madre mesenquimatosas en diferentes proporciones de MSC:leucocitos y condiciones de activación (por ejemplo, estimulación con PHA).
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la potencia inmunomoduladora in vitro con la eficacia clínica potencial en enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario mediante la modelización de la comunicación cruzada entre MSC y leucocitos.
- Valor operativo: Permite el muestreo longitudinal (por ejemplo, días 3 y 5) para evaluar la dinámica temporal de la supresión y la recuperación.
- Valor científico: Facilita la evaluación alineada con biomarcadores mediante la correlación entre la supresión de la proliferación y la expresión intracelular de citocinas en leucocitos en co-cultivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo de proliferación de leucocitos basado en CFSE se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano como una herramienta funcional de cribado inmunomodulador, actuando como nexo entre la validación del objetivo y las etapas de optimización del fármaco líder para terapias basadas en células MSC.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa la hipótesis de que las CMM suprimen la proliferación de leucocitos, aportando información mecanicista sobre las vías inmunosupresoras.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de proliferación que permiten comparar diferentes lotes de CMM, donantes o condiciones de cebado.
- Análisis: Genera datos de citometría de flujo capaces de distinguir picos de proliferación, rastrear divisiones celulares y detectar respuestas específicas de subpoblaciones en poblaciones heterogéneas de leucocitos.
- Investigación Traducional: Modela in vitro las interacciones entre células inmunitarias humanas y CMM, facilitando la extrapolación a contextos clínicos de inmunomodulación.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma modular y adaptable, aplicable a diversos tipos de células inmunitarias y condiciones de estimulación relevantes para enfermedades.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar evidencia directa y cuantificable de la supresión de leucocitos mediada por MSC.
- Valor operativo: Asegura la estandarización del ensayo mediante relaciones definidas de MSC:leucocitos, protocolos de marcado con CFSE y estrategias de selección por citometría de flujo.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al identificar MSC con actividad inmunomoduladora potente y reproducible en etapas tempranas del proceso.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos MSC basada en la potencia funcional inmunomoduladora, y no únicamente en marcadores fenotípicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de leucocitos primarios, la marcación con CFSE y el análisis de citometría de flujo multicolor.
- Depende del acceso a citómetros de flujo capaces de resolver los picos de dilución de CFSE y sistemas de separación con microesferas magnéticas para el aislamiento de subpoblaciones.
- Necesita la estandarización de las condiciones de activación de leucocitos (por ejemplo, concentración de PHA) y de los protocolos de precultivo de CMM en diferentes centros.
- Requiere la optimización de las proporciones de CMM:leucocitos y de la duración de la cocultura para evitar artefactos por sobrecrecimiento o agotamiento de nutrientes.
- Está limitado por la variabilidad entre donantes en la respuesta de los leucocitos, lo que exige controles de donantes agrupados o apareados para obtener métricas de supresión reproducibles.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Isolation
2:23
MSC: Leukocyte Co-culture and Leukocyte Activation
3:31
Variation: Effector Suppression Assay
4:38
Results: Representative Suppressive Effects of MSC on Leukocyte Proliferation
5:51
Conclusion
