Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC)

El objetivo general de este experimento es evaluar las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas o msc. Este método puede ayudar a dilucidar los mecanismos implicados en la inmunomodulación de las células madre mesenquimales humanas, un proceso que puede tener relevancia terapéutica. La principal ventaja de esta técnica es que tanto la ocurrencia de efectores, proliferación de leucocitos como el número de divisiones celulares se pueden evaluar demostrando que el procedimiento será por zapato.

Un técnico de mi laboratorio Para aislar pbmc, comience diluyendo 25 mililitros de una muestra de sangre completa heparinizada con 25 mililitros de PBS en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, agregue 15 mililitros de phi, llame gradiente de densidad del paquete a un nuevo tubo de 50 mililitros. Luego, sosteniendo el tubo en ángulo, coloque lentamente la suspensión celular diluida sobre el gradiente de densidad.

Cuidando eso, no hay mezcla de las capas. Uno de los pasos más críticos en este experimento es una estratificación de la sangre sin alterar el gradiente de densidad. Esto es para garantizar una alta pureza y una baja contaminación de glóbulos rojos de la pbmc aislada.

Ahora, separe las células por centrifugación. Deben ser evidentes tres capas distintas. La capa de plasma superior, la capa inferior de gradiente de densidad del paquete fial y una capa media delgada de PBMC.

Con una pipeta de PE, retire la capa superior teniendo cuidado de no aspirar la capa de interfase. A continuación, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir con cuidado el pbmc a un tubo cónico de 50 mililitros. Mezcle las celdas con 20 mililitros de PBS y luego gírelas hacia abajo para eliminar cualquier rastro de gradiente de densidad.

A continuación, lave el pellet en otros 20 mililitros de PBS para eliminar las plaquetas. Resus suspendiendo el segundo pellet en medio leucocitario completo a una concentración de una vez 10 de la séptima célula por mililitro. Para configurar un precalentamiento de cocultivo de leucocitos MSC, complete el medio MSC a 37 grados Celsius durante no más de 30 minutos.

A continuación, siembre cinco veces 10 al cuarto MSC por un mililitro de medio MSC completo por pocillo en placas de 24 pocillos para su fijación durante la noche a 37 grados centígrados, permitiendo que las células alcancen el 80% de confluencia. A la mañana siguiente, aspire el medio y agregue el número apropiado de BMC P marcadas con CFSE al MSC en un mililitro de medio leucocitario completo. En una proporción de 1 a 10 MSC a PBMC, active las células con 10 microgramos de PHA por mililitro de medio leucocitario completo.

Luego, en los días tres y cinco de cocultivo, transfiera el número apropiado de cocultivo a tubos de fax de fondo redondo y evalúe la proliferación de los leucocitos marcados con CFSE mediante un análisis de citometría de flujo para realizar un ensayo de supresión de efectores. Comience por establecer un cocultivo M-S-C-P-B-M-C como se acaba de demostrar con 2,5 veces 10 al sexto p BMCs co-cultivo con 250.000 MSCs. Asegurar un cocultivo suficiente de MSC p BMCs para la selección de subpoblaciones.

Después de 48 a 72 horas a 37 grados centígrados, seleccione los leucocitos inmunomoduladores inducidos por MSC de interés con las perlas magnéticas adecuadas. A continuación, añada cuatro linfocitos T positivos CD alogénicos marcados con CFSE en un mililitro de medio leucocitario completo por pocillo en varias proporciones experimentales. A continuación, agregue microesferas conjugadas anti CD 3 28 en una proporción de uno a uno B por célula para estimular la célula T CD 4 positiva.

En el tercer día de cocultivo, se evaluó la proliferación de las células T positivas CD cuatro marcadas con CFSE mediante citometría de flujo. Las MSC son células adherentes con una morfología fibroblástica en forma de huso. Y pbmc y leucocitos son células pequeñas, redondas y no adherentes, lo que permite la clara distinción de estas dos poblaciones celulares. En un cocultivo, cuando no hay proliferación, las células marcadas con CFSE se observan como un pico altamente positivo y marcadamente fluorescente cuando las células se han activado.

La proliferación se manifiesta como múltiples picos más pequeños con una pérdida y un desplazamiento a la izquierda de la intensidad de la fluorescencia cuando se ha producido la supresión de la proliferación. Por ejemplo, en un cocultivo de MSC, los múltiples picos más pequeños disminuyen en número con un aumento concomitante en la intensidad de la fluorescencia, como lo demuestra el desplazamiento de los picos hacia la derecha y los aumentos en la nitidez del pico más a la derecha, que representa las células que no se dividen en un ensayo de supresión de efectores. El efecto supresor de la MSC sobre la proliferación de células T CD cuatro positivas puede evaluarse más a fondo en función de la dosis.

Después de ver este video, debería tener una idea clara de cómo evaluar la inmunomodulación de las células madre mesenquimales humanas. No olvide que trabajar con células humanas puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones.