La detección de Intracelular expresión génica en células vivas de murino, humano y porcino Origen Utilizando nanopartículas fluorescencia marcado

El objetivo general de este procedimiento es analizar la expresión génica intracelular directamente en células vivas mediante la aplicación de nanopartículas fluorescentes específicas para el gen. Esto se logra primero definiendo las secuencias diana apropiadas en el gen de interés. El segundo paso consiste en fabricar nanopartículas con cadenas de captura y reporteras específicas.

A continuación, se añaden directamente las nanopartículas al medio de cultivo de la célula viva. El paso final consiste en incubar las células con las nanopartículas durante la noche a 37 grados Celsius y 5 %CO2 en una atmósfera humedecida. En última instancia, se utiliza microscopía de fluorescencia para visualizar la fluorescencia específica de genes en células diana vivas, mientras que el análisis mediante citometría de flujo se emplea para cuantificar el número de células fluorescentes.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inmunohistoquímica, las balizas moleculares o el análisis por PCR, es que la expresión génica puede observarse visualmente en células vivas sin ninguna manipulación del cultivo celular. El procedimiento será demostrado por Martina Teresa, bióloga y estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, y Lynette Henkel, para la citometría de flujo. Después de determinar las secuencias diana, solicite nanopartículas de oro liofilizadas de fuentes comercialmente disponibles.

Estas partículas están compuestas por una partícula central de oro unida covalentemente a una cadena de captura, la cual está ligada a una cadena reportera. Cuando el ARNm diana se une a la cadena de captura, la cadena reportera y su fluoróforo vinculado se liberan en la solución, permitiendo que Fluor four emita fluorescencia. Antes de la reconstitución.

Las nanopartículas deben almacenarse a cuatro grados Celsius en la oscuridad dentro de una caja de cartón. Para reconstituir las nanopartículas de oro, agregue 20 microlitros de agua doblemente destilada, obteniendo una concentración final de 100 nano molares. Las nanopartículas reconstituidas pueden almacenarse a temperatura ambiente en la oscuridad durante al menos un año.

El día de la aplicación, diluya la solución stock de nanopartículas de oro hasta una solución de trabajo 20 x en PBS; retire una placa de 24 pocillos que contenga células HEK 293 del incubador de cultivo celular, aspire el medio y luego agregue 237,5 microlitros de medio de cultivo fresco. A continuación, pipetee 12,5 microlitros de la solución de trabajo de nanopartículas en cada pocillo preparado y agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las nanopartículas. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5 %CO₂ en una atmósfera humedecida. Al día siguiente.

Analice los cultivos celulares en busca de fluorescencia específica del sitio génico tres utilizando un microscopio fluorescente estándar para preparar las células para citometría de flujo. Lave las células HEK 293 que muestran fluorescencia inducida en el sitio tres una vez con PBS y agregue un mililitro de tripsina 0,05 % EDTA, incube las células durante tres minutos a 37 °C y 5 % de CO2. Después de la incubación, agregue 0,5 mililitros de medio CO y pipetee hacia arriba y hacia abajo.

Luego, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Añada tres mililitros de medio de cultivo y centrifugue el tubo durante cinco minutos a 300 ×g. A continuación, elimine el sobrenadante y resuspenda las células en 200 microlitros de tampón de fax frío con hielo. Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros y almacénelas en hielo a oscuras hasta el análisis.

Antes del análisis por citometría de flujo, pase las células a través de un filtro de 30 micrómetros para evitar la agregación celular. Luego, agregue yoduro de propidio a las células hasta una concentración final de dos microgramos por mililitro durante al menos dos minutos, lleve las células al vórtex del citómetro de flujo y cargue el tubo de muestra en el dispositivo. Para detectar células positivas para SI tres.

Utilice células de control no tratadas para establecer las compuertas jerárquicas en el área de dispersión directa o FSC frente al área de dispersión lateral o SSC, el FSC altura frente al FSC anchura y el SSE altura frente al SSE anchura, con el fin de excluir restos celulares y células no dispersadas uniformemente. Elimine las células muertas del análisis según la tinción con yoduro de propidio mostrando el canal PE frente al canal PE Texas Red y luego realice la compuerta final de ordenación en las células PE positivas del sitio tres. Detección de GA dh.

Se realizó un gen de referencia constitutivamente expresado en células HEK 293 para validar la viabilidad experimental. Las nanopartículas de control negativo aleatorizadas muestran poca o ninguna fluorescencia, mientras que la incorporación positiva permanente fluoresce. Los controles muestran una señal intensa tras la incubación nocturna.

Se demostró que estas nanopartículas detectan específicamente los marcadores de células madre pluripotentes, la expresión génica de nano y GDF tres, en células madre pluripotentes inducidas humanas y porcinas o CIPs. Es importante destacar que estos marcadores solo se detectaron en las CIPs y no en las células de fibroblastos que sirvieron como capa alimentadora durante el cultivo de células CIPs. Se utilizó tanto análisis visual como cuantitativo mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia de marcado de las nanopartículas GA DH en su edición graduada de nanopartículas desde cero hasta 1000.

Se realizó PICO molar con células HEK 293, lo que demostró un aumento claro y dependiente de la concentración en la fluorescencia. Luego se llevó a cabo un análisis cuantitativo en células madre embrionarias murinas, que mostraron aproximadamente un 40 % de células positivas para CY tres tras la adición de nanopartículas de GA DH a 400 PICOMOLAR. Se obtuvieron valores similares para los marcadores de pluripotencia.

Nano y GDF tres Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de 16 horas si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar nanopartículas específicas para genes con el fin de detectar directamente la expresión génica intracelular en células vivas mediante microscopía de fluorescencia.