La detección de Intracelular expresión génica en células vivas de murino, humano y porcino Origen Utilizando nanopartículas fluorescencia marcado

El objetivo general de este procedimiento es analizar la expresión génica intracelular directamente en células vivas mediante la aplicación de nanopartículas fluorescentes específicas de genes. Esto se logra definiendo primero las secuencias diana apropiadas en el gen de interés. El segundo paso es fabricar nanopartículas con hebras específicas de captura y reporteras.

A continuación, las nanopartículas se añaden directamente al medio de cultivo de la célula viva. El paso final es incubar las células con las nanopartículas durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se utiliza para visualizar la fluorescencia específica de un gen en células diana vivas, mientras que el análisis de citometría de flujo se utiliza para cuantificar el número de células fluorescentes.

La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como la inmunohistoquímica, los beacons moleculares o el análisis de PCR, es que la expresión génica se puede observar visualmente en células vivas sin necesidad de manipular el cultivo celular. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Martina Teresa, bióloga y doctoranda de nuestro laboratorio, Lynette Henkel, para la citometría de flujo. Después de determinar las secuencias objetivo, solicite nanopartículas de oro liofilizadas de fuentes disponibles comercialmente.

Estas partículas están compuestas por una partícula central de oro unida covalentemente a una hebra de captura, que a su vez está unida a una hebra reportera. Cuando el ARNm objetivo se une a la hebra de captura, la hebra reportera y su fluoróforo unido se liberan en la solución, lo que permite que el fluor cuatro emita fluorescencia. Antes de la reconstitución.

Las nanopartículas deben almacenarse a cuatro grados centígrados en la oscuridad en una caja de cartón. Para reconstituir las nanopartículas de oro se añaden 20 microlitros de agua bidestilada, lo que da como resultado una concentración final de 100 nano molares. Las nanopartículas reconstituidas pueden almacenarse a temperatura ambiente en la oscuridad durante al menos un año.

El día de la aplicación, diluya la solución madre de nanopartículas de oro en una solución de trabajo de 20 x en PBS, retire una placa de 24 pocillos que contenga células HEK 2 93 de la incubadora de cultivo celular, aspire el medio y luego agregue 237,5 microlitros de medio de cultivo fresco, luego pipetee 12,5 microlitros de la solución de trabajo de nanopartículas en cada pocillo preparado y agite la placa para garantizar una distribución uniforme de las nanopartículas. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. Al día siguiente.

Analice los cultivos celulares para la fluorescencia del sitio tres del gen específico utilizando un microscopio fluorescente estándar para preparar las células para la citometría de flujo. Lave las células HEK 2 9 3 que muestran fluorescencia inducida por el lado tres una vez con PBS y agregue un mililitro de 0,05% de tripsina EDTA, incube las células durante tres minutos a 37 grados Celsius y 5% de CO2. Después de la incubación, agregue 0,5 mililitros de medio CO y pipetee hacia arriba y hacia abajo.

Luego transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Agregue tres mililitros de medio de cultivo y centrifugue el tubo durante cinco minutos a 300 veces G. A continuación, retire el estado y vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón de fax helado. Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros y guárdelas en hielo en la oscuridad hasta su análisis.

Antes del análisis por fax, pase las células a través de un filtro de 30 micrómetros para evitar la agregación de células. A continuación, añada yoduro de propidio a las células a una concentración final de dos microgramos por mililitro durante al menos dos minutos, lleve las células al vórtice del citómetro de flujo y cargue el tubo de muestra en el dispositivo. Para detectar el SI, tres células positivas.

Utilice celdas de control sin tratar para establecer las puertas jerárquicas en el subconjunto de dispersión directa o área FSC frente a dispersión lateral o área SSC, la altura FSC frente a FSC con subconjunto y la altura SSE frente a SSE con subconjunto para excluir los residuos de celda y las celdas no dispersas. Elimine las células muertas del análisis basado en la tinción con yoduro de propidio mostrando el canal de PE contra el canal rojo de Texas de PE y, a continuación, realice la puerta de clasificación final en el sitio de tres células positivas para PE. Detección de GA dh.

Se realizó un gen de mantenimiento expresado constitutivamente en células HEK 2 93 para validar la viabilidad experimental. Las nanopartículas de control negativo revueltas muestran poca o ninguna fluorescencia mientras que la absorción positiva fluorescente es permanente. Los controles muestran una señal fuerte después de la incubación durante la noche.

Se demostró que estas nanopartículas detectan específicamente los marcadores de células madre pluripotentes, la expresión génica nano y GDF tres en células madre pluripotentes inducidas o IPC inducidas por humanos y porcinos. Es importante destacar que estos marcadores solo se detectaron en los IPC y no en las células de fibroblastos que sirvieron como capa alimentadora durante el cultivo de células IPS. Se utilizaron análisis visuales y cuantitativos mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia de etiquetado de las nanopartículas GA DH con una clasificación de nanopartículas de cero a 1000.

El PICO molar se realizó con células HEK 2 93, que demostraron un claro aumento de la fluorescencia dependiente de la concentración. A continuación, se realizó un análisis cuantitativo en células madre embrionarias murinas, que mostraron aproximadamente un 40% CY tres células positivas tras la edición de 400 nanopartículas PICOMOLAR GA DH. Se obtuvieron valores similares para los marcadores de pluripotencia.

Nano y GDF tres Una vez masterizado. Esta técnica se puede realizar dentro de las 16 horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar nanopartículas específicas de genes para detectar la expresión génica intracelular directamente en células vivas mediante microscopía de fluorescencia.