La repoblación de las células epiteliales y Preparación de roedores matriz extracelular andamios para el Desarrollo del tejido renal

El objetivo general de este procedimiento es repoblar andamios de matriz extracelular de riñón de roedor tridimensional acelular con células epiteliales renales humanas. Esto se logra mediante la descelularización inicial de un riñón de rata con una serie de soluciones de detergente perfundidas a través de la arteria renal durante un período de 26 horas. A continuación, se esteriliza el riñón y se inyectan 40 millones de células epiteliales renales humanas, corticales, tubulares, epiteliales o RCTE, bajo perfusión arterial anterógrada continua dentro de un sistema de reactor Biore diseñado a medida.

En última instancia, la capacidad de las células RCTE para repoblar el andamio renal se puede evaluar mediante ensayo de perfusión y RE y análisis inmunohistoquímico. Esta técnica de cultivo celular en 3D permite a los investigadores repoblar la matriz extracelular de todo el órgano. Las células de andamio se depositan dentro del espacio peritubular dentro de la matriz extracelular para permitir la investigación y la unión de factores que influyen en el crecimiento, la diferenciación y la maduración celular.

La principal ventaja de esta técnica sobre métodos alternativos como la fabricación de andamios de polímeros sintéticos, es que la matriz extracelular renal facilita la adhesión, proliferación y maduración de las células perfundidas dentro de una intrincada red de proteínas estructurales naturales, factores de crecimiento y otros componentes biológicos. Comience el procedimiento de descelularización conectando el catéter de la arteria renal de cada riñón descongelado al extremo del tubo del circuito de perfusión aguas abajo de la bomba, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas en el catéter. Si hay burbujas de aire en el catéter, use una micropipeta de 200 microlitros para extraer las burbujas y llenar el catéter con líquido.

Suspenda el riñón a lo largo de la pared interna de un vaso de precipitados vacío de cinco litros para que la arteria renal no se tuerza ni se enrolle, y ajuste el accionamiento de la bomba a cinco mililitros por minuto. A continuación, pulse el botón de inicio, después de confirmar que cada riñón se está perfundiendo observando el goteo de soluciones desde el fondo del órgano, más cada riñón con las soluciones adecuadas según lo designado en el diagrama de flujo, al final de la perfusión almacene los riñones descelularizados en PBS en un tubo cónico de 50 mililitros a cuatro grados centígrados o un máximo de dos. Después de montar el circuito de perfusión, retiramos el tapón de rosca rojo del cabezal del biorreactor y pipeteamos 50 mililitros de una solución de etanol al 0,1% por ácido acético y al 4% en el depósito del medio a través de la abertura.

Con un cartucho de bomba grande, conecte el segmento de tubería de la bomba peristáltica al cabezal de la bomba. A continuación, ajuste el caudal a cinco mililitros por minuto. Presione el inicio y deje que el circuito se cebe cuando el líquido llene la línea de profusión y llegue al puerto abierto restante de la llave de paso de tres vías.

Use un tapón de señuelo macho para enchufar el puerto. Deje que el circuito se cebe completamente hasta que no se observe aire en el tubo del circuito de perfusión o en el interior de la entrada. El aceptor de señuelos expulsa las burbujas del circuito de perfusión aumentando temporalmente el caudal de la bomba.

Cuando el sistema esté completamente cebado, detenga el accionamiento de la bomba y esterilizará pinzas de seis pulgadas. Para conectar con cuidado el extremo del señuelo hembra del catéter de la arteria renal en la entrada del macho, coloque el aceptor de señuelo en la superficie interna del cabezal del biorreactor, asegurándose de que la conexión esté apretada y que no quede aire en el catéter. Permita que el riñón cuelgue suavemente del catéter de la arteria renal para que la arteria renal no se tuerza ni se retuerza.

A continuación, apriete la abrazadera metálica que sujeta la cabeza y el cuerpo del biorreactor de forma que el depósito del biorreactor quede herméticamente sellado y cierre el tapón de rosca. Ahora esterilice los riñones con una perfusión a temperatura ambiente de la solución de etanol de ácido peracético a cinco mililitros por minuto. Después de una hora, detenga la bomba y abra el tapón de rosca rojo.

Con una plaga estéril, la pipeta aspira cuidadosamente toda la solución del depósito del biorreactor. A continuación, pipetee 50 mililitros de PBS fresco en el depósito del biorreactor. Cierre el tapón de rosca y ponga en marcha la bomba para tres perfusiones secuenciales de una hora a temperatura ambiente a cinco mililitros por minuto.

Después del enjuague final de PBS, aspire la solución salina del depósito y agregue 50 mililitros de medio al depósito con un tapón de rosca cerrado. Transfiera el biorreactor con el circuito de perfusión adjunto a una incubadora de gran capacidad a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, conecte el circuito de perfusión del biorreactor a la bomba y perfunda los riñones a cuatro mililitros por minuto durante al menos una hora antes de la siembra.

Para celularizarse, los riñones recogen un número suficiente de matraces de cultivo para la concentración de asiento deseada. A continuación, después de aspirar el medio de cultivo de cada matraz, utilice 10 mililitros de la enzima disociadora de células adecuada para levantar las células epiteliales tubulares corticales renales del matraz a 37 grados centígrados. Después de 10 minutos, comience a revisar los matraces en un microscopio de contraste facial cada dos minutos hasta que se observe el desprendimiento del pliegue.

Luego, después de tomar una pequeña alícuota de células para el recuento, diluya la suspensión celular asociada en un volumen igual de medio premed y centrifugue las células resus. Suspender el pellet con un volumen adecuado de medio de cultivo para obtener una concentración final de dos veces 10 a la séptima celdas por mililitro. Transfiera dos mililitros de la suspensión del asiento, una placa de cultivo de 35 milímetros, y luego extraiga el volumen de dos mililitros en una jeringa estéril de cinco mililitros.

Transfiera el biorreactor de perfusión a una cabina de seguridad biológica y gire la válvula de llave de paso para cerrar el flujo al puerto de asiento. Retire el deslizamiento del señuelo macho, conéctelo de la llave de paso y conecte la jeringa. A continuación, transfiera rápidamente el circuito de perfusión a la incubadora y utilice el cartucho de bomba grande para asegurar el segmento del tubo peristáltico de la bomba al cabezal de la bomba para asentar las células.

Cierre el puerto de la válvula de llave de paso apuntando hacia la bomba e inyecte lentamente las células en el andamio renal. Luego gire la válvula de paso para cerrar el flujo de la jeringa y encienda la bomba a 25 mililitros por minuto. Después de 15 minutos, baje el caudal de la bomba a cuatro mililitros por minuto, reemplazando el medio al día siguiente y cada dos días a partir de entonces.

Para evaluar la viabilidad y proliferación de las células, intercambie asépticamente el medio de cultivo con 10 mililitros de solución de trabajo de zarina para una perfusión de cuatro mililitros por minuto de los andamios renales después de exactamente una hora, recoja la solución de zarina condicionada y parcialmente reducida y realice otra perfusión de cuatro mililitros por minuto. Con 100 mililitros de cultivo fresco, los riñones medianos profundidos secuencialmente con agua y soluciones detergentes diluidas se volvieron progresivamente más transparentes durante un período de 26 horas por la perfusión final del detergente, la red vascular de los riñones y, en particular, los vasos interlobulables se muestran de manera prominente en el andamio descelularizado. Todo el órgano se limpia de células nativas, dejando atrás la membrana basal intacta, la red de túbulos glomérulos y conductos colectores y la matriz extracelular de vasos sanguíneos descelularizados.

Además de los vasos más grandes, las membranas basales microvasculares dentro de los glomérulos también conservan su integridad estructural. Las células RCTE sembradas en el andamio renal, como se acaba de demostrar, se encuentran principalmente en las regiones corticales del andamio renal, donde repueblan preferentemente los túbulos glomerulares pereg. Pocas células se incrustan dentro de los glomérulos en el primer día después de la siembra, y para el séptimo día, los glomérulos están prácticamente desprovistos de células, mientras que la mayoría de estas células ocupan las regiones corticales de la matriz extracelular renal.

Después de siete días de cultivo de perfusión anterógrado, muchos túbulos de la línea RCTE están presentes en los túbulos medulares y papilares externos y se reúnen patos después de la repoblación de células RCTE y una semana de cultivo de perfusión. Sin embargo, la transparencia observada después de la descelularización se pierde y el riñón parece opaco y más cercano en apariencia a su estado nativo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis inmunoquímico de medios de cultivo condicionados para responder preguntas adicionales como, ¿cómo cambian los estados metabólicos o fenotípicos de estas células dentro de la matriz extracelular renal?

La capacidad de desarrollar andamios extracelulares y de añadir las ventas de donantes a la matriz permite a los investigadores delinear el crecimiento y la maduración en tres dimensiones dentro de los andamios de matriz exo renal natural. El objetivo final es utilizar esta tecnología como herramienta para comprender mejor los mecanismos de reparación y regeneración renal.