Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana
14 de diciembre de 2015
El objetivo de este artículo es proporcionar un protocolo completo y detallado sobre cómo generar piel organotípica humana modificada genéticamente a partir de queratinocitos epidérmicos y dermis humana desvitalizada.
El objetivo general de este procedimiento es generar cultivos de piel organotípica modificados genéticamente utilizando dermis humana revitalizada para determinar el impacto de la expresión génica alterada en el crecimiento y la diferenciación epidérmica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la dermatología, como determinar qué genes son responsables del crecimiento epi, la diferenciación y la progresión a la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que en pocos días se genera piel humana genéticamente alterada, lo que permite el estudio de muestras humanas potencialmente relevantes clínicamente.
La demostración del procedimiento será hecha por mi laboratorio. Si recibe piel humana congelada, coloque el tejido en la campana de cultivo de tejidos durante tres a cinco minutos para descongelar. Una vez descongelado, transfiera el tejido a un tubo cónico estéril de 50 mililitros o a una botella de 125 mililitros, según el tamaño.
A continuación, agregue cuatro x penicilina y estreptomicina en un XPBS hasta que el recipiente esté lleno al 75%. Tape el recipiente y agite vigorosamente durante cinco minutos. Retire la solución antibiótica y repita esto.
Paso tres veces más después del último lavado, transfiera el pañuelo a un nuevo recipiente y agregue una solución antibiótica fresca. Incubar esta mezcla en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados durante dos semanas para permitir la separación de la dermis de la epidermis. Cuando hayan transcurrido dos semanas, use fórceps para despegar la epidermis de la dermis.
Deseche la epidermis de acuerdo con el protocolo de la institución para el tratamiento de tejido humano. Coloque la dermis en un recipiente con solución antibiótica y lave agitando vigorosamente como antes. Después del último lavado, transfiera la dermis a un nuevo recipiente de solución antibiótica y almacene a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar el día antes de la transfección.
El día de la transfección, mezcle seis microlitros de reactivo de transfección con 100 microlitros de dmm. Para cada pocillo que se va a transfectar e incubar a temperatura ambiente Durante cinco minutos, agregue la mezcla a un tubo que contenga tres microgramos de vector retroviral para cada pocillo a transfectar e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos, agregue toda esta mezcla gota a gota a cada pocillo de las células fénix e incube las células durante la noche del día siguiente a la transfección. Retire los medios de las celdas fénix y agregue dos mililitros de medios completos frescos el mismo día.
Resuspenda los queratinocitos humanos primarios en un medio libre de suero de queratinocitos con antibióticos y siembre en seis placas de pared a una densidad de 75.000 células por pocillo. Al día siguiente, cosecha el medio que ahora contiene partículas virales de las células Phoenix transfectadas. Pase el medio a través de un filtro de 0,45 micras con una jeringa para eliminar cualquier célula contaminante.
Agregue cinco microgramos por mililitro de bromuro de hexa dimetilo al medio que contiene el virus filtrado para ayudar a mediar el proceso de infección. A continuación, pipetea dos mililitros del virus sobre los queratinocitos sembrados el día anterior. A continuación, gire las seis placas de pared en una centrífuga a 200 G durante una hora a temperatura ambiente.
Después del centrifugado, retire y deseche los medios que contienen virus. Lave las celdas una vez con un XPBS y luego agregue K-C-S-F-M fresco al día siguiente. Infecte el mismo lote de queratinocitos con el virus utilizando el procedimiento que se acaba de mostrar.
Para hacer casetes organotípicos. Use una cauteria para quitar un cuadrado de un centímetro por un centímetro del centro de la tapa de una placa de cultivo de tejidos de 3,5 centímetros. Coloque clavijas cuadradas en la parte inferior del casete con esmalte de uñas transparente y espere cinco minutos para que el esmalte de uñas se seque.
Finalmente, voltee el casete y colóquelo en un plato de seis centímetros con un casete apoyado en las clavijas. Recupere la dermis del almacenamiento de cuatro grados centígrados y transfiérala a un recipiente de crecimiento de queratinocitos. Medio para lavar.
Después de repetir el lavado, coloque la dermis en KGM fresco e incube a 37 grados centígrados durante dos días. Después de la incubación, use un bisturí para cortar la dermis en trozos de 1,5 centímetros por 1,5 centímetros. A continuación, colóquelo en el orificio cuadrado del organotípico con la parte superior de la dermis hacia arriba.
Use fórceps para voltear todo el casete organotípico que contiene la dermis. Agregue cinco gotas de matriz extracelular recién hecha, en la parte inferior de la dermis y agite ligeramente para asegurar una distribución uniforme a través de la dermis. Después de permitir que la matriz extracelular se solidifique durante cinco minutos, use fórceps para voltear el casete y luego agregue cuatro mililitros de KGM al plato de seis centímetros.
A continuación, después de recolectar y contar los queratinocitos modificados genéticamente, Resus suspende de 0,5 a 1 millón de células en 90 microlitros de KGM y dispensa las células en la dermis. Incubar el cocultivo a 37 grados centígrados. Cambia los medios de comunicación sobre las culturas cada dos días.
La estratificación y diferenciación completa de la epidermis generalmente ocurre después del quinto día. El tejido se puede recolectar hasta 14 días después de la siembra. Esta imagen muestra la tinción de hematina y eosina de organotípico.
Cultivos cutáneos La piel humana regenerada contiene tanto la epidermis como la dermis. La epidermis está completamente estratificada y diferenciada con cuatro capas distintas, que incluyen la capa basal indiferenciada y las tres capas diferenciadas que incluyen el estrato, el espinoso, el ranum y el cornio. Estas imágenes de inmunofluorescencia demuestran que la sobreexpresión de SNA i dos, como se muestra a la derecha, inhibe la diferenciación epidérmica en comparación con el tejido de control que se muestra a la izquierda, tiñendo para la diferenciación.
La proteína queratina uno o K uno se muestra en verde y los núcleos se marcan en azul. El análisis RTQ PCR R para medir los niveles de ARNm de SNAI dos en el tejido de sobreexpresión de LAC Z y S NNA I dos de control demuestra una expresión superior a 50 veces de SNAI dos en relación con el control. Finalmente, este análisis RTQ PCR R demuestra que la sobreexpresión de SNA I dos da lugar a la pérdida de expresión de genes estructurales inducidos por la diferenciación, como TGM uno y SPRR uno A. Siguiendo este procedimiento.
Se pueden realizar otros métodos como el chipsy, la inmunofluorescencia, la RN, la ae o la Western blot para determinar los mecanismos de crecimiento y diferenciación epidural. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la dermatología exploraran cómo la función de los genes alterados afecta la homeostasis de la piel. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar cultivos de piel humana orgánica modificada genéticamente utilizando queratinocitos y dermis humana
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para generar piel organotípica humana modificada genéticamente a partir de queratinocitos epidérmicos y dermis humana desvitalizada. El método tiene como objetivo investigar los efectos de la expresión génica alterada sobre el crecimiento y la diferenciación de la piel.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Dermatología
- Ingeniería genética
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- Comprender los roles de los genes en la biología de la piel es fundamental para la investigación dermatológica.
- Los modelos de piel modificada genéticamente pueden proporcionar información sobre los mecanismos de las enfermedades.
- La generación rápida de muestras de piel humana es beneficiosa para la relevancia clínica.
- La dermis humana revitalizada se utiliza para crear cultivos organotípicos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para crear cultivos cutáneos organotípicos modificados genéticamente.
- Explorar el impacto de alteraciones genéticas específicas en el crecimiento y la diferenciación de la piel.
- Facilitar la investigación sobre las funciones génicas relacionadas con enfermedades cutáneas.
Métodos Utilizados
- Descongelar piel humana congelada en un ambiente estéril.
- Transferir el tejido a recipientes estériles para cultivo.
- Utilizar queratinocitos epidérmicos para la generación de modelos de piel.
- Controlar el crecimiento y la diferenciación de cultivos organotípicos.
Resultados principales
- Generación exitosa de piel modificada genéticamente en cuestión de días.
- Identificación de genes que influyen en el crecimiento y la diferenciación epidérmica.
- Aplicaciones potenciales en el estudio de enfermedades cutáneas y terapias.
- Demostración de la eficiencia y relevancia clínica del método.
Conclusiones
- El protocolo permite la generación rápida de modelos humanos de piel.
- Proporciona una plataforma para investigar las funciones génicas en dermatología.
- Esta técnica puede avanzar en la comprensión de enfermedades relacionadas con la piel.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los cultivos organotípicos de piel modificados genéticamente que utilizan dermis humana desvitalizada proporcionan una plataforma sólida y relevante para el ser humano que permite investigar la función génica en el crecimiento y la diferenciación epidérmicos. Este sistema posibilita la modelización rápida y reproducible de las vías genéticas implicadas en la homeostasis y enfermedad de la piel, lo que respalda la confianza predictiva en la validación temprana de dianas dermatológicas. El enfoque conecta la biología del descubrimiento con la investigación traslacional al permitir la reducción de riesgos mecanicistas y la genómica funcional en un contexto tridimensional fisiológicamente relevante.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación directa de la función génica en la diferenciación y estratificación epidérmica humana.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al vincular perturbaciones genéticas con resultados fenotípicos en un contexto tisular.
- Facilita la identificación de vías genéticas críticas para la homeostasis cutánea y la progresión de enfermedades.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un modelo humano de piel 3D validado para perfiles de expresión génica y ensayos de inmunotinción.
- Permite la medición reproducible y cuantitativa de marcadores de diferenciación y proteínas estructurales.
- Facilita la estandarización de ensayos para evaluar intervenciones genéticas o farmacológicas en la biología de la piel.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos de tejido humano relevantes para la enfermedad en la descubrimiento traslacional de biomarcadores.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento genético hasta la validación preclínica de los mecanismos de enfermedades cutáneas.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de dianas dermatológicas basado en datos funcionales humanos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir la manipulación genética, la selección fenotípica y la validación mecanicista en un solo flujo de trabajo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función génica en el crecimiento y la diferenciación epidérmicos.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para la expresión de marcadores y la arquitectura del tejido.
- Análisis: Permite el perfilado de expresión génica, la inmunotinción y la secuenciación por inmunoprecipitación de cromatina.
- Investigación Traducional: Ofrece un sistema relevante para humanos en la alineación de biomarcadores y la modelización de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Brinda una plataforma escalable y reutilizable para diversos estudios genéticos y farmacológicos en biología cutánea.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación cutánea.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo para la manipulación genética y el cultivo de tejidos, mejorando la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del desarrollo y la eficiencia del capital al proporcionar datos funcionales tempranos en modelos de tejido humano.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos y vías dermatológicos para su avance.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo primario de células humanas y manipulación genética.
- Exige acceso a instalaciones de cultivo celular, sistemas de transducción viral y plataformas analíticas para la expresión génica y proteica.
- Necesita estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad entre experimentos y sitios.
- Puede requerirse adaptación para diferentes constructos genéticos o mutaciones relevantes para enfermedades.
- Las limitaciones incluyen la dependencia de la disponibilidad de tejido humano primario y la posible variabilidad del material de donante.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Preparation of Devitalized Human Dermis
2:21
Genetic Modification of Primary Human Keratinocytes
4:33
Building an Organotypic Cassette
5:09
Organotypic Skin Cultures
7:03
Results: Morphology and Gene Expression Analysis of Genetically Modified Human Epidermis
8:28
Conclusion
