Campo geomagnético (Gmf) y evolución de las plantas: La investigación de los efectos de Gmf Reversión en

El objetivo general de este procedimiento es producir la inversión del campo magnético terrestre o CMT mediante bobinas de Helmholz controladas por una fuente de alimentación. En última instancia, se demuestra que la inversión del CMT afecta la morfología y la expresión génica de las plantas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la evolución vegetal, como si la inversión del campo magnético terrestre podría haber desempeñado un papel en la evolución y adaptación de las plantas.

La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse para evaluar posibles efectos biológicos de campos magnéticos débiles en un organismo modelo sencillo que puede cultivarse con muchas réplicas, todas bajo condiciones rigurosamente controladas. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Alberto Bocco y un estudiante guiado de mi laboratorio, así como de Kiara aa. Ella es estudiante de doctorado en mi laboratorio y CIA Bertea, quien es profesora asociada en mi grupo.

Para comenzar, encienda las tres fuentes de alimentación de corriente continua conectadas a los tres pares de bobinas de Helmholz, y encienda el magnetómetro de tres ejes cuyo sensor está insertado en las bobinas triaxiales. Encienda la computadora y lance el software del magnetómetro que permite recopilar datos del magnetómetro de tres ejes. Las fuentes de alimentación también están conectadas a una computadora mediante una conexión A-G-P-I-B para su control.

Configure los voltajes de las fuentes de alimentación para generar el campo magnético deseado con un vector de campos magnéticos invertido, como se describe en el protocolo del texto. Coloque las semillas del ecotipo Columbia de Arabidopsis Aliana en un tubo de 1,5 mililitros, cuya superficie haya sido esterilizada mediante tratamiento con una solución de hipoclorito de calcio durante 10 a 12 minutos a 25-28 grados Celsius con agitación continua. Luego, enjuague las semillas dos veces con etanol al 80 %, seguido de un lavado con etanol al 100 %.

Y finalmente, un enjuague con agua destilada estéril. Prepare un litro de medio Murrah Shiga y SCOG modificado según se describe en el protocolo escrito antes de la solidificación. Vierta 80 mililitros de medio en cada placa de Petri cuadrada, colocando 30 semillas estériles por placa.

Luego, selle las placas con una película de cera. Incube las placas horizontalmente en oscuridad a cuatro grados Celsius durante dos días para potenciar y sincronizar la germinación. Prepare lámparas de vapor de sodio cubriendo el foco con una lámina de gelatina azul para reducir la componente roja de las lámparas tras la vernalización.

Prepárese para exponer las placas de Petri al GMF normal o invertido. Exponga las semillas en un ambiente con control climático a 22 grados Celsius en posición vertical. En experimentos paralelos, tanto fuera como dentro de las bobinas triaxiales.

Bajo un régimen de fotoperíodo de ocho horas de oscuridad y 16 horas de luz. Después de la exposición, tome fotografías de las placas de Petri para calcular la longitud de las raíces y las áreas foliares. Primero, mida el lado de la placa de Petri.

Luego, abra la imagen de la placa de Petri en el software ImageJ y use la opción de línea recta para dibujar una línea que cruce exactamente el lado de la placa. En el menú Analizar, seleccione Establecer escala e inserte la distancia real en el cuadro de Distancia conocida. A continuación, inserte la unidad de longitud.

Y finalmente, haga clic en la opción global para hacer que la configuración esté disponible para todas las mediciones de longitud de raíz. Siga cuidadosamente la forma de la raíz utilizando la herramienta de trazo libre. Mida la longitud utilizando la opción de medición en el menú de análisis.

Continúe midiendo todas las raíces en la imagen y guarde el archivo para un análisis estadístico posterior. Para el área foliar, en el menú de imagen, utilice la opción ajustar, seguida de umbral de color, seleccione la hoja individual y, en el menú analizar, seleccione analizar partículas; guarde las mediciones individuales para el análisis estadístico. Recolecte 30 brotes y 30 raíces por separado e inmediatamente congélelos en nitrógeno líquido.

Luego, muela en nitrógeno líquido con mortero y pistilo antes de aislar el ARN total según se describe en el protocolo escrito; realice todos los experimentos en un sistema en tiempo real utilizando cyber green one con ROX como estándar interno de carga. Realice la reacción con una mezcla de 25 microlitros. Utilice los cebadores listados en el protocolo escrito e incluya controles sin transcriptasa inversa para monitorear la contaminación por ADN genómico, así como controles sin molde. Lea la fluorescencia tras cada fase de hibridación y extensión.

Las dos lentes de aumento representan los datos recopilados, que incluyen curvas de hibridación y disociación. Navegue hasta la pantalla de análisis y configuración y asegúrese de que el conjunto de datos recopilado durante el segmento de disociación del experimento esté seleccionado. Para el análisis de todas las corridas, realice un análisis de curva de fusión desde 55 hasta 95 grados Celsius incluyendo el segmento de disociación en el perfil térmico.

Utilice la pantalla de curva de disociación accediendo a través de la pestaña de resultados para ver el perfil de disociación. Analice todos los trazados de amplificación con el software del instrumento de PCR en tiempo real.

Para obtener los valores de CT, calibre y normalice los niveles relativos de ARN con respecto al nivel de los mejores genes de referencia. Acceda a la pantalla de gráficos de amplificación a través de la pestaña de resultados. Seleccione la rampa o la meseta para la cual se deben analizar los datos utilizando la pantalla de análisis, selección y configuración.

Luego, seleccione la fluorescencia normalizada corregida por la línea base en el menú de fluorescencia del panel de comandos. Acceda a la pantalla de valores de muestra de la placa a través de la pestaña de resultados. Para mostrar los valores de CT de los pocillos muestreados.

Utilice cuatro genes de referencia diferentes para normalizar los resultados de la PCR en tiempo real. Seleccione el gen mejor clasificado mediante el software de análisis y utilice el gen más estable para la normalización. Organice brevemente los datos de entrada en una hoja de Excel con la primera columna conteniendo los nombres de los genes y la primera fila conteniendo los nombres de las muestras.

Luego seleccione el software de análisis desde la barra de menú. Utilice el cuadro de diálogo para seleccionar los datos de entrada. A continuación, verifique los nombres de las muestras de campo, los nombres de los genes y la opción de salida simple únicamente.

Haga clic en el botón de inicio Para realizar el análisis, seleccione el gen con mayor puntuación como el gen candidato con expresión más estable. Después de 10 días de exposición, las plantas control muestran una longitud de raíz significativamente mayor y folíolos más desarrollados en comparación con las plantas expuestas a condiciones de GMF invertido tras 10 días de exposición. El efecto de la inversión del GMF fue un cambio drástico en la expresión génica de todos los genes analizados, incluyendo crucífera en tres proteína transportadora de cobre uno y factor de transcripción sensible a redox uno. Las barras indican el error estándar; el asterisco indica diferencias significativas entre las plantas expuestas a condiciones de GMF invertido y normal.

El efecto de la inversión del GMF no indujo cambios significativos en la expresión génica de las partes aéreas. Sin embargo, se observó una marcada regulación negativa en la expresión génica de las raíces de las plantas cultivadas. Bajo condiciones de GMF inverso, estos genes incluyen thal, aate peroxidasa, aate peroxidasa, una superóxido dismutasa de hierro, una N-A-D-P-H, oxidasas de estallido respiratorio, proteína y catalasa tres.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuestión de minutos hasta en un solo día, según lo requiera el experimento, siempre que se realice correctamente. Después de ver este video, deberías tener una buena idea de cómo invertir o alterar el campo geomagnético y de cómo realizar estudios morfológicos y genéticos en plantas expuestas. Al intentar este procedimiento, es importante eliminar cualquier fuente de campo magnético de la región rodeada por las bobinas en forma de casco.

Es importante que las bobinas del casco y sus generadores no generen calor ni vibraciones. El investigador debe permanecer ciego respecto a la condición de exposición al campo magnético hasta que se hayan registrado los datos finales. Esta técnica ha permitido a los investigadores en magnetorrecepción explorar el efecto de los campos magnéticos sobre la evolución de las plantas, el comportamiento y la navegación animal, y sobre líneas celulares humanas.

En el futuro, esperamos realizar estudios similares en microgravedad con el fin de evaluar cómo la alteración del campo magnético afectará el crecimiento de las plantas en condiciones espaciales. Se considera que trabajar con sistemas que generan campos magnéticos débiles no es peligroso. Sin embargo, debe tomar las precauciones habituales y debe consultar a un electricista calificado antes de trabajar con equipos como las fuentes de alimentación para los pares de bobinas de Helm.