Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

El objetivo general de esta técnica es utilizar las células endoteliales como un nuevo tipo de modelo de célula presentadora de antígeno planar para investigar los procesos fundamentales de señalización antigénica. Este método puede ayudarnos a abordar preguntas clave en el campo de la inmunidad adaptativa, como la forma en que las dinámicas de remodelación subcelular y molecular se coordinan espacial y temporalmente dentro de la sinapsis inmunológica. La principal ventaja de esta técnica es que el endotelio se forma de forma prácticamente plana una superficie de PC.

Esto permite obtener imágenes con una resolución espacio-temporal óptima dentro del contexto de una superficie celular fisiológicamente compleja y moldeable. Aunque este método se centra en la activación de células de memoria efectoras CD cuatro TH positivas, también se puede aplicar para el estudio de una variedad de tipos de células T, antígenos y procesos de señalización. Hoy, Chris y yo le mostraremos cómo realizar el segundo Comience por código seccionando células endoteliales microvasculares primarias de pulmón humano o dérmicas con YFP de membrana y rojo DS soluble a través de la afección nuclear NU y placa las células transfectadas en placas de cultivo de imágenes celulares vivas.

Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo celular con medio fresco suplementado con interferón gamma para inducir la expresión de M MHC dos en las células endoteliales, seguido de la estimulación de las células con 20 nanogramos por mililitro de TNF alfa 24 horas más tarde en el tercer día de 30 a 60 minutos. Antes de comenzar el experimento, incubar el endotelio con un microgramo por mililitro, cada uno de los superantígenos bacterianos enterotoxina estafilocócica B y toxina del síndrome de shock tóxico uno a 37 grados centígrados. Durante la incubación, cuente el número de células viables del cultivo de linfocitos de interés y transfiera dos veces 10 a la sexta de las células a un tubo cónico de 15 mililitros.

A continuación, gire las células y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de tampón A recién preparado de modo que no queden grupos de células. A continuación, añada dos micromolares RA dos a la muestra de células T, tape el tubo e inviértalo inmediatamente para que sea homogéneo. Distribuye el tinte por toda la suspensión celular.

Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados, gire los linfocitos marcados y resuspenda suave pero completamente las células en 20 a 40 microlitros de tampón A fresco para obtener una imagen en vivo, las células encienden el sistema de microscopio y abren el software de captura de imágenes adecuado. Establezca los parámetros adecuados para la adquisición automatizada de imágenes time-lapse multicanal, así como el intervalo de adquisición de 10 a 30 segundos y una duración total de aproximadamente 20 a 60 minutos. A continuación, agregue aceite fresco al objetivo.

Monte una antena de microscopio que contenga 0,5 mililitros de tampón A en el adaptador de la etapa de calentamiento y encienda inmediatamente el adaptador previamente ajustado a 37 grados centígrados. Después de dos o tres minutos de equilibrio, use una pipeta de 20 microlitros para agregar los dos linfocitos cargados de AR en reposo en la cámara de la placa del microscopio montada y encienda las imágenes de campo brillante. Seleccione la trayectoria de la luz hacia los oculares y utilice la perilla de enfoque de curso para poner el objetivo en contacto con la parte inferior de la antena del microscopio.

A continuación, utilice el ocular y el mando de enfoque fino para localizar las células T situadas en el fondo de la antena parabólica y utilice los controles de la platina XY para seleccionar un campo que contenga al menos 10 células cuando se hayan localizado las células adecuadas. Cambie de campo claro a la fuente de luz fluorescente y de la imagen IP a la cámara CCD. Optimice los parámetros de adquisición y, a continuación, adquiera imágenes Fira 2, 3, 40 y FIRA 2, 3, 80 en reposo.

Uno de los pasos clave para generar resultados exitosos es la optimización cuidadosa de los parámetros de adquisición de fluorescencia, asegurando que se recoja suficiente señal y, en el caso de fira dos, que la relación de referencia 3 43 80 sea cercana a uno. Cuando se hayan establecido los dos tiempos de exposición FIRA, reemplace la placa de células T con una placa de microscopio de células endoteliales con una pipeta de transferencia desechable, retire rápidamente el medio y enjuague las células una vez con un mililitro de tampón precalentado A, luego reemplace el lavado con 0.5 mililitros de tampón fresco A. Utilizando el objetivo, identifique los campos en los que las células endoteliales brillantemente fluorescentes parecen sanas. A continuación, ajuste los parámetros de adquisición para la membrana YFP y DS RED como se acaba de demostrar para fira dos.

Cuidando que la intensidad media de la señal fluorescente en cada canal se sitúe entre el 25 y el 75% del rango dinámico del detector. Antes de realizar el experimento de imágenes de células vivas, capture varios intervalos de imágenes de las células endoteliales solas para establecer una línea de base con el software automatizado. A continuación, inserte la punta de un pequeño volumen en el medio cerca del centro del objetivo.

Dispense lentamente cinco microlitros de fira concentrada, dos linfocitos cargados al centro del campo de imágenes de la placa del microscopio. A medida que los linfocitos se asientan, realice ajustes finos en el enfoque para asegurarse de que las interfaces de las células endoteliales de células T se mantengan en el plano focal. Con los objetivos de 40 y 63 x, lo óptimo es de 10 a 20 celdas por campo.

Después del intervalo de observación deseado, continúe con la obtención de imágenes e inmediatamente pipetee la NIC directamente en la placa del microscopio hasta una concentración final de dos micromolares para inducir un flujo máximo de calcio esfera. Dos señales. Al aplicar tratamientos a las células, tenga cuidado de mantener un enfoque nítido en la superficie del endotelio marcada con YFP de la membrana apical para garantizar una resolución óptima de la remodelación de la sinapsis inmunitaria.

En ausencia de superantígeno en el superantígeno endotelial específico CD, cuatro TH positivos uno, los linfocitos se propagan, polarizan y migran lateralmente sobre las células endoteliales. Durante este proceso, los linfocitos extienden protuberancias de corta duración o ILP en la superficie endotelial, que son evidentes como anillos de fluorescencia de YFP de membrana análogos a las huellas en presencia de superantígeno, los contactos cercanos de célula a célula impulsados por las ILP se asocian con el inicio de un flujo de calcio que conduce a una acumulación de ILP estabilizadas dentro de la sinapsis inmunológica. Dichas matrices de ILP se acoplan a una señalización de calcio sostenida.

Los anillos de fluorescencia de membrana que se forman durante las interacciones de las células endoteliales de las células T corresponden a las protuberancias de las células T que impulsan manchas de invaginación discretas en las células endoteliales, como lo confirma la demostración de que estos anillos se correlacionan espacial y cinéticamente con las zonas de citoplasma desplazado y excluido. A los pocos minutos de la coincubación de las células endoteliales y T en presencia de superantígenos, las moléculas de adhesión y señalización asociadas con la señalización antigénica se enriquecen con coen dentro de las huellas de potasio e ILP de la sinapsis inmunológica. De hecho, la sinapsis inmunológica endotelial de las células T exhibe una arquitectura tridimensional discreta puntuada por ILP de células T que se extienden hacia la superficie de la célula presentadora de antígenos dentro de la cual se enriquece la maquinaria molecular de reconocimiento de antígenos.

Con este enfoque, se pueden superar los obstáculos clave dentro de los modelos de PC existentes, lo que permite la observación de la arquitectura subcelular 3D que de otro modo sería indetectable y la rápida remodelación de las interfaces fisiológicas de las células T a PC. Esto ofrece el potencial para nuevos niveles de comprensión de los procesos de señalización antigénica.