Name: Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a utilizar células endoteliales como modelo planar de células presentadoras de antígeno para estudiar la dinámica de la sinapsis inmunológica y la activación de linfocitos T CD4+.

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Agradecemos al Dr. Peter T. Sage por su ayuda en la generación de algunas de las imágenes representativas. Este trabajo fue apoyado por una subvención R01 de los NIH a C.V.C. (HL104006).

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+function+and+migration.+Two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell function and migration. Two sides of the same coin.</a> N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
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<li>Shaw, A. S., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+T+cell+receptor+go+the+distance%3A+a+topological+view+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation.</a> Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+T-cell+interactions+with+antigen+presenting+cells+in+culture+and+in+intact+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue.</a> Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).</li>
<li>Brossard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+structure+of+the+T+cell+-+dendritic+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse.</a> Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+context+of+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cellular context of T cell signaling.</a> Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Oddos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+imaging+of+intercellular+immune+synapses+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers.</a> Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Bunnell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Seminario, M. C., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+T-cell+receptor+microclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in T-cell receptor microclusters.</a> Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+bilayers+at+the+vanguard+of+immune+cell+activation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies.</a> J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).</li>
<li>Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartinelli%2C+R+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).</li>
<li>Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte-endothelial cell interactions.</a> Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+the+endothelium%3A+a+green+light+for+antigen-specific+T+cell+trafficking%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+recognition+is+facilitated+by+invadosome-like+protrusions+formed+by+memory%2Feffector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+foci+facilitate+activation+of+the+phospholipase+C-gama+in+primary+T+lymphocytes+via+the+WASP+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway .</a> eLife. , (2015).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+histocompatibility+complex+class+II-expressing+endothelial+cells+induce+allospecific+nonresponsiveness+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells.</a> J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).</li>
<li>Ma, W., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+effectively+costimulate+cytokine+production+by%2C+but+not+differentiation+of%2C+naive+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells.</a> J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).</li>
<li>Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+antigen+presentation%3A+stimulation+of+previously+activated+but+not+naive+TCR-transgenic+mouse+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells.</a> Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).</li>
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<li>Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell immunological synapses.</a> Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).</li>
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<li>Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+during+leukocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton during leukocyte responses.</a> Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).</li>
<li>Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+deformation+model+of+TCR+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">The receptor deformation model of TCR triggering.</a> Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).</li>
<li>Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-anchored+monomeric+agonist+pMHCs+alone+trigger+TCR+with+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity.</a> PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).</li>
<li>Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+mechanics+and+molecular+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Bending mechanics and molecular organization in biological membranes.</a> Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+receptor+activation+by+dynamic+membrane+binding+of+the+CD3epsilon+cytoplasmic+tyrosine-based+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif.</a> Cell. 135 (4), 702-713 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En general, este protocolo describe métodos para la investigación de las células endoteliales como i) APC fisiológicos poco estudiada y ii) como un nuevo tipo de &quot;modelo APC celular plana &#39;. Con respecto a lo primero, se ha vuelto cada vez más apreciada que la APC periférica no hematopoyéticas (o &#39;estroma&#39;) juegan un papel crítico, no redundantes (es decir, en comparación con hematopoyético APC) en la conformación de la respuesta inmune adaptativa 16-18. Entre tales &quot;semiprofesi...

Los linfocitos T son una rama del sistema inmune adaptativo que se caracteriza por la capacidad de reconocer eficientemente péptido antígeno (Ag) unida a complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) moléculas a través de sus receptores de células T (TCR) 1. Linfocitos ingenuos constitutivamente migran y escanear &#39;Ag células presentadoras profesionales&#39; (APC; por ejemplo, células dendríticas) en los ganglios linfáticos, mientras que las células de memoria / T efectoras necesitan para estudiar con eficacia una muy amplia gama de vehículos blindados y potenciales células diana dentro de los tejidos periféricos. En el min tras el reconocimiento inicial de cognado Ag en un APC, linfocitos detener su migración y comienzan a formar una interfaz célula-célula íntima especializado denominado &#39;sinapsis inmunológica &quot;(IS). Sostenida (es decir, 30 a 60 min) ES se requieren contactos para ampliar y mantener la señalización 2-7. Estudios emergentes identificar que dentro del IS, que es la formación continua y rápida remodeling de señalización subcelular micro-grupos discretos (es decir, que contienen MHC / Ag-TCR, F-actina, la adhesión y moléculas de señalización) que determinan la fuerza y la calidad de la que resulta la respuesta inmune 2-7. Sin embargo, los detalles dinámicos y mecanismo de regulación de este proceso se conocen por completo 8,9. Esto se debe en gran parte de los desafíos técnicos asociados con topologías irregulares de las superficies de APC y la orientación de un mal control de los planos de interacción célula-célula, las cuestiones que limitan profundamente la imagen espacio-temporal necesaria acerca 10.08 (Figure1A). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> Figura 1. Un fisiológica planar Modelo APC Cell for Imaging inmunológica Synapse Dynamics. El esquema ilustra la imagen tradicional de la sinapsis inmunológica entre una célula T y un professio<html> nal de células APC (A) y T y un modelo tradicional de lípidos planar APC bicapa (B) en comparación con este novedoso modelo de APC planar endotelial (C). APCs profesionales proporcionan sinapsis inmunológicas fisiológicas pero ofrecen interfaz mal orientada célula-célula (es decir, con respecto al plano óptima de imagen xy; resolución ~ 0,2 micras), lo que compromete drásticamente espacial (z plano de la imagen de resolución ~ 1 m) y temporal (es decir, debido a la necesidad de escanear repetidamente a través de todos los planos de formación de imágenes z) resolución de la imagen. Modelos bicapa tienen una topología plana que ofrece óptima de imágenes de resolución espacio-temporal, pero también son muy simplificada, no fisiológico y rígido. Este modelo de células endoteliales combina la topología planar de bicapas lipídicas con el sustrato fisiológico de un APC clásico para entregar óptima de imágenes de resolución espacial y temporal en un entorno fisiológico.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. El trabajo previo ha eludido parcialmente estos obstáculos mediante el desarrollo de modelos sustrato plano (es decir, bicapas lipídicas y las superficies recubiertas de anticuerpo) que proporcionan resolución espacio-temporal óptima (es decir, a través de la fijación de la superficie de activación de las células T en un único plan que es paralela a la proyección de imagen óptima xy avión) 11 a 15 (Figura 1B). Estos modelos han facilitado importantes conocimientos sobre la dinámica subcelulares / moleculares que controlan la señalización antigénico en las células T, incluyendo el descubrimiento de actina dinámica / TCR señalización micro-clusters 7,11-14. Sin embargo, tales modelos están inherentemente simplificaron, así como rígido (que impide el desarrollo / estudio de características topológicas 3 dimensiones) (Figura 1B). Por lo tanto, sigue siendo incierto cómo relacionar estos hallazgos a physiologic célula-célula vigilancia inmune. Aunque todavía poco estudiado, vascular y las células endoteliales linfáticas están emergiendo como un grande (es decir, mayor en número que todos los vehículos blindados profesionales, por ~ 1000 veces) compartimento periférico de &quot;semi-profesional&quot; APC 16-18. Estas células expresan MHC-I, MHC-II- y una multitud de moléculas co-estimuladoras (por ejemplo, CD40, LFA3, ICOSL, el 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1; pero no CD80 y CD86) y son estratégicamente posicionado en la interfase sangre-tejido donde sirven funciones especializadas centinela 16-18. Estudios previos demostraron que las células endoteliales pueden efectivamente re-estimular efectoras / memoria, pero no ingenuo, las células T 19-25. Así, las células endoteliales es probable que desempeñen un papel único de APC en la fase efectora de la respuesta inmune adaptativa dentro de los tejidos periféricos, tales como la influencia local sobre la activación de células T, la diferenciación, la memoria y la tolerancia 16-17,26. Cricamente, cuando se cultivan in vitro, las células endoteliales forman superficies celulares prácticamente planas y están fácilmente transfectable (por ejemplo, con los reporteros fluorescentes de proteínas). Estas características son ideales para imágenes de alta resolución espacio-temporal de la dinámica topológicos durante las interacciones célula-célula 19,27. Por lo tanto las células endoteliales podrían servir como un &#39;celular plana APC modelo fisiológica claramente adecuado para el estudio de los mecanismos de remodelación subcelulares / molecular que impulsan el reconocimiento de antígenos y regulan las respuestas (Figura 1C) 19,20. Previamente establecidos técnicas de imagen complementarios (incluyendo la transfección de las células endoteliales con los fabricantes de proteínas fluorescentes de la membrana plasmática y citosol) para estudiar los detalles de la interacción de leucocitos endotelial durante la adhesión y migración transendotelial 27, mostraron que los leucocitos sondean activamente la superficie del endotelio por Dynamic una inserciónd retracción de la sub-escala micrométrica, protuberancias cilíndricas de actina-ricos (~ 200-1.000 nm de diámetro y profundidad) denomina-invadosome como salientes (es decir, &#39;ILPS&#39;) 27,28. Estos enfoques de imagen se han ampliado aún más, junto con la creación de protocolos para tomar ventaja de la función endotelial de APC para desarrollar los primeros métodos de alta resolución de imagen espacio-temporal de la célula endotelial sinapsis inmunológica T según lo informado 19,20 y describir con más detalle en el presente documento. Un hallazgo central derivado de esta novela plana celular modelo de APC es que programas de vida independiente de células T funcionan tanto en la promoción de la detección inicial Ag y en el mantenimiento de la señalización posterior. De hecho, las matrices de múltiples programas de vida independiente (que fueron estabilizados y devengados en respuesta a sus iniciales en el flujo de calcio) muestran un enriquecimiento en TCR y moléculas sugestivos de señalización activa tal PKC-Q, ZAP-70, fosfotirosina y HS1. Por lo tanto, programas de vida independiente parecen representar un equivalente fisiológico tridimensional a la micro TCR de señalizaciónracimos visto en los modelos de dos capas planas. Este enfoque, por lo tanto, revela sensibilidad / informes dinámica molecular y arquitectónicos (y biomecánico implícitas) de otro modo no detectable. El método descrito en este documento deberá ser útil para reducir la brecha entre los modelos de sustratos artificiales APC APC profesional y con el fin de mejorar nuestra capacidad de interrogar a los mecanismos básicos de la respuesta inmune adaptativa. Mientras que aquí la atención se centra en la activación de tipo Th1 CD4 + efectoras / célula de memoria, este enfoque básico puede ser modificado fácilmente para estudiar una amplia gama de tipos de células T y Ags, como se discute a continuación.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer torniquete elástico sin látex</td><td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD hisopos con alcohol</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Juego de extracción de sangre con botón pulsador</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Llevar a RT antes</td></tr><tr><td>de usar FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td> inactivada por calor <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>enterotoxina estafilocócica Tecnología</td> de <td>toxina</td> <td>BBT202RED</td><td>Solución madre 1 mg/ml en PBS</td></tr> toxina <tr><td>1 del síndrome de shock tóxico Toxina Tecnología</td><td></td><td>TT606RED</td><td>solución madre 1 mg/ml en PBS</td></tr><tr><td>humano IL-15</td><td>R& D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Solución madre 50ug/ml en PBS</td></tr><tr><td>PBS Life</td><td>Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Solución madre 1mg/ml en H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>Se pueden utilizar otras CE microvasculares humanas, es decir, HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Solución madre 10x, diluida en PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Kit de nucleofactor</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Kit necesario para el paso 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Solución madre 1mg/ml en H20</td></tr><tr><td>TNF-alfa 10ug, humano</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Solución madre 1mg/ml en fenol H20</td></tr><tr><td>HBSS sin rojo</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Solución madre 1M en H20</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>solución madre 1M en H20</td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F Aceite de inmersión sin fluorescencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Solución madre 1mM en DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsMonómero rojo (dsRed citoplasmático soluble)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsMembrana de monómero rojo (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Tóxico, use campana extractora</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tubos de centrífuga cónicos Falcon 15mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos Falcon 50mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matraces tratados para cultivo de tejidos de halcón T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Matraces tratados para cultivo de tejidos de halcón T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cultivo celular de Corning tratado T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&nbsp;</td><td>12 mm de diámetro</td></tr><tr><td>&nbsp; Placas de cultivo de tejidos Falcon 24 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Placas Delta-T</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Pasteur Pipetas desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo Eppendorf&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ratón ICAM1 anti-humano</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>ratón HS1 anti-humano</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD11a (LFA-1alpha)</td><td>Ebiociencia</td> purificada <td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD3 Alexa Fluor&reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-MHC Clase II&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Talin 1</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo theta anti-PKC&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>fosfotirosina (4G10 Platinum)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Electroporador requerido para el paso 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison Software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Serie 60) Cabina de seguridad biológica</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Forma STRCYCLE 37 &deg; C, 5% CO2 Incubadora de cultivo celular</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; Z359629</td><td>Hemocitómetro Bright-Line</td></tr><tr><td>Isotemp Baño de agua modelo 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de la célula endotelial planar for imaging inmunológica synapse dinámica

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

La inmunidad adaptativa está regulado por las interacciones dinámicas entre las células T y las células presentadoras de antígeno (&quot;APC&quot;) refiere como &#39;sinapsis inmunológicas. Dentro de estas interfaces de célula-célula íntimos grupos subcelulares discretos de MHC / Ag-TCR, F-actina, adhesión y moléculas de señalización forman y remodelar rápidamente. Estas dinámicas se cree que son determinantes críticos de la eficiencia y la calidad de las respuestas inmunes que se desarrollan y, por tanto, de protección contra la inmunidad patológica. El conocimiento actual de las sinapsis inmunológicas con fisiológica APC está limitada por la insuficiencia de la resolución de las imágenes se puede obtener. Aunque los modelos de sustratos artificiales (por ejemplo, bicapas lipídicas planas) ofrecen una excelente resolución y han sido herramientas muy valiosas, que son inherentemente no fisiológica y simplificada. Las células endoteliales vasculares y linfáticos se han convertido en un importante tejido periférico (o estroma) Compartimiento de &quot;semi-profesionalal APC &#39;. Estas APCs (que expresan la mayor parte de la maquinaria molecular de APCs profesional) tienen la característica única de la formación de la superficie celular prácticamente planar y están fácilmente transfectable (por ejemplo, con los reporteros fluorescentes de proteínas). Aquí un enfoque básico para implementar las células endoteliales como una novela y fisiológica &#39;planar modelo APC celular&#39; para mejorar la formación de imágenes y el interrogatorio de los procesos de señalización antigénicos fundamentales se describirá.

Un enfoque de formación de imágenes novedoso utilizando células endoteliales y la combinación de las ventajas resolución de la planar bicapas lipídicas modelo con la complejidad fisiológica y la deformabilidad de las APC profesional fue desarrollado (Figura 1). La Figura 2 proporciona ejemplos de migración típica, el flujo de calcio y la dinámica topológicos observado con esta enfoque. En ausencia de la SAG en el endotelio, los linfocitos SAG-específicas...

La inmunidad adaptativa está controlada por 'sinapsis inmunológicas' dinámicas formadas entre las células T y las células presentadoras de antígenos. Este protocolo describe métodos para investigar las células endoteliales, tanto como APC fisiológicas poco estudiadas como un nuevo tipo de "modelo de APC celular plana".

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

El objetivo general de esta técnica consiste en utilizar células endoteliales como un nuevo tipo de modelo de célula presentadora de antígenos planar para investigar procesos fundamentales de señalización antigénica. Este método puede ayudarnos a abordar preguntas clave en el campo de la inmunidad adaptativa, como la forma en que se coordinan espacial y temporalmente las dinámicas de remodelación subcelular y molecular dentro de la sinapsis inmunológica. La principal ventaja de esta técnica es que el endotelio forma una superficie de CP prácticamente planar.Esto permite obtener imágenes con una resolución espacio-temporal óptima en el contexto de una superficie celular fisiológicamente compleja y moldeable. Aunque este método se centra en la activación de células de memoria efectora TH1 positivas para CD4, también puede aplicarse para el estudio de diversos tipos de linfocitos T, antígenos y procesos de señalización. Hoy en día, Chris y yo les mostraremos cómo realizar el segundo paso: comenzar mediante la transfección de células endoteliales microvasculares primarias de pulmón o dérmicas humanas con YFP de membrana y DS red soluble mediante la transfección nuclear NU y sembrar las células transfectadas en placas de cultivo para imágenes de células vivas.Al día siguiente, sustituya el medio de cultivo celular por medio fresco suplementado con interferón gamma para inducir la expresión de MHC II en las células endoteliales, seguido por la estimulación de las células con 20 nanogramos por mililitro de TNF alfa 24 horas después, el día tres, durante 30 a 60 minutos. Antes de comenzar el experimento, incube el endotelio con un microgramo por mililitro de cada uno de los superantígenos bacterianos toxina B estafilocócica y toxina del síndrome de shock tóxico tipo uno, a 37 grados Celsius. Durante la incubación, cuente el número de células viables del cultivo de linfocitos de interés y transfiera dos veces 10 a la sexta de las células a un tubo cónico de 15 mililitros.A continuación, centrifugue las células y resuspenda el sedimento en dos mililitros de tampón A recién preparado, de manera que no queden agregados celulares. Luego, agregue dos micromoles de RA dos a la muestra de linfocitos T, tape el tubo e inviértalo inmediatamente para homogeneizar. Distribuya el colorante uniformemente a través de la suspensión celular.Tras una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius, centrifugar los linfocitos marcados y resuspender suavemente pero completamente las células en 20 a 40 microlitros de tampón A fresco para obtener imágenes en vivo. Encender el sistema del microscopio y abrir el software adecuado para la captura de imágenes. Establecer los parámetros apropiados para la adquisición automática de imágenes en múltiples canales y en lapsos de tiempo, así como el intervalo de adquisición entre 10 y 30 segundos y una duración total de aproximadamente 20 a 60 minutos. A continuación, añadir aceite fresco al objetivo.Coloque un platillo microscópico que contenga 0,5 mililitros del tampón A sobre el adaptador del estadio calefactor y encienda inmediatamente el adaptador previamente ajustado a 37 grados Celsius. Después de dos a tres minutos de equilibrio, utilice una pipeta de 20 microlitros para añadir los linfocitos cargados con RA en reposo a la cámara del platillo microscópico montado y active la imagen en campo claro. Seleccione la trayectoria de la luz hacia los oculares y use el botón de enfoque grueso para acercar el objetivo hasta que haga contacto con la parte inferior del platillo microscópico.Luego, utilice el ocular y el tornillo de enfoque fino para localizar las células T asentadas en el fondo del platillo y use los controles del escenario XY para seleccionar un campo que contenga al menos 10 células una vez que se hayan localizado las células adecuadas. Cambie de campo claro a la fuente de luz fluorescente y de la imagenología IP a la cámara CCD. Optimice los parámetros de adquisición y luego adquiera las imágenes de reposo de Fira 2 3 40 y FIRA 2 3 80.Uno de los pasos clave para obtener resultados exitosos es la optimización cuidadosa de los parámetros de adquisición de fluorescencia, asegurando que se recoja una señal suficiente y, en el caso de FIRA dos, que la relación de la línea base 3 43 80 esté cercana a uno. Una vez que se hayan establecido los tiempos de exposición de FIRA dos, sustituya el cultivo de linfocitos T por un cultivo microscópico de células endoteliales; utilizando una pipeta desechable, retire rápidamente el medio y lave las células una vez con un mililitro de tampón A precalentado, luego reemplace el lavado con 0,5 mililitros de tampón A fresco. Con el objetivo, identifique campos en los que las células endoteliales fluorescentes brillantes se vean sanas. A continuación, ajuste los parámetros de adquisición para YFP de membrana y DS RED tal como se acaba de demostrar para FIRA dos.Asegurándose de que la intensidad media de la señal fluorescente en cada canal se sitúe entre el 25 y el 75 % del rango dinámico del detector. Antes de realizar el experimento de imagen en células vivas, capture varios intervalos de imágenes de las células endoteliales solas para establecer una línea base con el software automatizado. A continuación, inserte la punta de un pequeño volumen en el medio cerca del centro del objetivo.Dispense lentamente cinco microlitros de fira concentrada, con dos linfocitos cargados, al centro del campo de imagen del platillo microscópico. A medida que los linfocitos se asientan, realice ajustes finos del enfoque para asegurar que las interfaces entre las células endoteliales y los linfocitos T se mantengan en el plano focal. Con objetivos de 40 y 63 x, de 10 a 20 células por campo son óptimas.Después del intervalo de observación deseado, continúe la adquisición de imágenes e inmediatamente pipetee CIN directamente en la placa del microscopio hasta una concentración final de dos micromoles para inducir un flujo máximo de calcio en esfera. Dos señal. Al aplicar tratamientos a las células, tenga cuidado de mantener un enfoque nítido sobre la superficie marcada con YFP de la membrana apical del endotelio para asegurar una resolución óptima del remodelado de la sinapsis inmune.En ausencia de superantígeno, los linfocitos TH1 CD4 positivos específicos para superantígeno en las células endoteliales se extienden rápidamente, se polarizan y migran lateralmente sobre las células endoteliales. Durante este proceso, los linfocitos emiten protrusiones de corta duración o ILP hacia la superficie endotelial, que son evidentes como anillos de fluorescencia de YFP en la membrana, análogos a huellas; en presencia de superantígeno, los contactos estrechos entre células impulsados por las ILP se asocian con el inicio de un flujo de calcio que conduce a la acumulación de ILP estabilizadas dentro de la sinapsis inmunológica. Dichas agrupaciones de ILP están acopladas a una señalización sostenida de calcio.Los anillos de fluorescencia de membrana que se forman durante las interacciones entre células T y células endoteliales corresponden a las protrusiones de las células T que inducen puntos discretos de invaginación en las células endoteliales, tal como se confirmó mediante la demostración de que estos anillos se correlacionan espacial y cinéticamente con las zonas de citoplasma desplazado y excluido. Minutos después de la coincubación de las células endoteliales y las células T en presencia de superantígeno, las moléculas de adhesión y señalización asociadas con la señalización antigénica se enriquecen conjuntamente dentro de las huellas y las ILP de la sinapsis inmunológica. De hecho, la sinapsis inmunológica entre células T y células endoteliales exhibe una arquitectura tridimensional discreta, salpicada por ILP de células T que se extienden hacia la superficie de la célula presentadora de antígenos, dentro de las cuales se enriquece el maquinario molecular de reconocimiento de antígenos.Con este enfoque, pueden superarse los obstáculos clave presentes en los modelos actuales de PC, lo que permite observar la arquitectura subcelular tridimensional que de otro modo sería indetectable y la remodelación rápida de las interfaces fisiológicas entre linfocitos T y PC. Esto ofrece la posibilidad de alcanzar nuevos niveles de comprensión de los procesos de señalización antigénica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Apoyado bicapas planas son potentes herramientas que pueden ser utilizados para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Aquí, se muestra los métodos para el anclaje de las proteínas de adhesión celular sabe que modulan la formación de sinapsis en el folleto superior de la bilyer lípidos y visualizar la formación de sinapsis mediante microscopía TIRF.

El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Este video muestra una técnica in vitro para estudiar la formación de sinapsis inmune entre las células T humanas primarias y las bicapas lipídicas soportadas (SLB). Las proteínas de la superficie de las células T interactúan con los respectivos ligandos inmovilizados en SLB para formar una sinapsis inmunitaria, seguida del movimiento de los gránulos líticos hacia la sinapsis, que se visualiza mediante microscopía de fluorescencia.

Una técnica in vitro para estudiar la interacción de las células T con bicapas lipídicas planas soportadas

Este video muestra imágenes de células vivas de la topología inmunológica de la sinapsis, investigando las interacciones entre los linfocitos T y las células epiteliales portadoras de antígenos fluorescentes. La microscopía de fluorescencia revela un desplazamiento rojo del citoplasma y anillos amarillos en la membrana de las células endoteliales, lo que indica la formación de sinapsis inmunológicas.

Evaluación de la topología de la sinapsis inmunológica a través de imágenes de células vivas

Fuente: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el uso de la microscopía confocal para visualizar la dinámica dendrítica en explantes de retina de ratones vivos. Describe los pasos para estabilizar la retina bajo un microscopio confocal, realizar imágenes de epifluorescencia para visualizar las interneuronas amacrinas...

Imágenes confocales de lapso de tiempo de la dinámica dendrítica neuronal en explantes de retina de ratón

Aquí se ilustra el protocolo para obtener imágenes de dos colores STED nanoscopía la sinapsis inmune citotóxica de las células NK recapitulado sobre vidrio. Con este método se obtiene la resolución nm sub-100 de las proteínas de la sinapsis y el citoesqueleto.

La visualización de la sinapsis inmunológica mediante gated-Tiempo color dual Emisión Estimulada de Agotamiento (STED) Nanoscopia

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

Describimos aquí una combinación de la técnica de bicapa lipídica soportada por vidrio para formar sinapsis inmunológicas con la técnica de imagen de superresolución de la microscopía de depleción por emisión estimulada (STED). El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios las instrucciones necesarias para llevar a cabo con éxito estas dos técnicas.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

Aquí, describimos un completo flujo de trabajo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmunes entre las células de T humanas primarias y células presentadoras de antígeno. El método se basa en imágenes por citometría de flujo, que permite la adquisición y evaluación de varias imágenes de miles de células en un período relativamente corto de tiempo.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

Este protocolo analiza tanto la formación de la sinapsis inmunológica como el posterior tráfico secretor polarizado posterior hacia la sinapsis inmunológica. Se formaron conjugados celulares entre una célula Raji con pulso de superantígenos (que actúa como una célula que presenta antígenos) y un clon de Jurkat (actuando como un linfocito T auxiliar del efector).

Imagen de la Sinapsis Inmunológica Humana

Este informe proporciona protocolos para el ensamblaje, el cultivo celular y los ensayos en la plataforma μSiM para la construcción de modelos de barrera hematoencefálica.

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

Aprenda a utilizar células endoteliales como modelo planar de células presentadoras de antígeno para estudiar la dinámica de la sinapsis inmunológica y la activación de linfocitos T CD4+.

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

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