Name: 成像免疫突触动力学内皮平面细胞模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解利用内皮细胞作为平面抗原呈递细胞模型研究适应性免疫的新方法。该技术通过活细胞成像观察T细胞激活过程中免疫突触的时空动态，为深入理解抗原信号传导机制提供高分辨率分析工具。

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我们感谢 Peter T. Sage 博士在生成部分代表性图像方面提供的帮助。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 基金（HL104006）资助，授予 C.V.C.。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

总体而言，本方案描述了研究内皮细胞的两种方法：i) 作为尚未充分研究的生理性抗原呈递细胞（APCs），以及 ii) 作为一类新型的“平面细胞抗原呈递模型”。关于前者，人们日益认识到，非造血来源的外周（或“间质性”）抗原呈递细胞发挥着关键且不可替代的作用（即，相较于造血来源的抗原提呈细胞（APCs）在调控适应性免疫应答中的作用 16-18在这些“半专业性”抗原呈递细胞中，血管和淋巴管内皮细胞（其数量远超专业性抗原呈递细胞）是研究最为深入的代表之一。 16-18然而，信号事件的细节及其偶联的免疫突触在很大程度上仍未被深入研究。本文所述方法为推进对该新兴领域的理解提供了基础。例如，将这些方法应用于研究在来自不同组织、已知具有独特适应性免疫功能的内皮细胞上形成的免疫突触例如肝脏和淋巴管内皮细胞可能具有特别的指导意义。
值得注意的是，该方法有助于弥合专业性抗原提呈细胞（APC）与人工APC基质模型之间的差距，从而增强对适应性免疫应答基本机制的探究能力。尽管平面APC基质（即，脂质双层、抗体包被的...

T淋巴细胞是适应性免疫系统的一个分支，其特征是能够通过T细胞受体（TCRs）高效识别与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合的肽类抗原（Ag）1。初始淋巴细胞会持续迁移，并在淋巴结内扫描“专业的抗原呈递细胞”（APCs；例如，树突状细胞），而记忆/效应T细胞则需要在周围组织中有效监测大量多样的抗原呈递细胞及潜在靶细胞。
在淋巴细胞初次识别抗原提呈细胞（APC）上的同源抗原（Ag）后的几分钟内，其迁移运动即停止，并开始形成一种特化的紧密细胞间界面，称为“免疫突触”（immunological synapse, IS）。持续较长时间（即 30–60 分钟）的IS接触对于信号的放大和维持至关重要2–7。最新研究发现，在免疫突触内部，离散的亚细胞信号微簇（即 包含MHC/Ag-TCR、F-肌动蛋白、黏附分子及信号分子）的持续形成和快速重塑，决定了最终免疫应答的强度与质量2–7。然而，该过程的动态细节及其调控机制尚未完全阐明8,9。这在很大程度上源于技术上的挑战，包括APC表面结构的不规则拓扑形态以及细胞间相互作用平面方向难以精确控制，这些问题严重限制了所需的时空成像技术的应用8–10（图1A）。
<img alt="显示APC靶细胞模型、显微镜设置和突触重建的传统IS成像示意图" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">
图1. 一种用于成像免疫突触动态的生理平面细胞APC模型。 该示意图比较了T细胞与专业抗原呈递细胞（APC）之间传统免疫突触成像（A），T细胞与传统平面脂双层APC模型之间的成像（B），以及本研究所述的新型内皮细胞平面APC模型（C）。专业APC可提供生理性的免疫突触，但其细胞-细胞界面方向性较差（即，相对于最佳的x-y成像平面而言；分辨率约0.2 μm），这会显著降低成像的空间分辨率（z成像平面分辨率约1 μm）和时间分辨率（即，由于需要反复扫描所有z成像平面）。脂双层模型具有平面拓扑结构，可实现最佳的时空成像分辨率，但其结构高度简化，缺乏生理相关性且过于刚性。该内皮细胞模型将脂双层的平面拓扑结构与经典APC的生理基质相结合，从而在生理环境下实现了最优的空间和时间成像分辨率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53288/53288fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
先前的研究通过开发平面基底模型部分克服了这些障碍（即，脂质双层和抗体包被的表面）以提供最佳的时空分辨率（即，通过将T细胞活化表面固定在与最优方向平行的单一平面上 x-y 成像平面 11-15 (图1B）。这些模型促进了对控制T细胞抗原信号传导的亚细胞/分子动态的重要认识，包括发现了动态的肌动蛋白/TCR信号微簇 7,11-14然而，此类模型本质上过于简化，且具有刚性，无法用于研究三维拓扑特征的形成与发育。图1B因此，目前尚不清楚如何将这些发现与生理条件下的细胞间免疫监视相关联。
尽管仍研究不足，血管和淋巴管内皮细胞正逐渐被视为一个庞大的（即数量比所有专业抗原呈递细胞多约1000倍的外周“半专业”抗原呈递细胞区室 16-18这些细胞表达MHC-I、MHC-II以及多种共刺激分子。例如CD40、LFA3、ICOSL、4-1BB、OX40L、TL1A、PD-L1；但不包括CD80和CD86），并定位于血-组织交界处，在此发挥特化的哨兵功能 16-18先前的研究表明，内皮细胞能够有效再次刺激效应/记忆性T细胞，但不能刺激初始T细胞 19-25因此，内皮细胞可能在外周组织适应性免疫应答的效应阶段发挥独特的抗原提呈细胞作用，例如对T细胞的活化、分化、记忆及耐受产生局部影响。 16,17,26至关重要的是，当培养时 体外 内皮细胞形成近乎平面的细胞表面，且易于转染（例如，结合荧光蛋白报告系统），这些特性非常适合在细胞间相互作用过程中对拓扑动力学进行高时空分辨率成像 19,27因此，内皮细胞可能作为一种生理性的“平面细胞抗原呈递细胞”模型，特别适用于研究驱动抗原识别并调控免疫应答的亚细胞/分子重塑机制。图1C) 19,20.
先前建立的互补成像技术（包括将内皮细胞转染表达细胞膜和细胞质的荧光蛋白标记物），用于研究白细胞与内皮细胞在黏附和跨内皮迁移过程中相互作用的细节27，结果显示，白细胞通过动态插入和回缩亚微米级、富含肌动蛋白的圆柱形突起（直径和深度约为200–1,000 nm），主动探测内皮细胞表面，这些结构被称为类似侵袭体的突起（i.e.，“ILPs”）27,28。这些成像方法已进一步拓展，并结合新建立的实验方案，利用内皮细胞的抗原呈递细胞（APC）功能，开发出首个可实现高时空分辨率成像T细胞-内皮细胞免疫突触的方法，如文献报道19,20，并在本文中进一步描述。从这一新型平面细胞APC模型中获得的一个核心发现是，T细胞的ILPs在促进初始抗原识别以及维持后续信号传导中均发挥功能。事实上，多个ILPs阵列（在初始钙离子流响应下得以稳定并累积）中富集了TCR以及提示存在活跃信号传导的分子，如PKC-θ、ZAP-70、磷酸化酪氨酸和HS1。因此，ILPs似乎代表了在平面双层模型中观察到的TCR信号微簇的三维生理对应结构。该方法因而能够灵敏地揭示或报告其他方法无法检测到的分子、结构（以及隐含的生物力学）动态变化。
本文所述方法有助于弥合专业抗原呈递细胞（APC）与人工抗原呈递细胞基质模型之间的差距，从而增强我们探究适应性免疫应答基本机制的能力。尽管本文重点在于CD4+ Th1型效应/记忆细胞的激活，但如后文所述，该基本方法可轻松改造，用于研究多种T细胞类型和抗原（Ags）。

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer 无乳胶弹力止血带</td><td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD 酒精棉片</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok 安全型采血装置</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer 按压式静脉采血套装</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>使用前恢复至室温</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td>热灭活处理</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌肠毒素 B</td><td>Toxin Technology</td><td>BT202RED</td><td>储存液：1 mg/ml PBS 溶液</td></tr><tr><td>中毒性休克综合征毒素 1</td><td>Toxin Technology</td><td>TT606RED</td><td>储存液：1 mg/ml PBS 溶液</td></tr><tr><td>人 IL-15</td><td>R&amp;D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>储存液：50 μg/ml PBS 溶液</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>储存液：1 mg/ml H₂O 溶液</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV 内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>可使用其他人微血管内皮细胞，例如 HLMVEC</td></tr><tr><td>EGM-2 MV 子弹头试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>储存液：10×，用 PBS 稀释</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L 核转染试剂盒</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>步骤 4 所需试剂盒</td></tr><tr><td>IFN-γ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>储存液：1 mg/ml H₂O 溶液</td></tr><tr><td>人 TNF-α 10 μg</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>储存液：1 mg/ml H₂O 溶液</td></tr><tr><td>无酚红 HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>储存液：1 M H₂O 溶液</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>储存液：1 M H₂O 溶液</td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F 无荧光浸油</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20×50 μg</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>储存液：1 mM DMSO 溶液</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem（膜定位 YFP）</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer（可溶性细胞质 DsRed）</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer Membrane（膜定位 DsRed）</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鬼笔环肽</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>有毒，需在通风橱中操作</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 组织培养处理 T25 培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon 组织培养处理 T75 培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Corning 组织培养处理 T175 培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&amp;nbsp;</td><td>直径 12 mm</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon 24 孔组织培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Delta-T 培养板</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton 一次性巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf 管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;ICAM1 小鼠抗人单克隆抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 小鼠抗人单克隆抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD11a（LFA-1α）纯化抗体</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD3 Alexa Fluor&amp;reg; 488 标记抗体</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>抗 MHC II 类分子抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>抗 Talin 1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>抗 PKC theta 抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化酪氨酸抗体（4G10 Platinum）</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>步骤 4 所需电穿孔仪</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovision 软件</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425（Series 60）生物安全柜</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Forma STRCYCLE 37 &amp;deg;C、5% CO₂ 细胞培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;Z359629</td><td>Bright-Line 血细胞计数板</td></tr><tr><td>Isotemp 水浴锅 202 型</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞（“APCs”）之间的动态相互作用所调控，这些相互作用被称为“免疫突触”。在这些紧密的细胞-细胞界面中，MHC/Ag-TCR、F-肌动蛋白、黏附分子和信号分子会形成离散的亚细胞簇，并迅速重组。这些动态变化被认为是决定免疫应答效率与质量的关键因素，从而影响保护性免疫与病理性免疫的差异。目前对生理性APC中免疫突触的理解受限于成像分辨率的不足。尽管人工基底模型（例如，平面脂双层）提供了优异的分辨率，并已成为极为有价值的工具，但其本质上缺乏生理相关性且过于简化。血管和淋巴管内皮细胞已逐渐被视为一类重要的外周组织（或基质）“半专业性APC”组分。这些APC（表达大多数专业性APC的分子机制）具有一个独特特征，即能够形成近乎平面的细胞表面，并且易于转染（例如，携带荧光蛋白报告基因）。本文将介绍一种基本方法，利用内皮细胞构建一种新颖且具有生理相关性的“平面细胞APC模型”，以改善对基本抗原信号传导过程的成像与研究。

一种利用内皮细胞并将平面脂质双层模型的高分辨率优势与专业抗原呈递细胞的生理复杂性和可变形性相结合的新型成像方法被开发出来（图1). 图2 提供了采用该方法观察到的典型迁移、钙流和拓扑动力学实例。在内皮细胞缺乏SAg的情况下，SAg特异性CD4+ Th1 淋巴细胞在内皮表面快速扩散、极化并进行侧向迁移（图2A）但不添加钙离子（未显示）。大约5-10分钟内，这些淋巴细胞开始穿过内皮细胞进行跨内皮迁移。当内皮细胞负载超抗原（SAg）时，淋巴细胞呈对称性铺展，形成“煎蛋样”拓扑结构，并启动持续的（即， 30-60 分钟）细胞内钙离子流图2B；视频1），在此期间它们表现出极少或没有迁移现象（图 2C).
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适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞之间形成的动态“免疫突触”所调控。本方案描述了研究内皮细胞的方法，既可将其作为研究尚不充分的生理性抗原呈递细胞，也可作为新型“平面细胞抗原呈递模型”进行研究。

适应性免疫由T细胞与抗原呈递细胞（‘APCs’）之间的动态相互作用所调控，这些相互作用被称为‘免疫学...’

该技术的总体目标是利用内皮细胞作为一种新型的平面抗原呈递细胞模型，以研究基本的抗原信号传导过程。该方法有助于我们解决适应性免疫领域中的关键问题，例如免疫突触内亚细胞和分子重塑动态如何在空间和时间上协调进行。该技术的主要优势在于内皮细胞能够形成几乎平面的抗原呈递细胞表面。这使得在生理环境复杂且具有可塑性细胞表面的背景下，能够实现最佳时空分辨率的成像。尽管本方法聚焦于CD4阳性TH1效应记忆细胞的活化研究，但也可应用于多种T细胞类型、抗原以及信号转导过程的分析。今天，Chris和我将向您演示如何通过NU核转染法，将携带膜定位YFP和可溶性DsRed的质粒共转染至原代人肺或皮肤微血管内皮细胞，并将转染后的细胞接种至活细胞成像培养板中进行后续实验。第二天，将细胞培养基更换为新鲜培养基，并添加干扰素γ，以诱导内皮细胞上MHC II类分子的表达；随后在第三天再加入20纳克/毫升的TNF-α刺激细胞24小时，持续30至60分钟。实验开始前，将内皮细胞与每种浓度为1微克/毫升的细菌超抗原——金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）和中毒性休克综合征毒素-1（TSST-1）——在37摄氏度下共同孵育。孵育期间，计数目标淋巴细胞培养物中的活细胞数量，并将2×10⁶个细胞转移至15毫升锥形管中。随后，离心收集细胞，并将沉淀重悬于两毫升新鲜配制的缓冲液A中，确保无细胞团块存在。然后向T细胞样品中加入2 µM的RA2，盖紧管盖，并立即反复倒置混匀，使染料均匀分布于整个细胞悬液中。在37摄氏度下孵育30分钟后，离心标记的淋巴细胞，并轻轻而充分地将细胞重悬于20至40 µL新鲜缓冲液A中，用于活细胞成像。开启显微镜系统并打开相应的图像采集软件。设置自动多通道延时成像的适当参数，采集时间间隔为10至30秒，总持续时间约为20至60分钟。接着，向物镜添加新鲜的镜油。将含有0.5毫升缓冲液A的显微镜皿安装到加热台适配器上，并立即开启此前已预设为37摄氏度的适配器。平衡两到三分钟后，使用20微升移液器将静息的RA二价负载淋巴细胞加入已安装的显微镜皿腔室中，并启动明场成像。选择光路至目镜，使用粗调焦旋钮使物镜与显微镜皿底部接触。然后使用目镜和微调焦旋钮定位沉降在培养皿底部的T细胞，并利用XY载物台控制装置选择一个包含至少10个细胞的视野。找到合适的细胞后，切换光源从明场照明至荧光照明，同时将成像模式从IP成像切换至CCD相机。优化采集参数，随后采集Fira 2 3 40和FIRA 2 3 80的静息态图像。获得成功结果的关键步骤之一是仔细优化荧光采集参数，确保收集到足够的信号，并且在 fira two 的情况下，基线 3 43 80 比值接近于 1。设定 fira two 的曝光时间后，使用一次性转移移液管将 T 细胞培养皿更换为内皮细胞的显微镜培养皿，迅速移除培养基，并用 1 毫升预温的缓冲液 A 冲洗细胞一次，然后将冲洗液替换为 0.5 毫升新鲜的缓冲液 A。使用物镜识别荧光强烈且形态健康的内皮细胞视野，然后参照前述 fira two 的方法，调整膜 YFP 和 DS RED 的采集参数。确保每个通道的平均荧光信号强度位于检测器动态范围的25%至75%之间。在进行活细胞成像实验之前，先单独采集若干时间点的内皮细胞图像，以利用自动化软件建立基线。随后将小体积移液的尖端插入物镜中心附近的培养基中。缓慢地将五微升浓缩的fira和两个负载的淋巴细胞注入显微镜培养皿成像区域的中心。待淋巴细胞沉降后，精细调节焦距，确保T细胞与内皮细胞的界面保持在焦平面上。使用40倍和63倍物镜时，每视野10至20个细胞为最佳数量。在完成所需的观察时间后，继续成像，并立即用移液器将CIN直接加入显微镜培养皿中，使其终浓度为2 µM，以诱导最大化的钙流信号。在对细胞施加处理时，需注意保持内皮细胞顶端膜YFP标记表面的清晰聚焦，以确保免疫突触重塑过程的分辨率最佳。在缺乏超抗原的情况下，内皮细胞上特异性的CD4阳性TH1淋巴细胞会迅速铺展、极化，并在内皮细胞表面进行侧向迁移。在此过程中，淋巴细胞向内皮细胞表面伸出短暂存在的突起结构，即ILP，这些突起在膜YFP荧光下表现为环状信号，类似于“足迹”。在超抗原存在时，由ILP介导的紧密细胞间接触会触发钙离子流的启动，进而导致免疫突触内稳定ILP的积聚。此类ILP阵列与持续的钙信号传导相关联。在T细胞与内皮细胞相互作用过程中形成的膜荧光环对应于T细胞突出结构，这些突出结构驱动内皮细胞上离散的凹陷位点，这一点已通过荧光环在空间和动力学上与细胞质被置换和排除的区域相一致得到证实。在内皮细胞与T细胞共孵育数分钟内，在超抗原存在下，与抗原信号相关的黏附分子和信号分子在免疫突触的pota印迹和ILP中发生共富集。事实上，T细胞-内皮细胞免疫突触呈现出明确的三维结构特征，其特点是由T细胞ILP穿透至抗原呈递细胞表面所形成，而在这些结构内富集了抗原识别的分子机制。采用这种方法，可以克服现有抗原呈递细胞模型中的关键障碍，从而观察到原本无法检测的三维亚细胞结构以及生理性T细胞与抗原呈递细胞界面的快速重塑。这为深入理解抗原信号传导过程提供了新的可能。

an-endothelial-planar-cell-model-for-imaging-immunological-synapse

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

成像免疫突触动力学内皮平面细胞模型

支撑性平面双层膜是用于模拟免疫突触中分子相互作用的有力工具。本文中，我们展示了将已知可调控突触形成的细胞黏附蛋白锚定于脂质双层膜上层，并利用全内反射荧光显微镜（TIRF）观察突触形成的方法。...

用于免疫突触与运动突触研究的支撑性平面双层膜的构建

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。...

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

本视频展示了免疫突触拓扑结构的活细胞成像，研究携带荧光抗原的T淋巴细胞与上皮细胞之间的相互作用。荧光显微镜显示内皮细胞中红色细胞质的移位以及黄色膜环的出现，表明免疫突触的形成。...

通过活细胞成像评估免疫突触拓扑结构

来源：Ing-Esteves, S. &amp;#38; Lefebvre, J. L. 利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群体进行神经元树突发育的延时成像。J. Vis. Exp.

小鼠视网膜外植体中神经元树突动态的延时共聚焦成像

本文介绍了一种将玻璃支撑脂质双层技术与受激发射损耗（STED）超分辨率成像技术相结合的方法，用于形成免疫突触。本实验方案的目的是为使用者提供成功实施这两种技术所必需的操作步骤和指导。...

在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像

结合生化检测的光学显微技术揭示了SNARE介导的胞吐作用在netrin依赖性轴突分支中的参与。该技术组合可用于鉴定调控轴突分支和细胞形态变化的分子机制。...

利用联合方法学定义质膜运输在轴突分支和神经元形态发生中的作用

本文介绍了一种用于分析人原代T细胞与抗原呈递细胞之间免疫突触的定性和定量完整工作流程。该方法基于成像流式细胞术，可在相对较短的时间内获取并分析数千个细胞的图像。...

利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析

本方案用于成像免疫突触的形成过程以及随后向免疫突触定向的分泌性物质运输。细胞 conjugates 由经超抗原刺激的 Raji 细胞（作为抗原呈递细胞）与 Jurkat 克隆细胞（作为效应辅助性 T...

成像人类免疫突触

本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。...

精确脑图谱引导下对小鼠神经-免疫动态进行重复活体成像

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

本文展示了一种利用转盘共聚焦显微镜对视网膜中小胶质细胞的运动性及其与突触后斑点接触进行可视化和定量分析的方法。...

活体成像与特征分析疾病小鼠视网膜中小胶质细胞动态及其与突触的相互作用

了解利用内皮细胞作为平面抗原呈递细胞模型研究适应性免疫的新方法。该技术通过活细胞成像观察T细胞激活过程中免疫突触的时空动态，为深入理解抗原信号传导机制提供高分辨率分析工具。

用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

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