Descripción de una regulación dependiente de factor de transcripción del transcriptoma MicroARN

El objetivo general de esta metodología es describir cómo un factor de transcripción de interés regula el transcriptoma de microARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre si los factores de transcripción que modulan la transcripción de los genes que codifican proteínas también están involucrados en la transcripción de microARN. La principal ventaja de esta metodología es que integra la minería de datos, los datos de laboratorio y el análisis bioinformático para proporcionar una descripción completa de las transcripciones de genes de microARN que depende de la actividad del factor de transcripción de interés.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la interacción de la transcripción de genes de microARN y la actividad del estado del factor de transcripción, es importante recordar que se trata de un método descriptivo y que la confirmación de dicha asociación debe realizarse mediante ensayos adicionales. Para empezar, abra un navegador de genomas, como el navegador de genomas de la Universidad de California en Santa Cruz, para extraer los datos de secuenciación de la inmunoprecipitación de la cromatina. Una vez en el sitio, vaya al menú superior, seleccione Herramientas y abra el Explorador de tablas.

Escriba las especificaciones, como se muestra aquí, en sus cuadros respectivos y, a continuación, seleccione Obtener salida para extraer la tabla. Guarde la salida como un archivo de texto. A continuación, importa el archivo a una hoja de cálculo.

Una vez en el programa de hoja de cálculo, ordene la columna de nombre y filtre los resultados para un factor de transcripción de interés, como STAT2. A continuación, copie la lista de promotores de microARN en función de su firma epigenética H3K4me3 y pegue la lista en un archivo txt. A continuación, utilice el código complementario escrito en SQL y proporcionado en los archivos de datos complementarios para asignar los datos recopilados y determinar la afinidad de enlace mediana.

En primer lugar, añada 1,5 millones de células HEK293 a una placa de 10 centímetros y añada DMEM suplementado con un 10% de FBS. Cultive las células durante 24 horas hasta que alcancen aproximadamente el 50% de confluencia. A continuación, reemplace el medio.

A continuación, añada un agente de transvección combinado con cinco microgramos de una proteína de fluorescencia verde lentivirus que contenga el shRNA objetivo y cinco microgramos de vectores de empaquetamiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como control, transvección de una placa idéntica de células utilizando shRNA codificado y los vectores de empaquetamiento. Incubar la mezcla de transvección en las celdas durante 16 horas y luego cambiar el medio a 10 mililitros de medio DMEM fresco suplementado con 10% de FBS.

48 horas después de la transvección, retire los medios de las células. Luego, centrifugar durante cinco minutos para recolectar el sobrenadante infeccioso. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras para eliminar las células flotantes.

A continuación, agregue el medio en un dispositivo de filtro ultracentrífigo con un umbral de 100 kilodaltons. Centrifugar el medio para concentrar el Lentivirus hasta que el volumen sea inferior a 250 microlitros. Transfiera el líquido restante a un tubo criogénico y almacene el virus concentrado a menos 80 grados centígrados hasta que lo necesite.

Cuando esté listo para continuar, retire el Lentivirus congelado del congelador a menos 80 y lleve el vial a temperatura ambiente. Transfiera 100 microlitros de sobrenadante viral a un tubo de microfuga fresco de 1,5 mililitros y agregue 900 microlitros de medio sin suero. A continuación, agregue 10 nanogramos por mililitro de bromuro de hexadimetrina a la suspensión de virus de un mililitro.

Mezcle el tubo suavemente y deje reposar la mezcla durante cinco minutos. Recoja cinco millones de células para cada transducción planificada y luego vuelva a suspender suavemente la pastilla de células en 0,5 mililitros de medios que contengan el virus. Transfiera las células a una placa de 12 pocillos e incube durante cuatro a 24 horas.

A continuación, añade 0,5 mililitros adicionales de medio que contenga un 20% de FBS. De 48 a 72 horas después de la transducción, recoja las células y tíñalas con yoduro de propidio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la tinción, proteja las células de la luz y utilice datos para estimar la eficiencia de la transvección midiendo las tasas de células positivas para GFP y células negativas para yoduro de propidio.

A continuación, recoja la población de células GFP positivas clasificadas y extraiga sus proteínas. Por último, se utiliza la Western blot para determinar los niveles del factor de transcripción objetivo antes y después de infectar las células con el shRNA designado. Después de la transvección de células de LLC con shRNA STAT3, los niveles de ARNm de STAT3 y proteína STAT3 disminuyeron significativamente.

Además, una matriz de microARN de las células de LLC mostró 23 microARN cuya expresión difirió significativamente entre las células de LLC que se transfectaron con shRNA STAT3 y las células de LLC que se transvectaron con un vector vacío. Los resultados de la matriz de microARN se validaron para siete de los genes, que se muestran aquí, mediante RT-PCR cuantitativa. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunoprecipitación de cromatina y el ensayo de desplazamiento de electromovilidad y un ensayo de diferencia para validar que este factor de transcripción se une y activa el promotor de un gen espejo específico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo integrar el análisis bioinformático, los datos disponibles públicamente y el silenciamiento de un factor de transcripción utilizando el enfoque de shRNA para descubrir cómo este factor de transcripción regula la expresión de los genes de microARN.