Name: Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende a medir la actividad de la fosfatidiletanolamina metiltransferasa (PEMT) en extractos celulares de Leishmania mediante un ensayo in vitro con grupos metilo radiactivos. Este método permite estudiar el metabolismo lipídico sin purificar la enzima.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH ARRA RO3 AI078145 y 1SC3GM113743 a RZ.

1. Preparación de la célula Extracto <ol><li> Cultivar las células de Leishmania en una botella de plástico estéril sellado con tapa de aire ajustado a 26 ºC en un medio hecho de 1x M199 suplementado con 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 5 mg / ml heme , 0,35 g / L NaCO 2 H, adenina 0,1 mM y 2 g / ml biopterina sin agitación. Recoger las células por centrifugación a 1500 g durante 5 min a 4 ºC cuando alcanzan una densidad celular de 1-2 x 10 7 / ml. </li><li> Descartar el sobrenadante con una pipeta y se lavan las células resuspendiendo el sedimento celular con una pipeta serológica en medio del volumen de la cultura de solución salina tamponada con fosfato fría (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, mM Na 10 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4). Deseche sobrenadantes de células de acuerdo con los lineamientos de seguridad BL2. </li><li> Centrifugar las células de nuevo a 1.500 g durante 5 min a 4 ºC. Descartar el sobrenadante con una pipeta. Proceda to el siguiente paso o complemento congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -80 ºC (hasta tres meses). </li><li> Preparar tampón de lisis 2x (0,5 M de sacarosa, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, EDTA 2 mM, y el inhibidor de la proteasa cóctel 2x) y conservarse a 4 ° C en hielo. </li><li> Resuspender el sedimento celular (fresco o congelado) en un volumen igual de tampón de lisis 2x. Añadir 1 x volumen de perlas de vidrio. Vortex vigorosamente a 4 ºC durante 10 min. </li><li> Añadir 2 volúmenes de tampón de lisis 1x y mezclar. Extractos de células se centrifuga a 1500 xga 4 ºC durante 10 minutos para sedimentar las células intactas y núcleos. </li><li> Transferir el sobrenadante con una pipeta en un tubo de centrífuga fresco y mantenerla extractos de células en hielo hasta la finalización del experimento. </li></ol> 2. Determinar la concentración de proteína del extracto celular utilizando el kit de Estimación de proteínas como Ensayo de Ácido bicinconínico <ol><li> Preparar la solución de ácido bicinconínico (BCA) (1 ml / tubo) por mezcla de los BCA y cobre (II) sulfate en una proporción de 49: 1 (v / v). </li><li> Preparar los estándares de proteína de 0, 10, 20, 30, 40, 50, y 60 g / ml por dilución de una solución madre de 10 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) en alícuotas de 1 ml de la solución de BCA. </li><li> Añadir 2 l de extractos de células en 1 ml de solución BCA en los duplicados. Incubar los estándares y muestras de proteína durante 10 min en un baño de agua 60 ° C pre-calentado. </li><li> Muestras de Transferencia de hielo durante 3 min. Medir la absorbancia de los estándares y las muestras de proteínas con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 562 nm. </li><li> Calcular la concentración de proteína de los extractos celulares utilizando el estándar de BSA como referencia como se describe en el protocolo del fabricante. Diluir los extractos de células a una concentración de proteína de 10 mg / ml con tampón de lisis 1x. </li></ol> 3. ensayo enzimático en 200 l por tubo NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana química. <ol><li> Pruebe cada muestra por duplicado en unos 15 mltubo cónico. Preparar 20 l 1 M Tris HCl pH 7,5 por tubo y mantenerlo en hielo. Preparar 2 ml de cloroformo / metanol (1: 1 (v / v); solución de parada) a TA durante cada tubo. </li><li> Pipetear 20 l de 1 M Tris HCl pH 7.5 en cada tubo cónico de 15 ml en hielo. </li><li> Siga las normas de seguridad radiológica de aquí en adelante. Añadir el equivalente de 0,06 m (0,2 Ci) S - [metil- 3 H] adenosil-L-metionina y 50 mM frío SAM por tubo para un total de 50,06 M de SAM. Añadir x l de agua fría donde x = 200 (20 (de buffer) + 20 (para los extractos celulares) + volumen de frío y radiactivo SAM) por tubo. </li><li> Traslado cada tubo cónico a un baño de agua precalentado 30 ºC. Añadir a cada tubo 20 l de extractos de células (equivalente a 200 g de proteína) para iniciar la reacción. Incubar durante el tiempo deseado (0 a 45 min). </li><li> Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de cloroformo / metanol (1: 1; v / v; solución de parada) a cada tubo. Transferir el tubo cónico a RT (20-256; C). </li></ol> 4. Extracción de lípidos NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana química. <ol><li> Añadir 700 l de agua a cada tubo que contiene la muestra de reacción enzimática. Vortex vigorosamente durante 30 seg. Centrifugar a 1500 xg durante 5 min a temperatura ambiente para separar el orgánica de la fase agua. </li><li> Transferir la fase orgánica inferior en un nuevo tubo cónico de 15 ml con una pipeta. Añadir 1 ml de agua a cada &quot;fase inferior&quot; que contiene el tubo y agitar vigorosamente durante 30 seg. Centrifugar de nuevo a 1500 xg durante 5 min para separar el orgánica de la fase agua. </li><li> Transferir la fase orgánica inferior en un tubo de centelleo con una pipeta. Las muestras secas bajo una corriente de N2. Deseche las fases de agua que contienen el SAM radiactivo no incorporado y los tubos cónicos radiactivos como por las directrices de radiación. </li><li> Añadir 2 ml / tubo de líquido de centelleo. Medir la radiactividad incorporada con un cou de centelleonter acuerdo con el protocolo del fabricante y el uso del instrumento. </li><li> Calcular la actividad enzimática en mg de proteína / nmol utilizando la siguiente ecuación general: valor cpm x 10 x 3 [Total (radiactivos y frío) concentración de SAM (mM)] x 5 actividad específica de SAM radiactivo (Ci / mmol) x [concentración de SAM radiactivo (mM)] NOTA: el protocolo anterior se puede alterar para una concentración SAM dependiente o un ensayo de PEMA dependiente de la proteína. Para la concentración SAM ensayo enzimático dependiente, el tiempo se mantiene constante (15 min, que está en el intervalo lineal) y varias cantidades de frío SAM se añaden al ensayo, mientras que para el ensayo de PEMA dependiente de la proteína, la concentración de SAM (elegimos 0,05 mM) y la hora se mantuvo constante (15 min). También el pH del tampón se puede cambiar según sea necesario si algunas enzimas PEMA tienen un valor de pH óptimo diferente. </li></ol>

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</ol>

Ningún conflicto de interés declarado

Este ensayo PEMA simple, rápida permite la cuantificación de las formas metiladas de PE que resulta de la transferencia de grupos metilo radiactivos de SAM en PE utilizando extracto de células enteras como fuente de proteína. Es rápido, sensible, reproducible, y también es adecuado para las enzimas purificadas 17. Monometil- o dimetil-PE se pueden añadir a el ensayo si el metiltransferasa de interés es específica para estos sustratos en lugar de PE 12,13,18,19. Si se utiliza la enzima purificada PE...

Metiltransferasa fosfatidiletanolamina (PEMA) enzimas catalizan la unión covalente de uno o más grupos metilo utilizando S -adenosylmethionine (SAM) como donante de metilo en PE grupo, monometil o dimetil-PE-PE para dar monometil-PE, dimetil-PE y / o fosfatidilcolina (PC). Estas enzimas son casi omnipresentes en las células animales y hongos. También se pueden encontrar en algunas plantas 1 y aproximadamente el 10% de las bacterias, particularmente aquellos que interactúan con 2 eucariotas. PEMTs son relevantes para la biología de la célula no sólo contribuyendo a la producción de PC, que es la principal clase de lípidos en las células animales, sino también mediante el cumplimiento de otras funciones celulares importantes. En los mamíferos, PEMTs se expresan principalmente en el hígado donde son requeridas para la secreción normal de la lipoproteína de muy baja densidad y también contribuyen a la obesidad inducida por la dieta 3, 4 aterosclerosis, y la insulina se resistenANCE 5. Además, PEMA mamíferos también se expresan en los adipocitos, aunque a niveles más bajos, y participar en la deposición de grasa 6, 7. PEMA papel en el desarrollo del cáncer 8, 9 apoptosis, y 10 el crecimiento celular también se ha demostrado. En las bacterias, las enzimas PEMA han demostrado ser importantes para el crecimiento normal de las células 2, la virulencia 2, y la simbiosis con la planta huésped 11. El objetivo y razón de ser del presente protocolo es para medir la actividad PEMA a partir de extractos de células enteras, sin la necesidad de purificar la enzima. Dos protocolos distintos se han desarrollado para medir la actividad PEMA. La primera y más común se mide la transferencia de un grupo metilo tritiada de SAM radiactivo en PE, que es el tema de este artículo. Este protocolo ha sido desarrollado originalmente para medir la actividad de la levadura PEMA 12 y células de mamíferos (hígado) 13 para obtener una understanding de la biosíntesis de PC en estas células, así como para determinar la especificidad de estas enzimas. Más tarde, esta técnica se ha aplicado a otros tipos de células tales como bacterias 2 (utilizando un valor de pH básico para el ensayo aunque 15) y parásitos protozoarios 14. Esta técnica se puede utilizar con extractos de células enteras, así como enzima purificada, y potencialmente se puede aplicar a cualquier sistema de extracto celular. Un ensayo no radiactivo también se ha diseñado que se basa en la cuantificación enzimática de S -adenosylhomocysteine, el producto de transmetilación de SAM 16. El último ensayo puede ser más conveniente, ya que no implica la radiactividad pero sólo es adecuado para las enzimas purificadas.

<table><tbody><tr><td>S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina (actividad específica de 5-15 Ci/mMole)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>Alícuota el reactivo y congelar a -20 &deg; C; siga las pautas de seguridad de la radiación mientras usa este reactivo</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Roche Life Sciences 11836170001</td><td></td><td>diluirlo fresco&nbsp;</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio, lavadas con ácido, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ácido bicinconínico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>Contador de centelleo MicroBeta2 con 1 detector</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>BSA solución madre (10 mg/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Líquido de centelleo&nbsp;</td><td>Producto de investigación International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S-(5'-adenosil)-L-cloruro de metionina (clorhidrato)&nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>diluye el reactivo en 20 mM de HCl y congela las alícuotas a -80 &deg; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ensayo in vitro para medir fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Las metiltransferasas de fosfatidiletanolamina son enzimas biosintéticas que catalizan la transferencia de uno o más grupos metilo de S-adenosil-L-metionina a fosfatidiletanolamina, monometil-fosfatidiletanolamina o dimetil-fosfatidiletanolamina para dar monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Estas enzimas son ubicuas en células animales, hongos y también se encuentran en aproximadamente el 10% de las bacterias. Cumplen varias funciones importantes en la fisiología celular más allá de su papel directo en el metabolismo de los lípidos, como en la resistencia a la insulina, la diabetes, la aterosclerosis, el crecimiento celular o la virulencia. El presente manuscrito informa sobre un ensayo enzimático simple sin células que mide la transferencia de grupos metilo tritiados de S-[Metil-3 H]adenosil-L-metionina a fosfatidiletanolamina utilizando extractos de células enteras como fuente de enzimas. Las formas metiladas resultantes de la fosfatidiletanolamina son hidrofóbicas y, por lo tanto, se pueden separar de la S-[metil-3 H]adenosil-L-metionina soluble en agua mediante extracción orgánica. Este ensayo puede aplicarse potencialmente a cualquier otro tipo de células y utilizarse para probar inhibidores/fármacos específicos de una fosfatidiletanolamina metiltransferasa de interés sin necesidad de purificar la enzima.

La Figura 1 muestra un ensayo de PEMA dependiente del tiempo, que se llevó a cabo con extracto de células enteras Leishmania como una fuente de enzima usando PE endógena como sustrato. La cantidad de radiactividad en la fase orgánica se cuantificó por recuento de centelleo. Los números resultantes se utilizan para calcular la cantidad de grupos metilo tritiados transferidos a PE. La actividad PEMA fue lineal durante aproximadamente 20 min. A continuación, alcanz...

El presente informe describe un ensayo enzimático in vitro para medir la actividad de la fosfatidiletanolamina metiltransferasa utilizando extractos de células de Leishmania. Este ensayo se basa en la transferencia de un grupo metilo radiactivo de S-[Metil-3 H]adenosil-L-metionina a la fosfatidiletanolamina endógena.

Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

El objetivo general de esta metodología es cuantificar la actividad de la fosfatidiletanolamina metiltransferasa o PEMT a partir de extractos totales de células. Este método permite responder preguntas clave en el campo del metabolismo lipídico, como la importancia de las fosfatidiletanolamina metiltransferasas en la biosíntesis de fosfatidilcolina. La principal ventaja de este protocolo es que puede medirse a partir de extractos totales de células y no requiere la purificación de la enzima.Por lo tanto, este protocolo puede proporcionar información sobre cómo los parásitos sintetizan su lípido más abundante, la fosfatidilcolina. Este protocolo también puede aplicarse a otros tipos de células, como células de mamíferos y bacterias. Crecimiento de células de Leishmania en un frasco plástico estéril sellado con una tapa hermética a 26 grados Celsius en medio M199 suplementado sin agitación.Recolecte las células por centrifugación a 1500G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Cuando alcancen una densidad celular de 10 a 20 millones de células por mililitro. Después de eliminar el sobrenadante con una pipeta, lave las células resuspendiendo el sedimento celular con una pipeta

in-vitro-assay-to-measure-phosphatidylethanolamine-methyltransferase

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Investigación

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Biología

Este protocolo describe la preparación de un sustrato sintético para el...

Ensayo in vitro de metilación del ADN tRNA con Entamoeba histolytica y Dnmt2 tRNA metiltransferasa (Ehmeth) Enzima

Este video muestra un ensayo enzimático basado en cromatografía en capa fina para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa utilizando nucleótidos radiomarcados. El método proporciona información sobre la síntesis de nucleótidos y las reacciones de fosfotransferencia.

Ensayo de actividad enzimática basado en cromatografía en capa fina: una técnica para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa in vitro mediante cromatografía en capa fina

Proteína arginina metilación, catalizada por una clase de enzimas viz., La proteína arginina metil transferasas (PRMTs), es el proceso de adición enzimática de grupo (s) metilo para argininas dentro de las proteínas. El ensayo de metilación in vitro es la herramienta más fiable para evaluar el estado de metilación de sustratos PRMT conocidos o nuevos.

In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Describimos un protocolo básico para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro. Este protocolo se puede optimizar en función del nivel de actividad y los requisitos de una ATPasa purificada determinada.

Medición<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividad ATPasa para enzimática Caracterización

Existe una demanda para hacer clínico pruebas de una nueva clase de fármacos "huérfanos" llamadas chaperonas farmacológicas reproducible, rápida y eficiente. Desarrollamos un análisis basado en la cultura de célula simple, altamente estandarizados y versátil a pantalla para pacientes elegibles así como chaperonas farmacológicas novela drogas.

In Vitro Medición de la enzima a prueba chaperonas farmacológicas respuesta de Fabry y la enfermedad de Pompe

Aquí, describimos un método para purificar enzimas pyrophosphokinase etiqueta histidina y utilizando cromatografía en capa fina de sustratos marcados radiactivamente y productos para análisis de la actividad enzimática in vitro. El ensayo de actividad de la enzima es ampliamente aplicable a la quinasa, ciclasa de nucleótidos o reacción de transferencia de fósforo cuyo mecanismo incluye la hidrólisis de nucleótidos trifosfato.

Una purificación y análisis de actividad In Vitro de una (p) ppGpp sintetasa de Clostridium difficile

Aquí, se describe un ensayo in vitro libre de anticuerpos para el análisis directo de la actividad de la metiltransferasa en ARN sintético o transcrito in vitro.

Ensayo libre de anticuerpos para el análisis de actividad de la metiltransferasa de ARN

Aquí presentamos un método de cribado para inhibidores de la pirofosfatasa ligada a la membrana (de Thermotoga maritima)basado en la reacción azul de molibdeno en un formato de placa de 96 pocillos.

Detección de inhibidores de la pirofosfatasa ligadas a la membrana Thermotoga maritima

La palmitoylación implica la incorporación de una mitad de palmitato de 16 carbonos a los residuos de cisteína de proteínas diana de una manera reversible. Aquí, describimos un enfoque bioquímico, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitoylación de cualquier proteína de interés en los cascos cerebrales de ratón.

Ensayo de cambio de gel de intercambio Acyl-PEGyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Aprende a medir la actividad de la fosfatidiletanolamina metiltransferasa (PEMT) en extractos celulares de Leishmania mediante un ensayo in vitro con grupos metilo radiactivos. Este método permite estudiar el metabolismo lipídico sin purificar la enzima.

Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

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