Name: La inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales para inducir de forma aguda déficits cognitivos como la enfermedad de Alzheimer, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a realizar inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales sin instrumentos estereotáxicos. Este método induce déficits cognitivos agudos tipo Alzheimer para investigación en neurobiología y descubrimiento de fármacos.

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Esta investigación fue apoyada por una beca de la Tecnología de Corea I + D Proyecto de Salud a través del Instituto Coreano de Desarrollo Industria de la Salud (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar Social, República de Corea (número de concesión: H14C04660000).

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publications No. 8023, revisada 1978) y con el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de KIST (Seúl, Corea). 1. Preparación de los animales <ol><li> Preparar un grupo de ratones ICR macho de 7 semanas de edad (o C57BL / 6). </li><li> Deje que los ratones se someten a un proceso de aclimatación durante 3-7 días después del transporte para restaurar la homeostasis. En general, colocar un grupo de 4-5 ratones en cada jaula y mantenerlas a 22-23 ° C y 40% de humedad, con un ciclo de 12/12 horas de luz / oscuridad. Proporcionar agua y alimento ad libitum. Nota: El proceso de aclimatación es fundamental para permitir la recuperación de la tensión de la navegación y la adaptación a las nuevas viviendas, alimentos, agua, y el olor, así como una nueva jaula y el ciclo de luz. En este experimento, los animales fueron alojados en jaulas ventiladas individualmente (IVC), ubicado en la Speespe- instalaciones libres de patógenos -Grado (SPF) </li><li> Pesar cada ratón y excluir a los sujetos cuyo peso se desvía ± 10% de la media. </li><li> Divida a los sujetos en dos grupos: un grupo de vehículo de inyección (Aß (-)) y un grupo inyectado-beta (beta (+)). Si el experimento es poner a prueba la eficacia de un fármaco candidato en particular, dividir los ratones en cuatro grupos: (1) beta (-) / fármaco (-), (2) beta (-) / fármaco (+), (3) Aß (+) / drogas (-) y (4) Aß (+) / drogas (+). </li></ol> 2. Preparación de péptidos Aß <ol><li> Tratar los péptidos Aß, derivados por síntesis química 5 o de fuentes comerciales, con pre-refrigerada 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para disolver cualquier agregado y para hacer que los péptidos homogéneos 6 . <ol><li> Sonicar la solución Aß / HFIP en un sonicador de baño de María durante 5 min (a temperatura ambiente), suavemente vórtice, e incubar la solución durante 30 min a TA. Retire el HFIP por completo a través de la evaporación con nitrógenoy almacenar el homogénea Aß a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Preparar los monómeros Aß: (. 100 M Aß, DMSO al 10%, 90% PBS) que Aß 1 mM dimetilsulfóxido (DMSO) stock y se diluye 10 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) </li><li> Preparar oligómeros de Aß. <ol><li> Incubar la solución de monómero beta (que contiene beta (1-42) o beta (1-40)) (etapa 2.2.) A 37 ° C durante 3 ó 7 días, respectivamente. </li><li> Coloque la solución Aß en un tubo sellado en una bolsa con cremallera que contiene una toalla de papel húmeda para proporcionar un ambiente humidificado para impedir la evaporación de agua durante el período de incubación. </li></ol></li><li> Confirmar oligómeros Aß preparados a través de electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) con el foto-inducida por el entrecruzamiento de las proteínas no modificadas 6. </li><li> Preparar la solución de PBS de control que contiene 10% de DMSO para la inyección ICV vehículo. </li></ol> 3. Preparación de la jeringuilla </p&gt; <ol><li> Preparar una microjeringa con una aguja de acero inoxidable de 26 G para la inyección ICV. </li><li> Esterilizar la jeringa en autoclave con todo el otro aparato que será utilizado para el procedimiento quirúrgico. Después del autoclave, colocar el aparato bajo la luz UV durante 20 min. </li><li> Envolver la aguja de la microjeringa con Parafilm para ajustar su longitud a 3,8 mm para permitir la máxima precisión en la profundidad de la inyección en el cerebro (Figura 1A). (Para los ratones B6, ajustar la aguja de la jeringa a 3,6 mm). Nota: La compresión de la Parafilm dará lugar a la profundidad de la inyección superior a 3,6 mm ventral. Para evitar que el Parafilm se comprima durante la inserción de la aguja, la aguja densamente envolver varias veces. </li><li> Lavar el espacio interior de la jeringa con 70% de etanol, dos veces. </li><li> Sonicar la jeringa y la aguja en un sonicador de baño de María durante 30 min a TA. </li><li> Lavar el espacio interior de la jeringa con 70% de etanol, dos veces. </li><li> Enjuague la jeringacon agua destilada y se seca por completo en una campana de extracción durante más de 30 minutos. Deje la jeringa limpia bajo una luz UV durante 20 minutos antes de comenzar la inyección de Aß. </li></ol> 4. Aß-inyectada modelo de ratón Preparación Nota: Limpiar el campo de operación con un desinfectante para mantener las condiciones estériles y esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos para la inyección ICV utilizando 70% de etanol y la exposición UV. <ol><li> Anestesiar al ratón por inyección intraperitoneal de una mezcla de xilazina (20 mg / kg) y tiletamina · HCl / zolazepam · HCl (80 mg / kg) antes de la inyección ICV. Coloca el ratón sobre una estera cálido para mantener su temperatura corporal mientras anestesiado y confirme una anestesia adecuada mediante la evaluación de la respuesta pies pellizco. </li><li> Aplicar PBS estéril se reduce a ambos ojos para evitar la sequedad de la córnea durante el procedimiento (Figura 1B). </li><li> Preparar dos espejos dibujando varias líneas rectas verticales en sus superficies en caso de difficuLTY la inyección de la jeringa perpendicularmente. </li><li> Coloque un espejo (M1) justo al lado del cuerpo del ratón y el otro (M2) delante de la cabeza. Mantenga M1 paralelamente a la línea imaginaria entre los dos ojos del ratón y organizar M2 perpendicular a M1, de modo que los dos planos forman un ángulo de 90 ° (Figura 1C). Coloque M1 en el lado izquierdo del ratón, si el investigador es diestro. Coloque M1 en el lado derecho del ratón, si el investigador es zurdo. </li><li> Pulverizar 70% de etanol en el medio de la frente del ratón y lo frota con hisopos de algodón seco. No moje demasiado grande de un área de la frente para evitar la disminución de la temperatura corporal debido a la evaporación del alcohol. </li><li> Limpie la misma zona en la frente con una solución de clorhexidina al 2% utilizando un trozo de algodón limpio. Repita los fregados con el alcohol y clorhexidina para un total de tres veces cada uno. Nota: Si es necesario, afeitar el pelo en la frente del ratón con el fin de reducir al mínimo la posibilidad de contaminación </li><li> Localiza bregma. <ol><li> Usando el dedo pulgar y el dedo índice, sujeta fuertemente por la piel de la frente, justo encima de los dos ojos en la medida en que sobresalen los dos ojos. Arrastre la piel de la espalda para hacer la frente tensa y reducir al mínimo los movimientos del cráneo debajo de la piel. </li><li> Formar un triángulo invisible mediante la asignación de tres vértices: los dos ojos del ratón y el punto en el pulgar y el dedo índice se encuentran, al bregma. (Figuras 1B, la flecha roja: bregma) </li></ol></li><li> Localizar el punto de la inyección con la cinta de medición: -1,0 ± 0,06 mm posterior al bregma, 1,8 ± 0,1 mm lateral a la sutura sagital, y 2,4 mm de profundidad (Figura 1D, estrellas azules: puntos de inyección en cada hemisferio). (Para ratones B6: -0,9 mm posterior, 1,7 mm lateral y 2,2 mm de profundidad) </li><li> Llene la jeringa con 10 l solución Aß o vehículo con el exceso de solución con el fin de evitar la inyección de aire accidental. </li><li> Coloque la jeringa en el thletra e inyección (que se describe en el protocolo 4.7). Hacer la jeringa perpendicular al plano del punto de inyección. Align refleja imágenes de la jeringa en ambos espejos con las líneas dibujadas en los espejos desde un punto de vista fijo (Figura 1C). </li><li> Comenzar a insertar la aguja hasta que la envoltura de parafina llega a la piel. </li><li> Mantener la jeringa de la mano firme y utilizar la otra mano para inyectar 5 l de la solución de Aß o vehículo, lentamente durante 5 segundos sin detenerse. Asegúrese de que la jeringa se mantiene perpendicular a lo largo. Después de completar la inyección, espere de 3 a 5 segundos antes de retirar la jeringa para la difusión. </li><li> Suponiendo que la posición de triángulo original, ejerciendo una presión moderada para proteger el cráneo de todos los movimientos innecesarios. Retire la jeringa sin inclinar. </li><li> Coloque el ratón inyectado-Aß en la pista de calentamiento para la recuperación y mantener su posición de decúbito esternal. No deje desatendido el ratón hasta que recupera la conciencia y no devolver el mOuse a una jaula que contiene los ratones no quirúrgico hasta que se haya recuperado por completo. </li><li> Lavar la jeringa de acuerdo a los pasos 3.3-3.6. </li><li> Después de la operación seguimiento de la movilidad de los ratones y comprobar si hay cualquier signo de infección o enfermedad en los ratones durante 5-7 días. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53308/53308fig1.jpg" /> Figura 1. Inyección Aß en la región de ICV (A) de aguja de jeringuilla envuelto-Parafilm en comparación con una aguja de la jeringa sin modificar.; (B) PBS cae sobre los ojos para evitar la sequedad; el triángulo formado en la frente de ratón con el pulgar, el dedo índice, y los dos ojos del ratón, así como la línea media imaginaria equidistante de cada ojo; (C) dos espejos (M1 y M2) con múltiples líneas verticales dibujadas en las superficies para ayudar perpendicular inyección de la aguja de la jeringa; (D) el triángulo con los puntos de inyección, indicado como estrellas azules (-1,0 ± 0,06 mm del bregma y 1,8 ± 0,1 mm sagital) en cada hemisferio del ratón; Flecha verde: parafina, flecha roja: bregma <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53308/53308fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 5. Confirmación de Aß Injection por el laberinto Y y análisis del cerebro <ol><li> Evaluar la memoria de trabajo de los ratones inyectados con Aß por las pruebas del laberinto en 3,7,8 <ol><li> Espere 3 días después de la inyección de la aparición de déficits de memoria. </li><li> Realizar las pruebas del laberinto en que utilizan un laberinto de plástico negro con tres brazos idénticos denominados A, B, y C, cada una de las cuales se ramifica en un ángulo desde el centro del laberinto 120 ° (ancho x largo x 10 cm x 40 cm x 12 cm). </li><li> Coloque un ratón en el brazo de partida (grupo A) y permitir que el objeto de explorar libremente el laberinto durante 8 minutos. </li><li> Medir el número de entradas en cada brazo y calcular la alterntasa de inflación de cada sujeto 3,9. </li></ol></li><li> Directamente examinar los cerebros postmortem para comprobar si la inyección dirigida la región ICV adecuadamente. <ol><li> Anestesiar el ratón por el mismo procedimiento que se describe en la sección 4.1. A continuación, sacrificar el ratón por dislocación cervical. </li><li> Decapitar al ratón y quitar la piel para exponer el cráneo utilizando tijeras quirúrgicas. Retire los tejidos y los músculos del cráneo. </li><li> Hacer cortes en esta sutura (entre los huesos parietal y interparietales) sin dañar el cerebro. Retire el interparietales huesos occipital y, a continuación, los huesos parietal y frontal. Quitar el hueso del cráneo con unas pinzas y aislar el cerebro del cráneo levantando las meninges. </li><li> Lavar el cerebro en solución salina estéril enfriada y cortar la región ICV del cerebro en la dirección coronal con un cuchillo quirúrgico (Figura 2). </li><li> Confirmar la región de inyección basado en la traza de la inserción de la aguja en eltejido cerebral (Figura 2). Compruebe si la traza de la aguja ha alcanzado uno de los ventrículos. Si la traza de la aguja no cumple o pasan a través de los ventrículos, excluir los datos de sujetos que a partir del análisis de los resultados experimentales. </li></ol></li></ol>

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<li>Yamada, K., Nabeshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Alzheimer%27s+disease+and+evaluation+of+anti-dementia+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of Alzheimer's disease and evaluation of anti-dementia drugs.</a> Pharmacol Ther. 88, 93-113 (2000).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El paso más importante en este protocolo es la inyección ICV de Aß. Este protocolo está diseñado para inyectar Aß en la región de ICV de los ratones sin instrumentos estereotácticas 11,12. Antes de iniciar un experimento, un período preliminar de las inyecciones de práctica con un tinte azul en lugar de Aß debe llevarse a cabo para alcanzar la suficiente destreza. Inmediatamente después de la inyección, es necesario comprobar si la inyección de pigmento se lleva a cabo correctamente. Retire cuidadosamente el ...

Dado que el amiloide-β (Aß) es una característica patológica de la enfermedad de Alzheimer (EA), el desarrollo de modelos animales de AD se ha centrado en la sobreexpresión neuronal de Aß. Debido a que las mutaciones en la proteína precursora amiloide (APP) o la presenilina (PS) conducen a la perturbación del equilibrio Aß y en última instancia a la patogénesis de la EA familiar 1, los modelos de ratón que implican APP o PS mutaciones genéticas han sido generalmente aceptada. Entre la amplia gama de ratones transgénicos, los modelos prototípicos de ratón incluyen los siguientes: Tg2576, PDAPP, APP / PS1 y APP23. En el cerebro, estos ratones exhiben generalmente la agregación de Aß y placas seniles con el tiempo; la formación de placa es seguida por deterioro cognitivo significativo de tal manera que muestran bajo rendimiento en las pruebas de comportamiento de aprendizaje y memoria. La generación de la utilización de ratones transgénicos que, naturalmente, imitar AD patología humana ha contribuido tanto a la sociedad de investigación dC por lo que nos permite controlar la progresión de la diSease. Sin embargo, el uso de ratones transgénicos no es económico y requiere mucho tiempo, ya que toma meses para los ratones para desarrollar placas de Aß y aún más para mostrar sináptica Aß inducida o anormalidades de comportamiento 2,3. Originalmente desarrollado como una alternativa para superar las deficiencias de los modelos de ratones transgénicos, los modelos no transgénicos también se utilizan comúnmente debido a sus ventajas. modelos AD inducida por patógenos pueden ser producidos por la inyección directa de Aß en el cerebro, mientras que los déficits cognitivos-AD similares también pueden ser provocados por otros químicos y físicos medios, tales como la inyección de compuestos neurotóxicos, como la escopolamina, la inducción de lesiones en áreas relacionadas con la cognición, como el hipocampo, o por el daño cortical 4. Sin embargo, la inducción no patógena de deterioro cognitivo no refleja con precisión la fisiopatología de la EA fundamental; en su lugar, que sólo imita sus resultados sintomáticos. Por el contrario, un modelo de AD inducida por patógenos, la A46; modelo de ratón inyectados, no sólo puede mostrar anomalías de comportamiento similar a AD, pero también puede exhibir patología Aß, la característica común compartida por EA familiar y esporádica. A pesar de la dificultad para visualizar las placas de Aß en el tejido cerebral, el mayor beneficio del modelo de Aß-inyectado que lo hace atractivo para la investigación AD es su capacidad de control. Los investigadores pueden eliminar a las diferencias individuales en los modelos de ratón que pueden conducir a datos erróneos en los estudios relacionados con las drogas. tratamiento de drogas oportuna es activado dependiendo del mecanismo del fármaco candidato; para elaborar, un inhibidor de la agregación de Aß se puede aplicar antes de la inyección de Aß. Además, los investigadores pueden asumir que la transformación patógena que surge después de la inyección de Aß se deriva de la exposición Aß porque los otros factores están estrechamente controlados, incluyendo las diferencias individuales. En este protocolo, una vívida descripción de how para inducir un fenotipo similar a AD en ratones normales a través de la inyección de Aß intracerebroventricular (ICV) sin instrumentos estereotáxica se presenta. Reducir al mínimo el daño provocado inserción en el tejido cerebral es esencial para evitar la posibilidad de daños estructurales y la inflamación inducida por la lesión. A falta de habilidad en el manejo del ratón conduce a la lesión neuronal inesperado. Además, las técnicas que permiten que el ángulo y la profundidad apropiada para ser alcanzado durante la inyección son especialmente importantes para eludir errores frecuentes. Además de una explicación detallada, vivo de la inyección ICV, la fiabilidad del modelo producido por el siguiente protocolo también se ilustra en las siguientes secciones. El siguiente protocolo podría ser una herramienta fiable y de fácil comprensión que contribuye a la investigación AD, proporcionando así un peldaño que en última instancia podría conducir a un descubrimiento significativo para la sociedad AD.

<table><tbody><tr><td>Ratón ICR</td><td>Orientbio</td><td></td><td>macho, 6-8 semanas, 27-29 g de peso corporal</td></tr><tr><td>C57BL/6 ratón</td><td>Orientbio</td><td></td><td>macho, 6-8 semanas, 21-23 g de peso corporal</td></tr><tr><td>Amiloide-beta1-42</td><td>en síntesis interna</td><td></td><td>concentración de stock: 1 mM/DMSO, concentración inyectada: 100 &mu; Jeringa de inyección M/10% DMSO y 90% PBS</td></tr><tr><td>ICV (calibre 26s)</td><td>Hamilton</td><td>80308</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue dye (EBD)</td><td>abcamBIochemicals</td><td>ab120869</td><td>1% EBD en PBS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Gradi-GelTM II Gradient PAGE Kit</td><td>ELPiS Biotech</td><td>EBS-1056</td><td>15% Gel</td></tr><tr><td>Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0377</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de plata</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1150-01</td><td></td></tr><tr><td>LabDiet</td><td>Orientbio</td><td>5053</td><td></td></tr></tbody></table>

la inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales para inducir de forma aguda déficits cognitivos como la enfermedad de alzheimer,

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

El β de amiloide (Aβ) es un importante mediador patológico de la enfermedad de Alzheimer (EA) tanto familiar como esporádica. En el cerebro de los pacientes con EA, se observa una acumulación progresiva de oligómeros y placas de Aβ. Se cree que estas anomalías de Aβ bloquean la potenciación a largo plazo, deterioran la función sináptica e inducen déficits cognitivos. Las evidencias clínicas y experimentales han revelado que el aumento agudo de los niveles de Aβ en el cerebro permite el desarrollo de fenotipos similares al Alzheimer. Por lo tanto, en muchos casos es necesario un protocolo detallado que describa cómo generar de forma aguda un modelo de ratón con EA mediante la inyección intracerebroventricular (ICV) de Aβ. En este protocolo, se incluyen los pasos del experimento con un ratón inyectado en Aβ, desde la preparación de péptidos hasta la prueba de anomalías de comportamiento. El proceso de preparación de las herramientas y los sujetos animales antes de la inyección, de inyectar el Aβ en el cerebro del ratón mediante la inyección de ICV y de evaluar el grado de deterioro cognitivo se explican fácilmente a lo largo del protocolo, con énfasis en los consejos para una inyección efectiva de ICV de Aβ. Al imitar ciertos aspectos de la EA con una inyección designada de Aβ, los investigadores pueden evitar el proceso de envejecimiento y centrarse en la patología posterior de las anomalías de Aβ.

Esta sección ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener por la confirmación de la agregación de Aß y evaluación Y-laberinto de los déficits de memoria. Uso de la longitud completa de Aß se produjo (1-42) péptido de 42 aminoácidos, mezcla de monómeros Aß, oligómeros y fibrillas (Figura 3). A través de la etapa de monomerización HFIP inducida, se obtuvieron monómeros relativamente homogéneos (carril B). Después de la incubación de 7 días, diversos tamaños de ...

El amiloide-β (Aß): se inyecta modelo animal permite la administración de una cantidad y especies de fragmentos Aß definido y reduce las diferencias individuales dentro de cada grupo de estudio. Este protocolo describe la inyección intracerebroventricular (ICV) de Aß sin instrumentos de estereotaxia, permitiendo la producción de anomalías en el comportamiento de Alzheimer como en ratones normales.

La inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales para inducir de forma aguda déficits cognitivos como la enfermedad de Alzheimer,

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico consiste en realizar la inyección intracerebroventricular de beta amiloide sin utilizar instrumentos estereotácticos, y en inducir agudamente anormalidades en el comportamiento similares a las del Alzheimer en ratones normales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como el descubrimiento de fármacos para la enfermedad de Alzheimer. La principal ventaja de esta técnica es que podemos realizar la inyección directa de A beta en la región intracerebroventricular de los ratones sin necesidad de instrumentos estereotácticos, lo que nos permite imitar anormalidades en el comportamiento similares a las del Alzheimer en ratones sin tener que esperar al proceso de envejecimiento.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, ya que puede utilizarse para estudiar la patología descendente del péptido beta amiloide y para cribar candidatos a fármacos. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, porque puede ser complicado encontrar la ubicación precisa del bregma en el cráneo del animal. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución de beta amiloide de un milimolar con DMSO.Luego, dilúyalo diez veces en PBS. A continuación, prepare una solución de PBS que contenga 10 % de DMSO como vehículo para la inyección ICV. Después de eso, envuelva la microjeringa con una aguja de acero inoxidable de calibre 26 utilizando tiras de Parafilm para ajustar la longitud de la aguja y así lograr una inyección controlada en profundidad.Envuelva firmemente la jeringa varias veces para que el Parafilm no se comprima durante la inserción de la aguja y la longitud de la aguja permanezca constante. Luego, corte las capas de tiras de Parafilm para ajustar la longitud de la aguja a 3,8 milímetros entre la punta de la aguja y el Parafilm. A continuación, lave la jeringa dos veces con etanol al 70%.Posteriormente, enjuague la jeringa con agua destilada. Séquela completamente en una campana extractora durante al menos 30 minutos y deje la jeringa limpia bajo luz UV durante otros 20 minutos antes de la inyección. En este paso, coloque un ratón anestesiado de siete semanas sobre una alfombra cálida.A continuación, aplique gotas o ungüento de PBS estéril en ambos ojos para prevenir la sequedad corneal durante el procedimiento. Posteriormente, confirme una anestesia adecuada evaluando el reflejo de retirada extensora ante un pellizco en el dedo del pie. Luego, prepare dos espejos con múltiples líneas verticales trazadas sobre sus superficies para proporcionar referencias para la inyección perpendicular de la jeringa.Coloque un espejo justo al lado del cuerpo del ratón y el otro frente a la cabeza. Mantenga M1 paralelo a la línea media imaginaria entre los dos ojos del ratón y coloque M2 perpendicular a M1, de modo que los dos planos formen un ángulo de 90 grados. A continuación, rocíe etanol al 70 % sobre la frente del ratón y frótelo con torundas de algodón secas.Para localizar la bregma, coloque el pulgar y el índice directamente por encima de los ojos y presione ligeramente la frente hacia abajo hasta que ambos ojos sobresalgan. Al mismo tiempo, tire hacia atrás de la piel de la frente para minimizar el movimiento del cráneo bajo ella. Localice el sitio de inyección con una cinta métrica de sastre a una profundidad de 2,4 milímetros bajo el cráneo.Llene la jeringa con 10 microlitros de solución de A-beta o vehículo. Coloque la jeringa de forma que sea perpendicular al plano del sitio de inyección. A continuación, alinee las imágenes reflejadas de la jeringa en ambos espejos con las líneas dibujadas en los espejos.Comience a insertar la aguja hasta que el envoltorio de Parafilm toque la piel. Sostenga la jeringa con una mano e inyecte cinco microlitros de la solución de A-beta o del vehículo con la otra mano, lentamente durante cinco segundos sin pausas, y asegúrese de que la jeringa permanezca perpendicular en todo momento. Después de completar la inyección, espere de tres a cinco segundos antes de retirar la jeringa.Coloque el pulgar y los dedos índices nuevamente sobre la cabeza y sosténgala hacia abajo para evitar movimientos innecesarios del cráneo. Luego retire la jeringa sin inclinarla. Posteriormente, coloque el ratón sobre una almohadilla tibia para su recuperación.Para confirmar si se inyectó A-beta en la región ICV objetivo, revise el rastro de la inserción de la aguja en el tejido cerebral para verificar si alcanzó uno de los ventrículos. Si la inyección no tuvo éxito, excluya los datos de ese sujeto del análisis de los resultados experimentales. En este experimento, se utilizó el péptido completo de A-beta de 42 aminoácidos para producir una mezcla de monómeros, oligómeros y fibrillas de A-beta.Mediante el paso de monomerización inducida por HFIP, se obtuvieron monómeros relativamente homogéneos. Después de la incubación de siete días, se desarrollaron agregados de A-beta de diversos tamaños, en los que los trímeros y tetrámeros fueron las especies predominantes entre las formas oligoméricas de A-beta. En este estudio, la memoria de trabajo espacial se evaluó en ratones inyectados con A-beta mediante la prueba del laberinto en Y, en la cual se registró la secuencia de elecciones de brazos y el número total de entradas a los brazos mientras cada ratón exploraba libremente el laberinto.El grupo de ratones inyectados con A-beta mostró tasas de alternancia significativamente más bajas, lo que indica el desarrollo de déficits cognitivos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 20 minutos, incluyendo los procedimientos anestésicos, si se realiza adecuadamente. Al intentar estos procedimientos, es importante recordar colocar la aguja perpendicular al plano de inyección.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del descubrimiento de fármacos para la enfermedad de Alzheimer exploraran la selección in vivo de candidatos a fármacos en estos modelos roedores de Alzheimer fácilmente accesibles. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una inyección intracerebroventricular sin utilizar instrumentos estereotácticos.

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Transgénicos (Tg) los modelos de ratón de Alzheimer proporcionan una excelente oportunidad para investigar cómo y por qué los niveles de Aß y tau en el cambio CSF ​​conforme progresa la enfermedad en pacientes humanos. Este sentido, demuestran una refinada técnica de punción cisterna magna para el muestreo de LCR de serie del ratón.

Una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón

Este video muestra una técnica para la infusión continua de anticuerpos específicos del péptido beta amiloide (Aβ) en el hipocampo de una rata. El estudio emplea la implantación de un sistema de cánula bilateral para una infusión controlada de anticuerpos específicos del péptido Aβ junto con la infusión de oligómeros Aβ solubles (Aβo) en el hipocampo de la rata para estudiar las interacciones entre los oligómeros y los anticuerpos.

Infusión controlada de anticuerpos específicos del péptido Aβ y oligómeros Aβ en el hipocampo de la rata

Este video muestra el procedimiento para inyectar péptidos de beta-amiloide, cloruro de aluminio y un factor de crecimiento neuroinflamatorio, que colectivamente ayuda en la formación de placa amiloide tóxica en la región del hipocampo. Esto causa deterioro de la memoria en la rata, característico de la enfermedad de Alzheimer.

Establecimiento de un modelo de rata para la enfermedad de Alzheimer a través de una inyección de péptido de beta amiloide

Este video muestra la infusión estereotáxica precisa de beta amiloide en el giro dentado para establecer un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer. La determinación precisa de las coordenadas y la administración controlada de las proteínas beta amiloides dan como resultado la degradación neuronal, lo que interrumpe el procesamiento de la memoria y contribuye al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.

Infusión cerebral estereotáxica directa de proteínas beta-amiloide para un modelo de enfermedad de Alzheimer

Fuente: Arango-Lievano, M. et. al., Imágenes longitudinales in vivo de la vasculatura cerebrológica: relevancia para las enfermedades del SNC. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra imágenes in vivo de dos fotones para visualizar placas de amiloide marcadas con fluorescencia y vasculatura cerebral. La fluorescencia azul marca las placas, mientras que la fluorescencia verde resalta los vasos sanguíneos cerebrales. Un mapa 3D de la región de interés y un mosaico de imágenes de alta resolución...

Imágenes in vivo de vasos cerebrales y placas amiloides en un modelo de ratón con enfermedad de Alzheimer

Aquí, presentamos un protocolo para la infusión cerebral estereotáxica directa de beta-amiloide. Esta metodología proporciona un modelo de ratón alternativo in vivo para abordar los efectos a corto plazo de la beta-amiloide en las neuronas cerebrales.

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Para estudiar los efectos del Aβo in vivo, desarrollamos un modelo basado en infusiones repetidas de Aβo soluble en el hipocampo junto con una infusión continua de anticuerpo Aβo (6E10) en el hipocampo utilizando bombas osmóticas para contrarrestar el efecto neurotóxico del Aβo.

Neurodegeneración en un modelo animal de beta-amiloide crónica Oligómero de infusión es contrarrestado por el anticuerpo Tratamiento Con una infusión de bombas osmóticas

Este protocolo describe la síntesis, caracterización y la inyección de péptidos monomérico amiloide-β42 para generar toxicidad amiloide en pez cebra adulto para establecer un modelo de la enfermedad de Alzheimer, seguido por análisis histológicos y la detección de agregaciones.

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Se trata de un protocolo para imitar la enfermedad de Alzheimer en ratas mediante la evaluación de deterioro de la memoria espacial, cambios patológicos neuronales, neuronal amiloide beta proteína (Aβ) carga y combinado de la agregación de los enredos de neurofibrillary, inducida por la inyección de Aβ25-35 con tricloruro de aluminio y recombinantes humanos transformar el factor de crecimiento β1.

Establecimiento de un imitador valiosa de la enfermedad de Alzheimer en modelo Animal de rata por la inyección Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compuesta

El modelo de inyección de sangre autóloga de la hemorragia intracerebral en ratones descritos en este protocolo se utiliza la técnica de doble inyección para minimizar el riesgo de reflujo de sangre hasta el trayecto de la aguja, no los anticoagulantes en el sistema de bombeo, y elimina todo el espacio muerto y el tubo extensible en el sistema.

Inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones

Aprende a realizar inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales sin instrumentos estereotáxicos. Este método induce déficits cognitivos agudos tipo Alzheimer para investigación en neurobiología y descubrimiento de fármacos.

La inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales para inducir de forma aguda déficits cognitivos como la enfermedad de Alzheimer, (Video) | JoVE Journal

La inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales para inducir de forma aguda déficits cognitivos como la enfermedad de Alzheimer,

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