Name: Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda a monitorizar neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas de ratones mediante microscopía confocal intravital. Esta técnica permite analizar la dinámica de leucocitos en condiciones de estado basal e inflamación.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por EMBO (a Y.E.), Foundation Machaon (a Y.E.) y SNSF (a B.A.I.). Agradecemos al Centro Central de Bioimágenes por la disponibilidad del microscopio Nikon A1r y la asistencia técnica. Agradecemos a la Sra. Clarissa Bartley por la corrección en inglés.

NOTA: Los procedimientos en animales se realizaron de acuerdo con el Comité de Ética Institucional de Cuidado de Animales en Ginebra, Suiza y la Oficina Veterinaria Cantonal. Número de Autorización de GE / 63/14. 1. Preparación de una suspensión de células individuales a partir de médula ósea <ol><li> Sacrificio del ratón (8-12 semanas de edad) por dislocación cervical. Esterilizar patas traseras con etanol al 70%. Retire la piel de las patas traseras. </li><li> Diseccionar fémures y tibias del ratón y eliminar el tejido de las piernas con un bisturí. Enjuague piernas con etanol al 90% y el lugar en una placa de cultivo lleno de PBS. </li><li> Bajo el capó cultura, pañuelo de papel limpio de fémur y la tibia con un bisturí y se separan en articulación de la rodilla. Cortar los extremos de los huesos. </li><li> Médula ósea Flush de cada hueso utilizando una aguja 23G y una jeringa de 1 ml llena con medio de preparación (fenol DMEM / F12 sin rojo, 1% de suero de rata), a unos 50 ml tornillo tubo. Interrumpir agregados celulares por delicadeza pases a través de la ne 23Gedle y una jeringa de 1 ml. Traiga volumen total de 25 ml con medio de preparación. </li><li> Centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. Sobrenadante Descartar. Pellet Resuspender en 1 ml de glóbulos rojos tampón de lisis RBLC (8,3 g NH 4 Cl, 1 g de NaHCO 3, 1 ml de EDTA (100 mM), completa a 1 litro con agua destilada, filtro de 0,22 micras) en unos 15 ml tornillo tubo. Incubar 30 segundos en hielo. </li><li> Añadir 10 ml de medio de preparación y centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender en 2 ml de medio de preparación. </li></ol> 2. neutrófilos Enriquecimiento por selección negativa <ol><li> Añadir 150 l de ratón cóctel enriquecimiento de neutrófilos (kit de plataforma de aislamiento de células tales como EasySep). Mezclar e incubar en hielo durante 10 min. </li><li> Añadir 10 ml de fenol DMEM libre de rojo. Invertir una vez y centrifugar 250 xg, 3 min, 4 ° C. </li><li> Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet en 1,75 ml de medio de preparación en 5 ml de poliestireno ronda tubos de fondo. Añadir 250 l BiotCóctel en Selección. Mezclar e incubar en hielo durante 10 min. </li><li> Vortex las partículas magnéticas (del kit de plataforma de aislamiento de células) durante 30 segundos para volver a suspender las partículas. Añadir 500 partículas magnéticas mu l a la suspensión celular. Mezclar e incubar en hielo durante 10 min. </li><li> Coloque el tubo en el imán. Espere 3 min. </li><li> Invertir el imán a un nuevo 5 ml de poliestireno ronda tubos de fondo para recoger las células no marcadas deseadas. No tome la última gota que cuelga en el tubo. Las células no deseadas se mantendrán en el tubo en el interior del imán. Deseche este tubo en un peligros biológicos. </li><li> Coloque el nuevo tubo en el imán. Espere 3 min. </li><li> Invertir el imán a un nuevo tubo de 15 ml de tornillo para recoger las células no marcadas deseadas. No tome la última gota que cuelga en el tubo. </li><li> Volumen completa a 5 ml con rojo fenol libre de DMEM. </li></ol> 3. El etiquetado de los neutrófilos <ol><li> Añadir 0,5 l de un tinte de color naranja como la célula Rastreador de Orange (concentración de trabajo1 M, CMRA - clorometil-rodol-acetato, madre 10 mM en DMSO). Incubar 2 minutos a 37 ° C. </li><li> Añadir 2,5 ml de medio de preparación. Centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet en 1 ml de medio de preparación en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Tomar una alícuota de contar con hematocitómetro. </li><li> Incubar 5 minutos a 37 ° C. Centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet en 1 ml de PBS. Centrifugar 250 xg, 5 min, 4 ° C para lavar. </li><li> Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet como 10x10 6 células por 100 l de PBS. Mantenga en hielo hasta que la inyección iv. NOTA: Las células tienen que ser iv inyecta lo más rápidamente posible. 6-12x10 6 neutrófilos / ratón se obtienen por lo general. </li></ol> 4. Preparación del ratón por Microscopia intravital NOTA:.. Paso 4.1) y 4.2) se debe realizar al comienzo del experimento para evitar tiempo de espera prolongado de los neutrófilos marcados en icmi. <ol><li> Pese la CX 3 CR1 ratón gfp (8-12 semanas de edad). </li><li> Preparar 800 l de anestésicos ketamina (60 mg / kg, xilazina 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg en PBS). </li><li> Anestesiar el ratón. Ip inyección con 200 l / 20 g de ratón. Anestesia de control por los pies pellizcos y marcando la frecuencia respiratoria. </li><li> Inyectar neutrófilos (10x10 6 células en 100 l de PBS) por vía intravenosa utilizando las venas de la cola laterales o del seno retro-orbital, a conveniencia del experimentador. </li><li> Ponga el ratón en el cojín de calefacción y proteger los ojos con el gel ocular. </li><li> Un cubreobjetos de vidrio (35 mm de diámetro) se coloca en una placa de cultivo tisular de 10 cm, que tiene un agujero de diámetro 30 mm. Uso de aceite es mantener la placa de cultivo de tejido en contacto con el cubreobjetos. </li><li> Incisión en la piel del abdomen con unas tijeras para exponer el peritoneo. Incisión en el peritoneo con tijeras para exponer intestino. </li><li> Añadir 200 l de PBS (pre-calentada a 37 ° C) en el pcavidad eritoneal. Tome el ratón en la mano y ponlo boca abajo, de modo que el intestino se sale de la cavidad peritoneal con una suave presión. Coloque el ratón en la placa de cultivo tisular. </li><li> Deroll suavemente el intestino con bastoncillos de algodón esterilizado en el cubreobjetos con el fin de exponer los vasos mesentéricos. </li><li> Cortar pañuelos de papel en bandas y mojar con 37 ° C PBS calentado. Inmovilizar el intestino con las piezas de pañuelos de papel para disminuir los movimientos resultantes de la peristalsis. </li><li> Coloque la placa de cultivo de tejidos y el ratón dentro de la cámara de termostato 37 ° C en el escenario de la bandeja a medida del microscopio invertido. Introducir una jeringa que contiene anestésicos sc en la pata trasera. NOTA: Además, el ratón puede recibir oxígeno (0,5 L / min) con una máscara. </li><li> Ratón de control para la anestesia por pellizco del dedo del pie y el control de la frecuencia respiratoria cada 30 min. Si es necesario, proporcionar un impulso de anestésicos (20 l) para mantener adecuadamente la anestesia. NOE: El secado de la vasculatura debe ser evitado. Por lo tanto, su humedad se mantiene mojando regularmente los pañuelos de papel utilizados para inmovilizar el intestino con 37 ° PBS calentado-C. </li></ol> 5. Medición de neutrófilos y monocitos Comportamiento en buques inflamadas in vivo utilizando Microscopia intravital <ol><li> Láseres Set de 488- y 561- en la potencia más baja necesaria para evitar fototoxicidad inducida por láser. En nuestros experimentos, es inferior a 0,5%. La intensidad de las buenas prácticas agrarias en monocitos y tinte de color naranja en los neutrófilos es tan brillante que normalmente 0,3% es suficiente. NOTA: Esto representa una potencia láser de 0,15 a 0,25 mW con nuestro sistema. </li><li> Adquirir imágenes de 512 x 512 píxeles (es decir, 635 micras) en 2,2 segundos con un agujero de alfiler abierto con el objetivo seco del microscopio invertido 20X. Use un z-profundidad entre 10 y 20 micras, que asegura la señal suficiente con las potencias bajas láser. NOTA: Por lo general, realizamos experimentos con un z-profundidad entre 12 y 1656; m. En el caso de cifras presentadas y películas, el Z-profundidad es de 20 micras. Contraste de fase permite la identificación de las paredes endoteliales y las imágenes se realiza en las venas mesentéricas. Dado que las células que patrullan mueven muy lentamente con una velocidad de 5 a 10 micras de / min 6, la grabación de un campo de interés cada 20 seg es satisfactoria. Con los ajustes descritos, la etapa motorizada permite la grabación de hasta 7 campos de interés al mismo tiempo. </li><li> Coloca el ratón y los vasos mesentéricos en la cámara de termostato del microscopio se les permite recuperarse de la preparación durante 30 minutos antes de la adquisición de la primera película. Durante este tiempo, elegir varios campos de interés. Centrarse en la superficie luminal del vaso más cercana al objetivo. Si es necesario, se aprovechan de la leve autofluorescencia del endotelio para ajustar el enfoque. NOTA: La cirugía durante la preparación del ratón destaca ligeramente el endotelio. En consecuencia, laminados de los neutrófilos y/ o monocitos se pueden observar en la primera después de la preparación del ratón 15 min. </li><li> Grabar una primera película de 30 minutos bajo condiciones de estado estacionario, una imagen cada 20 segundos. NOTA: El software adquiere cada campo de interés en 2,2 segundos y la platina motorizada se mueve automáticamente de un campo a otro. Se remonta a la primera posición dentro de 20 segundos durante los 30 minutos de la película de grabación. </li><li> Para iniciar la inflamación de los vasos de la sangre, añadir una gota de 20 l de PBS que contenía 100 mg de TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 12 directamente sobre los vasos fotografiados. </li><li> Controlar el enfoque para cada campo de interés. NOTA: Durante el curso de adquisición, siempre hay pequeños cambios de enfoque en el eje z. A pesar de 10 a 20 micras z la profundidad, esto puede resultar en una disminución de la intensidad de fluorescencia. Por lo tanto, reorientar manualmente cada campo de interés al final de cada película, si es necesario. Grabar películas durante 30 min períodos y hasta 3 horas paraTal después de la iniciación de la inflamación. </li><li> Al final del experimento, sacrificar ratón anestesiado por dislocación cervical. </li></ol> 6. Generación de archivos de película y Seguimiento de leucocitos NOTA: El software de adquisición de Nikon genera .nd2 archivos, pero el siguiente procedimiento sería similar con otro software y marcas. <ol><li> Exportar archivos como serie tiff. </li><li> Ir al software ImageJ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Importe la serie tiff. Cada canal como un archivo diferente. </li><li> Aplicar un filtro de mediana con un radio de 2,0 píxeles para los canales verde y rojo para reducir el ruido de fondo (Proceso&gt; Filtros&gt; La mediana ...). </li><li> Convertir archivos en binario (Proceso&gt; Binary&gt; Hacer binario). Habilitar el software para calcular el umbral para cada imagen. </li><li> Combinar canales en una sola serie de imágenes (Imagen&gt; Color&gt; Combinar Canales ...). Seleccione los monocitos en el gradon canal, los neutrófilos en el canal rojo y la luz transmitida en el canal gris. </li><li> Convertir imágenes apiladas en colores RGB (Imagen&gt; Color&gt; pila para RGB). </li><li> Guardar archivo como .avi </li><li> Los datos se importan y se compilan en el software Imaris (Bitplane). Los movimientos de los monocitos y los neutrófilos son entonces rastreados mediante el Asistente de Seguimiento Spot. </li></ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaching+multiple+barriers%3A+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li>
<li>Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLey%2C+K+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 445, 255-279 (2008).</li>
<li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li>
<li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li>
<li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+NR4A1+%28Nur77%29+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li>
<li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li>
<li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li>
<li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li>
<li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li>
<li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nr4a1-dependent+Ly6C%28low%29+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109(2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Las metodologías descritas en este manuscrito proporcionan un enfoque coherente para estudiar de manera eficiente los monocitos y el comportamiento de los neutrófilos en las venas mesentéricas bajo condiciones de estado estacionario e inflamatorias. El paso crucial de la preparación es la inmovilización del intestino con tejidos contacto con el medio PBS. Si se realiza correctamente, los vasos mesentéricos están muy bien expuestos en el cubreobjetos para la adquisición de imágenes. Esto perm...

<html> Los neutrófilos y los monocitos son las células del sistema inmune innato que circulan continuamente en la sangre. Tras la lesión o infección, inducen señales inflamatorias diapedesis de leucocitos en los tejidos dañados y infectadas, en el presente documento iniciar una respuesta inmune celular a 1-3. La rapidez de la movilización de leucocitos determina el resultado positivo de las respuestas inmunes. Estos procesos complejos se basan en moléculas específicas (por ejemplo, selectinas, quimiocinas endotelio unida) presentes en el endotelio inflamado que ayudan para el establecimiento de contactos adhesivas entre leucocitos circulantes y el endotelio 1-3 .Para obtener ideas sobre las moléculas implicadas en los leucocitos cascada de reclutamiento, es importante para visualizar la cinética de reclutamiento de células y para rastrear el comportamiento de cada célula / población. Un método eficaz consiste en microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés. contenido &quot;&gt; Hasta la fecha, varios enfoques mediante microscopía intravital se desarrollaron para la imagen de la vasculatura 4,5. Por ejemplo, se utilizó la imagen de la dermis del oído vasculatura o venas mesentéricas por microscopía confocal intravital para identificar el comportamiento de patrullaje de Ly6C murino monocitos bajos y humana CD14 dim monocitos CD16 + en el lado luminal de los vasos sanguíneos en condiciones de estado estacionario 6-8. El modelo vasculatura cremáster ratón se utiliza a menudo para monitorear el comportamiento de neutrófilos o monocitos Ly6c inflamatoria altos en condiciones inflamatorias o isquémicas en ratones transgénicos. En ese caso, cremáster se estimula a través de la inyección de intraescrotal IL1β, CCL2, TNFß o fMLP. Después de 2-4 horas, tejidos se exteriorizan y se analizaron por microscopía confocal intravital 9-11 quirúrgicamente. El siguiente protocolo describe un método para monitorear monocitos y neutrófilos, al mismo tiempo con cualquierde fluorescencia invertida microscopio confocal. Por otra parte, nuestro método detalla cómo reproducir el mismo recipiente antes (condición de estado estable) y después de la inflamación y cómo seguir la cinética de reclutamiento de leucocitos. Para este fin, se utiliza el CX 3 CR1 ratón gfp / peso, cuya monocitos expresar eGFP, iv inyectado con una naranja neutrófilos murinos marcados con colorante. El uso de un microscopio confocal invertido, es posible (1) para rastrear y analizar los monocitos bajos Ly6c patrullaje bajo condiciones de estado estacionario y (2) para seguir el reclutamiento de monocitos y neutrófilos ambos en el mismo recipiente después de la inflamación local. Aquí creamos las condiciones inflamatorias mediante el agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Además, tal formación de imágenes puede ayudar a determinar el papel de las moléculas específicas de interés en las diversas etapas de la cascada de reclutamiento de leucocitos si se realiza en ratones knock-out específicas o en presencia de anticuerpos bloqueantes 6,9,13.

<table><tbody><tr><td>5 ml de tubos de poliestireno de fondo redondo&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&nbsp; &nbsp; DT: 4mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT: 1mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Naranja CMRA Dye Life</td><td>Technologies</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de enriquecimiento de neutrófilos</td><td>para ratones Stem Cell Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión Tipo A</td><td>Nikon</td><td></td><td>cualquier aceite viscoso&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de control de temperatura Life</td><td>Box Life Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Nikon A1R</td> Microscopio invertido <td>Nikon</td><td>A1R</td><td>, platina motorizada x/y/z, software de elementos NIS</td></tr><tr><td></td><td>PBS Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr> libre <tr><td>de rojo de fenol DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>cualquier medio libre de rojo fenol es adecuado</td></tr><tr><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>reconstituir en PBS</td></tr><tr>Tecnologías <td></td> de <td>células madre</td> de<td>suero de rata</td><td>incluidas en el kit de enriquecimiento de neutrófilos de ratón EasySep</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por microscopia intravital en ratones anestesiados en tiempo real

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Respuesta inmune eficiente depende de la rápida movilización de leucocitos de la sangre al sitio de la infección o lesión. La investigación de la migración de leucocitos in vivo es crucial para entender la base molecular de la migración transendotelial de leucocitos y la interacción con el endotelio vascular. Un enfoque poderoso implica microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés. Aquí se presenta un protocolo para los monocitos de imágenes y neutrófilos en el CX 3 CR1 gfp / peso iv ratón inyectado con neutrófilos marcado tinte de color naranja con un microscopio confocal invertido. Películas Time-lapse recogidos de 30 minutos a varias horas de imágenes de permitir el análisis del comportamiento de leucocitos en las venas mesentéricas, tanto en condiciones de estado estacionario e inflamatorias. También describe los pasos para inducir localmente inflamación de los vasos de sangre con TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 y supervisar el subsequent reclutamiento de neutrófilos y monocitos. La técnica presentada también se puede utilizar para controlar otras poblaciones de leucocitos e investigar moléculas implicadas en el reclutamiento de leucocitos o el tráfico que utilizan otros estímulos o ratones transgénicos.

El manuscrito describe un protocolo optimizado para controlar fácilmente el comportamiento de los monocitos y neutrófilos en las venas mesentéricas de ratones anestesiados en tiempo real. El uso de una cámara termostatizada-C 37 ° es obligatoria para mantener la temperatura del ratón y también debido al movimiento dependiente de la temperatura de los leucocitos. Preparación del ratón se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra toda la zona visto bajo el microscopio. Luz transmitida p...

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

El objetivo general de este procedimiento de microscopía confocal intravital es monitorear la dinámica de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas bajo condiciones de estado estable e inflamatorias en ratones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cuáles son las bases moleculares de la migración de leucocitos, su reclutamiento e interacción con el endotelio vascular. Las principales ventajas de esta técnica son la capacidad de rastrear y analizar el patrullaje de monocitos LY60 low en condiciones de estado estable, y de seguir el reclutamiento de monocitos y neutrófilos hacia el mismo vaso tras la aplicación de un estímulo inflamatorio local. El procedimiento lo demostrará Stefan Ler, el técnico del laboratorio. Para preparar una suspensión única de células a partir de médula ósea, se esterilizan las patas traseras de un ratón de ocho a doce semanas de edad con etanol al 70%, y luego se utiliza un escalpelo para extraer los fémures y las tibias una vez que todos los huesos han sido desconectados.Lave las patas con etanol al 90 % y transfiera los huesos a una placa de cultivo llena con PBS. Luego, en una cabina de cultivo, use un escalpelo para limpiar los fémures y las tibias y separarlos en la articulación de la rodilla. A continuación, corte los extremos de los huesos y use una jeringa de un mililitro cargada con medio de preparación y equipada con una aguja de calibre 23 para lavar la médula de cada hueso hacia un tubo cónico de 50 mililitros.Desintegre los agregados celulares pasándolos nuevamente a través de la punta de la aguja y luego complete el volumen total de la suspensión celular hasta 25 mililitros con medio fresco, centrifugue las células y resuspenda. Suspenda el tejido en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo. Después de 30 segundos, detenga la lisis con 10 mililitros de medio de preparación.Centrifugar nuevamente las células y resuspender el precipitado en 2 mL más de medio de preparación para enriquecer los neutrófilos mediante selección negativa. Primero, incubar las células de la médula ósea con 150 µL de un cóctel de enriquecimiento de neutrófilos de ratón en hielo durante 10 minutos.Al final de la incubación, agregue 10 mililitros de DMEM sin rojo de fenol. Invierta el tubo una vez y centrifugue las células. Re suspenda el precipitado en 1,75 mililitros de medio de preparación y transfiera las células a un tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros.Luego, incube las células con 250 microlitros de la mezcla de selección de biotina en hielo durante 10 minutos. Al final de la incubación, suspenda las partículas magnéticas del kit de aislamiento celular mediante vortex durante 30 segundos. A continuación, incube las células con 500 microlitros de las partículas en hielo durante 10 minutos.Al finalizar la incubación, coloque el tubo en el imán. Después de tres minutos, invierta el imán en un nuevo tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros. Para recoger las células no marcadas, coloque el tubo con las células no marcadas en el imán.Después de tres minutos, invierta el imán en un tubo cónico de 15 mililitros para transferir las células no marcadas, dejando la última gota en el tubo. Luego, complete el volumen hasta cinco mililitros con dm fresco sin rojo de fenol. A continuación, agregue medio microlitro del colorante citoplasmático adecuado, como el Cell Tracker Orange utilizado aquí, a las células a 37 grados Celsius.Después de dos minutos, a 37 grados Celsius, lave las células con 2,5 mililitros de medio de preparación y resuspenda el precipitado en un mililitro de medio de preparación en un tubo de 1,5 mililitros, cuente las células y luego incúbelas durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Después de centrifugar las células, suspendemos el precipitado en un mililitro de PBS seguido de otra centrifugación mientras las células están girando. Use aceite para fijar un cubreobjetos de vidrio de 35 milímetros a una placa de cultivo tisular de 10 centímetros de diámetro con un orificio de 30 milímetros de diámetro.Luego, resuspenda el precipitado a una concentración de un por diez a la siete células por 100 microlitros de PBS y coloque las células en hielo lo antes posible tras la etiquetación. Inyecte intravenosamente las células de neutrófilos etiquetadas en un ratón CX tres CR uno GFP anestesiado de ocho a doce semanas de edad, y coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora. Aplique inmediatamente pomada en los ojos del animal y use tijeras para abrir la piel abdominal, exponiendo el peritoneo; luego haga una incisión en el peritoneo con las tijeras para exponer el intestino.Luego, administre 200 microlitros de PBS a 37 grados Celsius en la cavidad peritoneal y gire al ratón boca abajo sobre la placa de cultivo celular para extraer los intestinos de la cavidad peritoneal aplicando una presión suave. A continuación, utilizando bastoncillos de algodón estériles, enrolle cuidadosamente los intestinos sobre el cubreobjetos para exponer los vasos mesentéricos e inmovilice el tejido con trozos de papel de filtro humedecido con PBS a 37 grados Celsius, con el fin de reducir los movimientos provocados por la peristalsis. Es muy importante tomarse el tiempo necesario para inmovilizar cuidadosamente el intestino con trozos de papel humedecido en PBS.De lo contrario, los movimientos resultantes del peristaltismo durante la adquisición de imágenes arruinarán el experimento. A continuación, transfiera el recipiente de cultivo celular y el ratón a una cámara termostatizada a 37 grados Celsius sobre una plataforma trazada personalizada de un microscopio invertido y administre una segunda dosis de anestésicos por vía intramuscular en la pata trasera. Ahora configure los láseres apropiados a la potencia más baja necesaria para evitar la fototoxicidad inducida por el láser y permita que el ratón descanse durante 30 minutos.Una vez que el animal se haya recuperado, registre la primera película durante 30 minutos bajo condiciones de estado estable. Luego, para inducir la inflamación del vaso sanguíneo, agregue una gota de 20 microlitros de PBS que contenga 100 microgramos del agonista TLR dos TLR uno PAM tres CSK cuatro directamente sobre los vasos analizados. Finalmente, adquiera una segunda película, teniendo cuidado de controlar el enfoque tras la adición del agonista, ya que la inflamación induce cambios en el ancho del endotelio, alterando el enfoque del eje Z. Aquí se muestran, por primera vez, los diferentes pasos del procesamiento de imágenes para el primer punto temporal de una película adquirida bajo condiciones de estado estable, tal como se acaba de demostrar, en esta película.El patrullaje de los monocitos verdes de cilo LASIK en condiciones de estado estable puede visualizarse junto con neutrófilos rojos observados circulando en la corriente sanguínea. Aquí, se muestra el mismo campo de interés 90 minutos después de la adición de PAM tres CSK cuatro, lo que provoca el reclutamiento masivo de neutrófilos y monocitos hacia la pared endotelial, que los monocitos exploran minuciosamente. Mediante el software adecuado, pueden rastrearse las trayectorias exactas de los monocitos y neutrófilos que patrullan el endotelio antes y después del inicio de la inflamación.Es importante tener en cuenta que se puede producir una pérdida de enfoque en el eje Z o un desplazamiento en XY como consecuencia de los movimientos intestinales, lo que podría arruinar el experimento. Esta técnica puede modificarse aún más utilizando diferentes modelos de ratones modificados genéticamente o inyectando anticuerpos bloqueantes o fármacos farmacéuticos para determinar el papel de moléculas específicas de interés en el comportamiento de los leucocitos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear la dinámica de los leucocitos saturados en las venas mesentéricas.

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

En este video, demostramos la visualización en tiempo real de las interacciones entre las células sanguíneas y el endotelio en las venas mesentéricas de un modelo de ratón inyectado intraperitonealmente con lipopolisacárido.

Microscopía intravital para analizar las interacciones entre células sanguíneas y endoteliales en un modelo de ratón con inflamación

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Este protocolo actual emplea reporteros fluorescentes, marcaje in vivo y técnicas de imagen intravital para permitir el monitoreo del proceso dinámico de cebado de neutrófilos en animales vivos.

Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed

El protocolo describe un novedoso modelo de cámara de ventana de fémur murino que se puede utilizar para rastrear el movimiento de las células en la médula ósea femoral in vivo. La microscopía de fluorescencia multifotónica intravital se utiliza para obtener imágenes de tres componentes de la médula ósea femoral (vasculatura, matriz de colágeno y neutrófilos) a lo largo del tiempo.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.

Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

La migración de neutrófilos se basa en la remodelación rápida y continua de la membrana plasmática en respuesta al quimioatrayente y sus interacciones con el microambiente extracelular. En este trabajo se describe un procedimiento basado en Microscopía Subcelular Intravital para investigar la dinámica de la remodelación de la membrana en neutrófilos inyectados en el oído de ratones anestesiados.

Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

Este protocolo presenta un método para inducir la lesión por isquemia-reperfusión mesentérica y visualizar trampas extracelulares (TNE) de neutrófilos en vénulas mesentéricas mediante microscopía intravital. El flujo sanguíneo en la arteria mesentérica superior se restringió durante 1 h, seguido de reperfusión, lo que permitió cuantificar directamente la adhesión leucocitaria y la NETosis.

Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

Aprenda a monitorizar neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas de ratones mediante microscopía confocal intravital. Esta técnica permite analizar la dinámica de leucocitos en condiciones de estado basal e inflamación.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Explorar más videos