Identificación de las nanopartículas de óxido de metal en muestras histológicas por Enhanced Mapeo de campo oscuro Microscopía y hiperespectrales

El objetivo general de este procedimiento es identificar nanopartículas de óxido metálico en muestras histológicas mediante microscopía de campo oscuro y mapeo hiperespectral. Esto se logra identificando primero una región de interés en una muestra de control positivo que contiene nanopartículas y capturando una imagen de campo oscuro. El segundo paso es crear una imagen hiperespectral o un cubo de datos de la región de interés utilizando la cámara hiperespectral.

A continuación, se crea una biblioteca espectral de referencia a partir del cubo de datos de control positivo, que se filtra contra un control negativo para eliminar los falsos positivos. El paso final es utilizar la biblioteca espectral de referencia para mapearla con muestras experimentales para identificar y localizar nanopartículas de la misma composición. En última instancia, la microscopía de campo oscuro mejorada y el mapeo hiperespectral se utilizan para identificar nanopartículas de óxido metálico en muestras histológicas de una manera más rápida y menos intensiva en recursos que otras técnicas como la microscopía electrónica.

Este método ofrece varias ventajas sobre las técnicas convencionales de imagen y caracterización de nanomateriales, como la microscopía electrónica. En ese sentido, la preparación de la muestra suele ser mínima y no destructiva. La adquisición y el análisis de imágenes requieren menos tiempo y dinero, y se pueden aplicar para la obtención de imágenes de nanopartículas en una variedad de matrices.

Las personas conocían el método a veces tienen dificultades porque la creación de las muestras de control positivo adecuadas y las bibliotecas espectrales de referencia es un desafío y requiere mucho tiempo. Pero una vez que se completan esos pasos iniciales, las muestras experimentales se pueden evaluar con bastante rapidez. Si bien este método puede proporcionar información sobre la penetración cutánea de las nanopartículas, también se puede aplicar a otras muestras biológicas, como el lavado broncoalveolar y los frotis de sangre, así como a muestras no biológicas, como los filtros utilizados en las evaluaciones de exposición ocupacional.

Quien demostrará esta técnica será Plar Sosa, un estudiante de medicina de mi laboratorio Begin by Plugging in y encendiendo la fuente de luz, el controlador de escenario, la cámara óptica, la cámara hiperespectral y el sistema informático. A continuación, levante la platina y el condensador a la posición de funcionamiento y aplique con cuidado de tres a cinco gotas de aceite de inmersión tipo A sobre la lente del condensador. Si se crean burbujas, limpie el aceite y vuelva a aplicarlo a la lente.

A continuación, coloque la muestra en la platina y levante lentamente el condensador hasta que el aceite de inmersión haga contacto con la parte inferior del portaobjetos. Esto se notará a través del anillo de iluminación que se ilumina rápidamente donde el aceite hace contacto con la corredera. Con el condensador en su lugar, cambie al objetivo 10 x y luego enfoque y alinee el condensador para maximizar el brillo si es necesario, ajuste las perillas de alineación del condensador para centrar el punto brillante.

Abra el software de imágenes ópticas. Enfoque la muestra con la perilla de enfoque de objetivo fino. A continuación, busque una región de interés.

Ajuste el enfoque del condensador según sea necesario para equilibrar la iluminación. Haga clic en la pestaña de configuración en la barra de menú y haga clic en el botón de captura de imagen. Para el evento de captura.

Seleccione el formato de imagen deseado y asigne un nombre de archivo a la imagen. Además, seleccione el valor de lapso de tiempo predeterminado y, finalmente, haga clic en Aceptar. A continuación, ve al menú de exposición y selecciona los ajustes de exposición que crean la imagen de mayor contraste.

Aquí, el nivel se establece en 0.0%La ganancia se establece en 2.8 decibelios y la velocidad de obturación se establece en 56 milisegundos segundos. Capture la imagen haciendo clic en el botón de imagen en la barra de menú. Cambia el objetivo a 40 x y 100 x.

Captura de imágenes con aumentos más altos, asegúrese de que la guía de luz se dirija a la cámara hiperespectral y, a continuación, abra el software de imágenes hiperespectrales para la adquisición de los cubos de datos HSI en el software, abra el microscopio hiperespectral en la barra de menú y seleccione los controles del microscopio HSI. Aquí se establece el aumento del objetivo y el camino seguro. A continuación, cambie la captura de área en la configuración y cambie el número de líneas.

En este estudio se utilizó 720 para establecer el tiempo de exposición. Aquí usamos 0,25 segundos. Deje todo lo demás por defecto y haga clic en vista previa de HSI para ver la imagen.

Observe el gráfico de intensidad resultante que representa la intensidad de la longitud de onda más alta a medida que el usuario se mueve a través del eje x del centro del campo de la cámara. Mueva el cursor para generar un contorno preciso del gráfico. Esto hará que aparezca un indicador numérico de intensidad a la izquierda.

Enfoque la imagen en función de esta vista previa ajustando el enfoque preciso del objetivo para enfocar los picos de esta imagen. A continuación, optimice la intensidad de la luz ajustando el enfoque del condensador de brillo de la fuente, o cancele la vista previa y ajuste el tiempo de exposición en el software. Haga clic en capturar y observe como cuatro nuevas ventanas con los nombres disponibles.

Lista de bandas. Zoom número uno. Aparecen el número uno, el desplazamiento y la banda RGB número uno.

Maximice la ventana de banda RGB número uno, ya que este es el cubo de datos, que se utilizará para todas las referencias futuras. ¿Derecha? Haga clic en este cubo de datos, guárdelo como un archivo tiff y haga clic en Aceptar. Haga clic con el botón derecho en la ventana de la imagen del cubo de datos y haga clic con el botón izquierdo en el espectro del perfil Z.

Cuando aparezca la ventana emergente de perfil espectral a la izquierda, haga clic en los píxeles de interés en el objetivo del cubo de datos. Los más brillantes son aquellos que se pueden identificar con confianza como representantes del material de interés. En el menú de análisis de partículas, seleccione la herramienta de filtro de partículas para identificar las partículas presentes en el cubo de datos.

En el nuevo conjunto de ventanas emergentes, el valor espectral máximo debe exceder el valor, por lo que es mayor que los píxeles de fondo, pero menor que los materiales de interés. El máximo de datos válidos es 16.000. En la ventana de la herramienta de revisión de filtros de partículas, haga clic en seleccionar todo.

A continuación, haga clic en exportar a la biblioteca espectral y asigne el nombre a su biblioteca espectral. Después de seleccionar una muestra para que sirva como control negativo, obtenga varios cubos de datos de la muestra. Con la cámara hiperespectral, se requiere al menos una, pero se pueden capturar más.

Para aumentar la selectividad con el cubo de datos de control negativo abierto, haga clic en filtrar biblioteca espectral En el menú de análisis ubicado en la barra de herramientas principal del programa, haga clic en abrir nuevo archivo y seleccione la biblioteca espectral creada anteriormente para el control positivo como archivo de entrada, haga clic en Aceptar. En la ventana de la biblioteca espectral cyto viva. Haga clic en la imagen y elija el nombre del archivo de salida para la biblioteca espectral de referencia, y haga clic en Aceptar.

A continuación, haga clic en el nombre de archivo de su cubo de datos de control negativo como imagen de origen. El software analizará la biblioteca espectral y eliminará cada espectro que coincida con cualquier espectro del cubo de datos de control negativo. Obtenga cubos de datos de las muestras experimentales con el cubo de datos experimentales abierto.

Haga clic en el menú espectral en el submenú de métodos de mapeo Abra el mapeador de ángulo espectral. Seleccione el nombre del cubo de datos experimentales en la ventana emergente y haga clic en Aceptar. Si no aparece ningún nombre de archivo, haga clic en abrir nuevo archivo y elija el cubo de datos experimental.

A continuación, haga clic en Aceptar en la ventana emergente llamada Colección de miembros finales, SAM, haga clic en importar en la barra de menú. A continuación, seleccione el archivo de la biblioteca espectral. Abra la biblioteca espectral de referencia creada anteriormente y haga clic en Aceptar.

En la nueva ventana emergente llamada Biblioteca espectral de entrada, haga clic en seleccionar todos los elementos, haga clic en Aceptar. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón en el color y seleccione. Aplicar colores predeterminados a todos, haga clic en seleccionar todo seguido de aplicar y, a continuación, elija el nombre del archivo de salida y haga clic en Aceptar.

Abra el menú de superposición en la ventana del cubo de datos y seleccione clasificación. A continuación, navegue hasta el nombre del archivo de salida y haga clic en Aceptar. En el menú de la ventana de herramientas de clase interactiva, abra el menú de opciones y seleccione las clases de combinación para crear un esquema de color unificado.

Para facilitar el análisis de los datos con otro software, seleccione un solo espectro de la lista de clases base. A continuación, seleccione todas las clases, excepto las no clasificadas, para fusionarlas en la base. A continuación, haga clic en Aceptar.

A continuación, haga clic en el color base seleccionado y todos los espectros coincidentes se mostrarán en ese color. Para obtener una imagen amática que mostrará los espectros coincidentes sobre un fondo negro, haga clic en el cuadro de colores sin clasificar, que es negro Por defecto, la ventaja más significativa de la técnica es su capacidad para identificar nanopartículas de óxido metálico en muestras histológicas mediante microscopía de campo oscuro y mapeo hiperespectral. Estas imágenes muestran este proceso utilizando muestras histológicas de piel.

Mientras que algunas partículas son fácilmente obvias en el campo oscuro, la imagen óptica, las partículas adicionales se detectan mediante imágenes hiperespectrales. Aquí se muestra tejido de piel porcina en la capa de la epidermis, que estuvo expuesto a nanopartículas de Illumina. Se encontró un grupo de nanopartículas de alto contraste depositadas sobre el estrato córneo en la capa dérmica, que fue expuesta a nanopartículas de sílice.

Se pueden ver múltiples nanopartículas de alto contraste depositadas sobre el tejido conectivo. Por último, en el tejido subcutáneo, que se expuso a las nanopartículas de Siria. Se pueden ver múltiples nanopartículas dispersas de alto contraste depositadas a lo largo de la identificación de nanopartículas de adipocitos utilizando este método.

En otras muestras de tejido como pulmón, hígado, bazo, riñones y ganglios linfáticos es posible. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar un análisis de imágenes para responder a preguntas adicionales como el recuento de partículas y la ubicación de las mismas. Ciertas consideraciones e inconvenientes, como la necesidad de controles altamente especializados y las limitaciones en la resolución de las imágenes fotónicas, deben sopesarse con las de los métodos convencionales.

Al seleccionar las técnicas analíticas más apropiadas para investigar preguntas de investigación específicas, elegimos demostrar esta aplicación en particular porque tiene el potencial de complementar la investigación actual y futura en nanotoxicología. También puede informar la investigación sobre la absorción, distribución, metabolismo y excreción de nanopartículas en todos los órganos y tejidos.