Name: Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprende a validar un modelo transgénico de ratón con expresión inducible de EGFP-KASH2 para interrumpir complejos LINC en células de Purkinje cerebelosas. Este método permite estudiar el posicionamiento nuclear con control espaciotemporal.

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Los autores agradecen al personal del núcleo Morfología e Imagen, del núcleo de Genética Molecular (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales) y del ratón Genética Core en la Universidad de Washington en St. Louis Escuela de Medicina. Los autores son apoyados por el programa de pequeñas donaciones del centro McDonnell Celular y Neurobiología Molecular, el Centro Esperanza de Trastornos Neurológicos, el Instituto Nacional del Ojo (# R01EY022632 a DH), un Instituto Oftalmológico Centro Nacional Core Grant (# P30EY002687) y un subvención sin restricciones de Investigación de Prevención de la Ceguera en el Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales.

Declaración de Ética: Procedimientos en seres animales fueron aprobadas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Washington en St. Louis. 1. Ratón Cría y Genotipado <ol><li> Raza ratones Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratones para producir Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Mientras que el resto de este protocolo se centra en el uso de la línea de Tg (PCP2-Cre) del ratón para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje en el cerebelo, un procedimiento similar puede ser seguido con cualquier otro Tg (Cre) ratón ( Figura 2A). </li><li> Realizar genotipado para identificar los cachorros que albergan ambos transgenes EGFP y Cre como se describió anteriormente 19. </li></ol> 2. Preparación de los materiales para la disección y Tissue Collection <ol><li> Preparar 100 ml de 30% de sacarosa en PBS (30 g de sacarosa / 100 ml de PBS 1x) y se almacena a -20 ° C. El día de tejido harvesting, deshielo y la carga ~ 30-35 ml de solución de sacarosa en una jeringa de 35 ml para perfusiones transcardial. </li><li> Preparar 40 ml de PFA al 4% en PBS (10 ml 16% de paraformaldehído y 30 ml de PBS). Cargar ~ de 30-35 ml de PFA al 4% en una jeringa de 35 ml para perfusiones transcardial. </li><li> Llenar una placa de cultivo tisular de 10 cm con 10 ml de PBS para la disección de tejidos. </li><li> Preparar un cóctel de ketamina / xilazina que consiste en 16 mg / ml de ketamina y 3 mg / ml de xilazina. </li><li> Preparar una solución de etanol al 70% para la disección. </li></ol> 3. La disección y Tissue Collection <ol><li> Usando una jeringa de 1 ml, inyectar 500 l de cóctel de ketamina el / xilazina por cada 25 gramos de peso corporal y esperar a ~ 15 min. Alternativamente, utilizar otro método aprobado institucionalmente sedación que es apropiado para el sistema biológico de interés. </li><li> Tras la sedación, pellizque suavemente la pata trasera para confirmar la falta de respuesta al dolor, fijar todas las patas en una bandeja de espuma de poliestireno con la cara dorsal de ladel ratón hacia abajo. </li><li> Pulverizar el abdomen con 70% de etanol y hacer una incisión desde el abdomen inferior a la parte superior de la caja torácica para obtener acceso al corazón. </li><li> Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón y de insertar la jeringa que contiene la solución de sacarosa al 30% en el ventrículo izquierdo del corazón. </li><li> Perfundir la solución a una velocidad de ~ 2 a 5 ml por min. Cuando está vacío, retire la jeringa y repita con la solución de PFA 4%. </li><li> Liberar el ratón de la bandeja de espuma de poliestireno y decapitar para acceder al cerebro. </li><li> Retire la piel alrededor de la cabeza del animal con unas pinzas y tijeras. Haga un agujero en la parte posterior del cráneo con una aguja y retire con cuidado el cráneo con tijeras y pinzas de disección. </li><li> Una vez que el cerebro es claramente accesible, utilizar pinzas para quitar el cerebelo y colocarlo en PBS. Dividir en dos el cerebelo en el plano sagital con un escalpelo y transferir a la solución de sacarosa al 30% durante la noche a 4 ° C. Nota: Para prepararson secciones de parafina, fijar el cerebelo durante la noche a 4 ° C en el 4% PFA antes de la incrustación de tejidos y seccionamiento. </li></ol> 4. Procesamiento de tejidos y Seccionamiento <ol><li> Preparar una suspensión de hielo seco y butano 2-metilo. Dejar que la temperatura del baño se equilibre durante 5 min. </li><li> Llene una criomolde con compuesto de octubre y coloque una media del cerebelo biseccionado en el molde. </li><li> Usando un microscopio de disección y un par de fórceps posición el cerebelo manera que la superficie dividida en dos partes (cerca de la línea media del cerebelo) quede hacia arriba. </li><li> Transferir el criomolde a la suspensión de hielo seco durante 5 min hasta que el compuesto OCT ha formado un sólido blanco alrededor de matriz de la muestra de tejido. Nota: la muestra congelada ahora se pueden almacenar a -20 ° C si es necesario. </li><li> Label diapositivas poli-lisina pre-tratada para la recogida de las secciones de tejido y preparar el criostato de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el fin de recoger 15 micras secciones de la cerebellum. Para recoger las secciones, póngase en contacto con atención la sección de octubre con el lado revestido de poli-lisina de la diapositiva. Para preservar la orientación de la sección, no gire la diapositiva durante este paso. </li><li> Secciones de tejido tienda a -20 ° C hasta proceder a la tinción y de imagen. </li></ol> 5. La tinción e Imagen de Cerebelo Secciones <ol><li> Preparar las siguientes soluciones antes de la tinción de tejidos: ~ 50 ml de PBS ~ 5-10 ml de PFA al 4% en PBS ~ 10-20 ml de 0,5% Triton X-100, 10% de suero de burro en PBS </li><li> Secciones de cerebelo deshielo. Es importante destacar que minimizar su exposición a cualquier fuente de luz continua e intensa para prevenir la decoloración de EGFP. </li><li> El uso de una barrera hidrofóbica lápiz, dibujar un rectángulo alrededor de las secciones de tejido. </li><li> Post-fijar las secciones con 4% PFA durante 5 min. Use suficiente líquido para cubrir toda el área delimitada por la barrera hidrofóbica (normalmente ~ 500 l). El uso de un vacío o pipeta, remover el fijador particularmente cuidado de no molestar a los cortes de tejido. </li><li> Con una pipeta, aplicar suavemente PBS sobre el portaobjetos sin molestar a las secciones de tejido. Después de 5 min utilizar el vacío o pipeta para retirar con cuidado el líquido. Repita el enjuague de PBS un total de tres veces. </li><li> Con una pipeta, aplicar cuidadosamente la dilución adecuada de anticuerpos primarios (3 l Calbindin y / o anticuerpo Nesprin2 por 900 l de solución) en 0,5% de Triton X-100, 10% de suero de burro en PBS. Incubar durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Nota: EGFP-KASH2 será visible por microscopía de fluorescencia directa sobre secciones congeladas, y no es necesario utilizar un anticuerpo anti-EGFP. Sin embargo, si se han preparado las secciones de parafina, formación de imágenes de EGFP-KASH2 requiere inmunodetección con un anticuerpo anti-EGFP. </li><li> Retire la solución de anticuerpo y enjuague con PBS tres veces. </li><li> Preparar 1: 1.000 diluciones de Alexa-Fluor anticuerpos secundarios en 0,5% Triton X-100,10% de suero de burro en PBS y almacenar en la oscuridad. </li><li> Retire con cuidado el enjuague final PBS y aplicar la dilución de anticuerpo secundario durante una hora en la oscuridad. </li><li> Retire la solución de anticuerpo secundario, aclarar y lavar la sección tres veces. Si es necesario, aplicar una mancha nuclear, tales como DAPI (~ 300 nM), durante la primera aplicación PBS. </li><li> Completamente eliminar la solución PBS de todo el tejido y el lugar ~ 5.7 l de medios de montaje en la sección de tejido. Coloque un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de la sección de tejido y dejar de lado por unos 15-30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Utilice un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros apropiados para visualizar EGFP y cualesquiera otras longitudes de onda adecuadas para los anticuerpos secundarios utilizados en los pasos 5.8 / 5.9. En rebanadas del cerebelo, utilice un objetivo 20X para ver llantas nucleares EGFP-KASH2. </li></ol>

<ol><li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins%3A+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression%3F+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li>
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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li>
<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El paso más crítico para estudiar con éxito el papel de los complejos de LINC in vivo utilizando el modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) es identificar una línea de ratones Cre adecuado (s). En efecto, si Cre está activo en otros tipos de células implicados en las vías similares, se puede complicar la interpretación de los resultados. Por lo tanto, es importante examinar las células cercanas, como se muestra aquí en las capas celulares moleculares y granulares del cerebelo (Figura 2B). Del mism...

La envoltura nuclear (NE) separa el nucleoplasma del citoplasma. Se compone de una membrana nuclear interna y externa (INM y ONM, respectivamente) que se conectan en los poros nucleares. El lumen delimitado por ambas membranas se llama el espacio perinuclear (PNS). La ONM es una extensión del retículo endoplásmico rugoso (ER), y el INM se adhiere a la lámina nuclear, una malla de tipo nuclear-V filamentos intermedios representado por A y de tipo B laminas 1,2. Enlazadores de los complejos Citoesqueleto (LINC) nucleoesqueleto y son conjuntos macromoleculares que abarcan toda la envoltura nuclear para conectar físicamente el interior del núcleo a los filamentos del citoesqueleto y motores moleculares (Figura 1a). Se componen de interacciones entre evolutivamente conservados motivos que caracterizan a dos familias de proteínas transmembrana integrales de la NE: Sol (sad1 / Unc84) proteínas y Nesprins (Nuclear Sobre SPectRINS). En los mamíferos, Sun1 y Sun2 arproteínas transmembrana e del INM cuyo N-terminal nucleoplasmic región interactúa directamente con A y laminas de tipo B 3-5. En el otro lado del INM, dentro del PNS, las proteínas Sun Harbor un estiramiento-evolutiva conservada de ~ 150 aminoácidos C-terminal llamado el dominio dom Dominios SUN interactúan directamente con la KASH-evolutiva conservada (Klarsicht / ANC-1, Syne homología) de dominio, la firma molecular de Nesprins. KASH dominios consisten en un tramo de ~ 30 aminoácidos C-terminal que sobresale en el PNS seguido por un dominio transmembrana 6. Al menos cuatro genes nesprin distintas (Nesprin1-4) codifican KASH contienen proteínas que se localizan en el NE 7. Las regiones citoplasmáticas de Nesprins, cuyos tamaños varían de ~ 50 kDa (Nesprin4) a un sorprendente 1.000 kDa (gigante Nesprin1), contienen múltiples espectrina repite, así como los motivos específicos que permite su interacción con los componentes del citoesqueleto, tales como actina, plectina y motores moleculares 8- 13. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Estudios en vertebrados e invertebrados han mostrado que Lamin / Sun / nesprin / motores moleculares constituyen un &quot;eje&quot; conservadas evolutivamente controlar la migración nuclear y anclaje. Varios knock-out (KO) modelos de ratón de componentes complejos LINC se han descrito y fueron fundamentales en la prestación de un marco para comprender las funciones de las proteínas Sol y nesprin en el NE durante el desarrollo de los mamíferos 9,14,15. Sin embargo, estos modelos presentan varios inconvenientes significativos, sobre todo: 1) de dificultad en la interpretación de los fenotipos debido a la celda efectos no autónomos, 2) la dificultad para distinguir las contribuciones fenotípicas de KASH contienen vs. KASH menos nesprin isoformas 16, 3) la redundancia funcional de las proteínas Sun y nesprin en el NE en numerosos tipos de células requiere esquemas de mejoramiento complejos para inactivar todas las interacciones dom-KASH en ratones 17 y 4) la letalidad perinatal de ratones deficientes para el KASH-dominio de ambosNesprins1 y 2 impide el análisis de adultos fenotipos 18. Este protocolo describe un modelo de ratón novedoso diseñado para interrumpir todas las interacciones dom-KASH in vivo, en una célula de manera autónoma y regulado por el desarrollo, evitando así muchos de los inconvenientes descritos anteriormente. Este / modelo de ratón basada en lox Cre se basa en dos conceptos importantes: 1) el dominio KASH de cualquier proteína nesprin conocido es suficiente para dirigir EGFP a la NE en sistemas de cultivo celular y 2) dominios SUN interactuar promiscuamente con dominios Kash, por tanto, la sobreexpresión de cualquier dominio KASH saturará todos los dominios SUN endógenos e inactivar complejos LINC de una manera dominante negativo 17 (Figura 1B). Este protocolo describe la cosecha de tejidos y etapas de procesamiento utilizadas para confirmar la interrupción de todas las interacciones dom-KASH en las células de Purkinje del cerebelo.

<table><tbody><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Solución de paraformaldehído</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compuesto</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de adhesión</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pluma</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Calbindina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-EGFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo</td><td></td><td></td> Anti-Nesprin2 <td>Descrito anteriormente en Ref. 21</td></tr><tr><td>Montaje fluorescente Medios</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

validación de un modelo de ratón para interrumpir linc complejos en una celda de manera específica

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

La migración nuclear y el anclaje dentro de los tejidos en desarrollo y adultos dependen en gran medida de grandes ensamblajes de proteínas macromoleculares llamados LInkers del Nucleoesqueleto y Citoesqueleto (complejos LINC). Estos andamios de proteínas abarcan la envoltura nuclear y conectan el interior del núcleo con los componentes del citoesqueleto citoplasmático circundante. Los complejos LINC consisten en dos familias de proteínas conservadas evolutivamente, las proteínas Sun y las Nesprins, que albergan motivos de firma molecular C-terminal llamados dominios SUN y KASH, respectivamente. Las proteínas Sun son proteínas transmembrana de la membrana nuclear interna cuyo dominio nucleoplasmático N-terminal interactúa con la lámina nuclear, mientras que sus dominios SUN C-terminal sobresalen en el espacio perinuclear e interactúan con el dominio KASH de Nesprins. Las isoformas canónicas de Nesprin tienen un N-terminal de tamaño variable que se proyecta en el citoplasma e interactúa con los componentes del citoesqueleto. Este protocolo describe la validación de una estrategia de ratón transgénico dominante-negativo que interrumpe las interacciones endógenas SUN/KASH de una manera específica para cada tipo de célula. Nuestro enfoque se basa en el sistema Cre/Lox que evita muchos inconvenientes, como la letalidad perinatal y los fenotipos celulares no autónomos que se asocian con modelos de línea germinal de inactivación del complejo LINC. Por esta razón, este modelo proporciona una herramienta útil para comprender el papel de los complejos LINC durante el desarrollo y la homeostasis en una amplia gama de tejidos.

Este protocolo ilustra la utilidad de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modelo de ratón Tg para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje del cerebelo utilizando TG (PCP2-CRE) ratones. En Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) descendencia, el marco de lectura abierto LacZ / V5 se escinde en P6 por la Cre recombinasa lo que conduce a la expresión de EGFP-KASH2 dirigida específicamente a las células de Purkinje (Figura 2A). Como era de esperar, EGFP-KASH2 está dirigido a la envoltura nuclear c...

Las proteínas de la envoltura nuclear juegan un papel central en muchos procesos biológicos básicos y han sido implicadas en una variedad de enfermedades humanas. Este protocolo describe un nuevo modelo de ratón basado en Cre/Lox que permite el control espacio-temporal de la interrupción de los complejos LINC.

Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

El objetivo general de este experimento es ilustrar la utilidad de un modelo de ratón transgénico, que permite la expresión inducible y dirigida de una proteína EGFP marcada con fluorescencia, la caché dos péptidos in vivo, y la consiguiente alteración de los complejos de enlace endógenos. En este experimento, la expresión de la caché dos marcada con fluorescencia se dirigirá a las células de Purkinje cerebelosas. Este enfoque genético puede responder preguntas clave sobre el papel de los complejos de enlace en la posición nuclear dentro de diferentes tejidos.La expresión inducible y dirigida de E-G-F-P-K dos tiene varias ventajas. En primer lugar, requiere un único esquema de cruza de ratones cay con cualquier cepa cruise existente. En segundo lugar, este enfoque evita la letalidad perinatal observada en modelos de ratón con mutaciones en la línea germinal de componentes del complejo link.Por último, este método permite estudiar la fisiología de los complejos de enlace dentro de células o tejidos específicos in vivo. Chloe Potter, un miembro del laboratorio, les mostrará los diferentes pasos necesarios para visualizar E-G-F-P-K dos en células de Purkinje cerebelosas.Para comenzar,

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe un procedimiento para la eliminación del gen diana utilizando un sistema de Cre-recombinasa inducible por tamoxifeno después de la inyección intraperitoneal de tamoxifeno en un modelo de ratón.

Inactivación de genes diana basada en el sistema CreER-LoxP: un sistema de recombinasa Cre inducible por tamoxifeno para la eliminación de genes diana en un modelo de ratón

Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar...

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

Nucleasas de diseñadores como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se pueden utilizar para modificar el genoma de preimplantación de embriones de ratones mediante la activación de ambos al final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) itinerarios. Estos avances permiten la rápida generación de ratones con modificaciones genéticas precisas.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

Las células madre epiteliales intestinales (ISCS) se entremezclan con las células de Paneth. Estas células se diferencian progenie del ISC, que apoyan el ISC y proporcionar protección antibacteriana. Aquí se demuestra la forma en que utilizamos modelos de ratones transgénicos condicionales para establecer que las células de Paneth juegan un papel crucial en el mantenimiento de los epitelios intestinales.

Los protocolos para analizar el papel de las células de Paneth en Regeneración del Murino Intestino utilizando condicional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Ratón Modelos

Funciones célula Autónoma de genes en el cerebro pueden ser estudiadas mediante la inducción de la pérdida o ganan de función en poblaciones dispersas de las células. Aquí, describimos en el útero la electroporación para entregar recombinase de Cre en poblaciones escasas de desarrollo de las neuronas corticales con genes floxed a causar la pérdida de función en vivo.

Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

Como las variantes genéticas asociadas con enfermedades humanas empiezan a ser descubierto, se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo de sistemas con los que evaluar rápidamente la importancia biológica de las variantes identificadas. Este protocolo describe los métodos para evaluar la función del gen humano durante la meiosis femenina utilizando ovocitos de ratón.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Aquí describimos un protocolo para generar un modelo murino femenino viable con inactivación cromosómica no aleatoria, es decir, el cromosoma X de herencia maternalmente está inactivo en el 100% de las células. También describimos un protocolo para probar la viabilidad, la tolerabilidad y la seguridad de la reactivación farmacológica del cromosoma X inactivo in vivo.

Un modelo de ratón no aleatorio para la reactivación farmacológica de Mecp2 en el cromosoma X inactivo

Aquí describimos un método específico en el tiempo para manipular eficazmente las vías críticas de desarrollo en la placenta del ratón in vivo. Esto se realiza mediante la inyección y electroporación de plásmidos CRISPR en las placentas de madres embarazadas en el día embrionario 12.5.

Manipulación CRISPR placentaria dirigida a ratones en vivo

Aprende a validar un modelo transgénico de ratón con expresión inducible de EGFP-KASH2 para interrumpir complejos LINC en células de Purkinje cerebelosas. Este método permite estudiar el posicionamiento nuclear con control espaciotemporal.

Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

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