Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

El objetivo general de este experimento es ilustrar la utilidad de un modelo de ratón transgénico, que permite la expresión inducible y dirigida de una caché de EGFP marcada con fluorescencia, dos péptidos in vivo, y la consiguiente interrupción de los complejos de enlaces endógenos. En este experimento, la expresión de la caché dos marcada con fluorescencia se dirigirá a las células Perkin cerebelosas. Este enfoque genético puede abordar preguntas clave sobre el papel de los complejos de enlace en el posicionamiento nuclear dentro de la mayoría de los tejidos.

La expresión inducible y dirigida de E-G-F-P-K two tiene varias ventajas. En primer lugar, requiere un único esquema de cría de ratones de cayo con cualquier cepa de crucero existente. En segundo lugar, este enfoque pasa por alto la natalidad observada en modelos de ratón de mutaciones de la línea germinal de componentes complejos de enlace.

Finalmente, este método permite estudiar la fisiología de los complejos de enlace dentro de células o tejidos específicos. In vivo. Chloe Potter, miembro del laboratorio, le mostrará los diferentes pasos necesarios para visualizar E-G-F-P-K dos en células G de Burkin cerebelosas.

Para empezar, se crían ratones clac Z con PCP, dos ratones CRE para producir PCP, dos ratones CAG C, dos como se describe en publicaciones anteriores. Cuando nazcan las crías resultantes, realice el genotipado. Para identificar a los portadores de transgenes EGFP y Cree como se describió anteriormente, prepare 50 mililitros de una solución de sacarosa al 30% en PBS y almacene a menos 20 grados Celsius hasta el día de la recolección de tejido a la edad adecuada, realice una perfusión trans cardio de los ratones bajo anestesia con el fin de preparar el tejido cerebral para la disección como se describe en el protocolo escrito, colocar el cerebro disecado en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros con 10 mililitros de PBS y separar el cerebelo de la cerebra.

A continuación, utilice un bisturí para diseccionar el cerebelo en el plano sagital y transfiera las secciones a una solución de sacarosa al 30% y guárdela a cuatro grados centígrados durante la noche. Prepara una suspensión de hielo seco y dos metil butano. Deje que la temperatura del baño se equilibre durante cinco minutos.

A continuación, llene un molde criogénico con compuesto OCT y coloque la mitad del cerebelo disecado en el molde utilizando un microscopio de disección y un par de pinzas. Coloque el cerebelo de modo que la superficie biseccionada que está cerca de la línea media del cerebelo quede hacia arriba en el molde. A continuación, transfiera el molde criogénico a la lechada de ojo seco durante cinco minutos hasta que el compuesto OCT haya formado una matriz blanca sólida alrededor de la muestra de tejido.

Guarde la muestra incrustada a menos 20 grados centígrados hasta que la necesite. Etiquete los portaobjetos de polilisina pretratados para recoger secciones de tejido y monte el bloque de tejidos cerebelosos en el soporte de tejido con OCT fresco. Una vez que el bloque esté firmemente sujeto, monte el soporte de pañuelo y corte rodajas de 40 micrómetros para eliminar el exceso de OCT hasta llegar al tejido.

Establezca el grosor en 15 micrómetros y recoja las secciones contactando cuidadosamente la sección OCT con el lado recubierto de polilisina del portaobjetos. Guarde las secciones de tejido a menos 20 grados centígrados hasta que proceda con la tinción y la toma de imágenes. Cuando esté listo para continuar, descongele las secciones cerebelosas en la oscuridad para evitar el desvanecimiento de las proteínas fluorescentes.

Con un bolígrafo de barrera hidrofóbico, dibuje un rectángulo alrededor del perímetro de las secciones de tejido. Agregue alrededor de 500 microlitros de aldehído paraformado al 4% a las secciones durante cinco minutos para fijar el tejido. A continuación, utilice una aspiradora para aspirar el fijador, teniendo especial cuidado de no alterar las secciones de tejido con una pipeta.

Aplique suavemente PBS en el portaobjetos sin alterar las secciones de tejido. Después de cinco minutos, use la pipeta de vacío más para eliminar con cuidado el líquido, repita el enjuague de PBS un total de tres veces. A continuación, añada unos 500 microlitros de solución de bloqueo a los portaobjetos e incube durante 10 minutos.

Retire y luego reemplace la solución de bloqueo con la misma solución que contenga de una a 300 diluciones de anticuerpos de unión a cal o nesina dos. A continuación, retire la solución de anticuerpos y enjuague los portaobjetos con PB S3 varias veces. Incube los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.

A continuación, prepare una dilución de uno a 1000 de Alexa anti-US floor 5 94 para los portaobjetos etiquetados para la unión de vacas y anti Alexa Fluor 5 94 para el Nesprin dos portaobjetos etiquetados en la solución de bloqueo y almacene las soluciones en la oscuridad hasta que se necesiten. Retire suavemente el último enjuague de PBS y cubra las secciones con los anticuerpos secundarios diluidos durante una hora en la oscuridad. Después de la incubación, retire la solución de anticuerpos secundarios.

A continuación, aplique una tinción nuclear como DPI a 300 nanomolares en PBS durante cinco minutos. Después, enjuague las secciones dos veces más en PBS. Retire la mayor cantidad posible de solución de PBS y cubra la sección de tejido con una gota de medio de montaje.

Coloque una cubierta de vidrio en la parte superior de la sección de pañuelos, evitando las burbujas de aire, y déjela reposar durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, utilice un microscopio fluorescente para visualizar la tinción de anticuerpos y las proteínas fluorescentes. Para las rebanadas cerebelosas, use un objetivo de 20 x o 40 x.

Para ver los dos bordes nucleares E-G-F-P-C como se muestra aquí, los dos E-G-F-P-C dos se pueden visualizar directamente en cortes cerebelosos en el canal de Fitzy. Además, la colocalización de EGFP con la unión de vacas, que marca específicamente las células de Perkin, confirma que la expresión de E-G-F-P-C dos se limita a las células de Perkin dentro de las células de Perkin. La caché dos de EGFP se dirige a la envoltura nuclear, como lo indican los patrones de tipo RIM positivos de EGFP observados alrededor del núcleo.

En este ejemplo, se detectó la expresión de caché dos de EGFP en más del 70% de las células Perkin positivas que se unieron a vacas. La caché EGFP dos desplaza a la nesprina endógena de la envoltura nuclear a través de la saturación de los dominios solares disponibles. En consecuencia, la NESIN endógena dos se desplaza de la envoltura nuclear de las células Perkin que expresan la caché EGFP dos.

Mientras que las células Perkin que no expresan E-G-F-P-C dos retienen la nesina endógena dos en la envoltura nuclear como se esperaba en el control interfier, las que no expresan CRE recombinasa muestran NESIN dos en la envoltura nuclear de toda la población de células bikini Uno. Por lo tanto, se dispone de bloques de tejidos por TC. E-G-F-P-K dos se puede visualizar en unas cuatro horas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el grado de fijación de PFF y/o las condiciones de inclusión pueden afectar drásticamente la antigenicidad de su epítopo. Por lo tanto, es muy importante determinar las condiciones óptimas de fijación que preserven su epítopo específico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el modelo de ratón transgénico CK dos para dirigir la expresión del anacardo VGFP a tejidos específicos.