2.8: Diferenciación y cultivo de células madre embrionarias

Las células madre embrionarias, o células ES, tienen una serie de propiedades únicas que las distinguen de las células adultas normales. Por lo tanto, los científicos han ideado técnicas especiales de cultivo para mantener o aprovechar estas propiedades. Cuando se cultivan correctamente, las células madre embrionarias pueden dividirse indefinidamente para producir más de sí mismas. Al mismo tiempo, al alterar las condiciones de cultivo, las células madre embrionarias pueden ser dirigidas a diferenciarse en casi cualquier tipo de célula que se encuentre en nuestro cuerpo; esta capacidad de las células madre embrionarias se denomina "pluripotencia".

En este video, aprenderá cómo cultivar y pasar las células madre embrionarias para que mantengan sus propiedades únicas, cómo inducir la diferenciación en las células madre embrionarias para formar tipos específicos de células y las formas en que los investigadores utilizan y refinan las técnicas de cultivo y diferenciación de células madre embrionarias en la actualidad.

Antes de entrar en detalles de los procedimientos para el mantenimiento de las células madre embrionarias, es importante comprender primero qué impide o impulsa la diferenciación de las células madre embrionarias. Para que las células madre embrionarias conserven sus propiedades únicas de pluripotencia y autorrenovación, deben cultivarse con factores específicos en su medio de crecimiento que supriman la diferenciación espontánea.

Esto se hace más comúnmente mediante el cultivo de células madre embrionarias en una capa de "alimentadores", generalmente fibroblastos embrionarios de ratón, o MEF. Las células alimentadoras "alimentan" a las células madre embrionarias con ciertos factores, como la activina A, que ayudan a mantener las células madre embrionarias en su estado indiferenciado.

Recientemente, los científicos también han desarrollado métodos de cultivo sin alimentadores en los que las células madre embrionarias se cultivan en medios con los factores necesarios añadidos en una receta definida. Este enfoque reduce la variabilidad y elimina el componente no humano de los cultivos de células madre embrionarias, lo cual es un requisito previo para las aplicaciones clínicas.

Otra característica de las células madre embrionarias es que crecen naturalmente en grupos o colonias, y tienden a tener una baja tasa de supervivencia cuando se disocian en células individuales, especialmente las células madre embrionarias humanas. Como resultado, el paso de las células madre embrionarias humanas generalmente requiere retenerlas en grupos intactos a través de una "selección" mecánica.

Cuando las células madre embrionarias se cultivan en condiciones no adherentes, forman agregados 3D conocidos como cuerpos embrioides, o EB, en los que las células madre embrionarias se diferenciarán en todos los diferentes tipos de células. Al variar las condiciones de diferenciación, como la adición de factores de crecimiento específicos al medio, los científicos están desarrollando métodos para dirigir la diferenciación de células madre embrionarias en tipos de células específicas.

Ahora que comprende los principios detrás del mantenimiento y la diferenciación de las células madre embrionarias, veamos cómo cultivar y pasar células madre embrionarias en alimentadores MEF.

Los MEF se obtienen de embriones de ratón en etapa temprana y luego se inactivan mediante productos químicos o radiación para evitar que se dividan más. Los MEFs inactivados deben colocarse en placas de cultivo de tejidos gelatinizados al menos un día antes de comenzar el cultivo de células madre embrionarias. Cuando los comederos están completamente asentados, las células madre embrionarias se descongelan y se siembran en las placas.

En los próximos días, las células madre embrionarias se convertirán en grandes colonias. Antes de que las colonias comiencen a tocarse y fusionarse, se debe pasar el cultivo ES. Se debe observar la morfología de las células madre embrionarias para ver si muestran signos de diferenciación. Las colonias de ES indiferenciadas generalmente se ven bien definidas y homogéneas, mientras que las células diferenciadas se verían como "adoquines" opacos de forma irregular.

Si las colonias muestran un 70% o más de diferenciación, o si son escasas, corte mecánicamente las colonias indiferenciadas y transfiérelas a una nueva placa de alimentación. De lo contrario, simplemente elimine las áreas o colonias diferenciadas y proceda con el paseo.

Una vez que se han limpiado las colonias diferenciadas, se agregan enzimas proteolíticas, como la colagenasa, para levantar las células de la placa con incubación a los 37? C durante el tiempo adecuado. A continuación, se añaden medios ES frescos para detener las reacciones enzimáticas. Las colonias se desalojan mecánicamente de la placa y se transfieren a un tubo de centrífuga, donde se dividen en los tamaños deseados con un pipeteo suave. Las células madre embrionarias se recogen por centrifugación, se resuspenden en medios madre embrionarias y se colocan en las placas de alimentación preparadas.

Después de aprender cómo pasar las células madre embrionarias, echemos un vistazo a una de las técnicas más comunes utilizadas para diferenciar las células madre embrionarias en cuerpos embrioides: el método de la gota colgante.

Para empezar, las células madre embrionarias se separan con la ayuda de enzimas proteolíticas como la colagenasa y se diluyen hasta la concentración deseada en medios que contienen factores de diferenciación específicos del linaje. A continuación, la suspensión de células madre embrionarias se deposita en gotas sobre la tapa de una placa de Petri bacteriana. La tapa se invierte rápidamente y se coloca en el plato, por lo que las gotas de medio colgarán boca abajo y permitirán que se desarrollen los cuerpos embrioides.

Después de unos dos días, las gotas con EB se pueden recoger y colocar en placas no adherentes para su posterior cultivo. En el momento adecuado para el linaje celular deseado, los cuerpos embrioides se vuelven a colocar en placas de cultivo de tejidos adherentes gelatinizados para una mayor diferenciación.

Ahora que hemos cubierto las técnicas básicas de cultivo y diferenciación de células madre embrionarias, veamos cómo se adaptan a las necesidades experimentales específicas.

Como se mencionó anteriormente, las células madre embrionarias se pueden dirigir para diferenciarse en tipos específicos de células en diferentes condiciones de cultivo. En este experimento, los científicos produjeron neuronas motoras a partir de células madre embrionarias humanas. Esto se hizo primero agregando factores para diferenciar los cuerpos embrioides que los dirigen hacia el linaje neuronal, seguido de productos químicos y condiciones de recubrimiento que convierten a estas células específicamente en neuronas motoras. Utilizando enfoques similares, los investigadores han logrado diferenciar las células madre embrionarias en células del músculo cardíaco que laten rítmicamente.

Debido a que las células madre embrionarias diferenciadas imitan los eventos que ocurren a medida que los embriones se desarrollan naturalmente, también podemos usarlas para investigar la biología del desarrollo embrionario temprano. Uno de los fenómenos que se están estudiando es la inactivación del cromosoma X, o XCI, el proceso crucial por el cual uno de los dos cromosomas X se silencia en cada célula de un mamífero hembra. Al visualizar la distribución de ARN y proteínas específicas en los EB en desarrollo, los científicos han obtenido valiosos conocimientos sobre la biología de XCI.

Finalmente, para aumentar la consistencia y la eficiencia de la experimentación con células madre embrionarias, los científicos están continuamente tratando de idear mejores técnicas para cultivar células madre embrionarias. Un enfoque consiste en cultivar células madre embrionarias en una sola capa, lo que se denomina cultivo monocapa de tipo no colonia o NCM.

¿Recuerda que las células madre embrionarias humanas tienden a ser infelices cuando no están creciendo como agregados 3D? Los científicos han demostrado que las sustancias químicas conocidas como inhibidores de ROCK aumentan la supervivencia de las células madre embrionarias disociadas, lo que les permite ser conducidas como suspensiones unicelulares y ser cubiertas a alta densidad. La ventaja de la técnica NCM es que cada célula estará expuesta de manera más equitativa a los factores de crecimiento y nutrientes en el medio, lo que reduce la heterogeneidad dentro del cultivo y facilita el crecimiento de células madre embrionarias en grandes cantidades.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre cómo cultivar y diferenciar células madre embrionarias. Ahora debería saber qué factores son importantes para mantener las células madre embrionarias en su estado indiferenciado y cómo podemos aprovechar la pluripotencia de las células madre embrionarias para generar tipos específicos de células en una placa. En el futuro, los científicos trabajarán para desarrollar condiciones de cultivo y diferenciación más eficientes y bien definidas para producir tipos de células especializadas que puedan usarse en aplicaciones de medicina regenerativa. ¡Gracias por mirar!