Name: Análisis preparación y fotoacústica de Vehículos celulares que contienen oro Nanorods (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprende a preparar vehículos celulares con nanorods de oro para imagen fotoacústica de tumores usando macrófagos asociados a tumores. Este método mejora la estabilidad óptica y la entrega dirigida de agentes de contraste.

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Este trabajo fue parcialmente apoyado por la Región Toscana y la Comunidad Europea en el marco de la burbuja ERA-NET + Proyectos LUS y BI-TRE.

Nota: Todas las concentraciones de oro nanorods se expresan en términos de molaridad Au nominales. Para la comparación con otras obras, tenga en cuenta que 1 M Au corresponde aproximadamente a 20 M nanobastones de oro, en nuestro caso. 1. Preparación de Oro catiónico Nanorods Nota: El método comienza con la síntesis de bromuro de cetrimonio (CTAB) -capped nanorods de oro por la reducción autocatalítica de HAuCl4 con ácido ascórbico, de acuerdo con el protocolo establecido por Nikoobakht et al 25 y adaptado según Ratto et al 26... Entonces estos nanorods de oro se modificaron con el fin de ganar más biocompatibilidad y afinidad por las membranas plasmáticas, por la combinación de polietilenglicol hebras 10, 11, 27, 28 y 22 compuestos de amonio cuaternario. <ol><li> Purificar 24 ml nanobastones oro coronadas de CTAB en una concentration de 450 M Au mediante dos ciclos de centrifugación (12.000 xg, 30 min) y decantación. Asegúrese de que la relación del volumen muerto al volumen inicial es de alrededor de 1/200 o más bajo de todos los pasos de centrifugación en este protocolo. Utilice CTAB 500 M acuosa como una solución de lavado y, finalmente, transferir las partículas en tampón de acetato de 6 ml 100 mM a pH 5 que contiene 500 mM CTAB y polisorbato 20 0,005% (v / v). </li><li> Añadir 30 l 10 mM acuoso alfa-metoxi-omega-mercapto-poli (etileno glicol) (MW ~ 5000) y dejar reaccionar durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Añadir 30 l de 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N bromuro de trimetilamonio en dimetilsulfóxido y dejar en reposo durante 24 horas a 37 ° C. </li><li> A continuación, añadir 18 ml 0,005% (v / v) de polisorbato 20 en agua y purificar estas partículas de cuatro ciclos de centrifugación (12.000 xg, 30 min) y decantación. Utilice 0,005% (v / v) de polisorbato 20 en agua como solución de lavado y, finalmente, transferir las partículas en 2,4 ml de PBS estéril a pH7.4. La concentración nominal final del oro es de 4,5 mm. </li></ol> 2. La carga de macrófagos murinos con oro Nanorods <ol><li> Utilice la línea celular de monocitos / macrofágica J774A.1 y DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, glutamina 1 mM, 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina como medio de cultivo. Placa de 5 x 10 5 células en cuatro placas de Petri de 60 mm de diámetro y les permiten crecer durante 24 horas, a fin de ser subconfluentes en el momento de la separación (véase el paso 2.2). <ol><li> Durante todo el protocolo, mantener las células bajo condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% de CO 2, 95% de aire y 100% de humedad relativa). Utilizar una cabina de flujo laminar y equipo de protección personal adecuado para manipular las células. </li></ol></li><li> Después de 24 horas, cargar las células con nanobastones oro catiónicos y prepararlos para ser embebido en películas de quitosano: <ol><li> Con el fin de permitir que las partículas sean absorbidos por las células, añadir una alícuota de 4,5Au mM nanobastones oro catiónico en PBS a cada placa de Petri, con el fin de lograr una concentración final de 100 mM de Au. Deje las placas de Petri en la incubación durante 24 horas. </li><li> A continuación, observar las células bajo un microscopio óptico para confirmar sus buenas condiciones y la carga. Las células deben exhibir su morfología normal y un número de vesículas intracelulares oscuros. Separar las células por un rascador, fusionar los de dos placas de Petri, con el fin de lograr una cantidad adecuada de células para los siguientes pasos (al menos 2 x 10 6 células), y centrifúguelas (120 xg, 6 min) para eliminar cualquier el exceso de oro nanorods catiónicos. El sedimento celular debería ser casi negro. </li><li> Suspender el sedimento en 2 ml de PBS y contar las células por el uso de una cámara de Bürker. Centrifugar una suspensión que contiene 2 x 10 6 células (120 xg, 6 min) y fijar su sedimento en 2 ml 3,6% (w / v) de formaldehído en PBS durante diez minutos a temperatura ambiente. Por último, lavar esta pastilla tres veces por centrifugation (120 xg, 6 min) con el fin de eliminar el fijador. Utilice PBS como solución de lavado. </li></ol></li></ol> 3. Integración de los macrófagos en quitosano Films Nota: Las propiedades peculiares de quitosano 26, 27, 28, 29 son explotados para producir fantasmas biomiméticos que contienen macrófagos teñidos con oro nanorods catiónicos. Con respecto a otros hidrogeles tales como agarosa, quitosán permite películas que son mucho más fuertes y más delgada, lo cual es crítico para la PA 6 microscopía. La fabricación de estos fantasmas se lleva a cabo de acuerdo con protocolos anteriores 29, 30, 31, con algunas modificaciones como se prescribe en las siguientes 30. <ol><li> Preparar un acidificada (pH 4,5, que se obtiene por la adición de ácido acético) y viscoso 3% (w / v) de quitosano de bajo peso molecular (PM medio 120 kDa) solución, mezclar bien ydejar que homogeneizar durante 24 horas a 40 ° C. </li><li> A continuación, la mezcla macrófagos murinos contienen nanorods oro catiónico (2 x 10 6 células) con 500 l de solución de quitosano. </li><li> Con el fin de obtener ~ 50 micras de espesor fantasmas, verter 250 mg de la mezcla en 1,91 cm 2 moldes de poliestireno y dejarlos bajo una corriente de nitrógeno durante 24 hr. Después de ello, el tratamiento de estas muestras con NaOH 500 l 1 M, con el fin de inducir la reticulación, y enjuague con 10 ml de agua ultrapura. </li></ol> 4. Prueba de la estabilidad de fotoacústica Conversión Nota: La estabilidad de la conversión PA se investigó por medio de experimentos de PA con la configuración de fabricación casera que se describe en la referencia 6. <ol><li> Suspender una película de quitosano que contiene los macrófagos en agua DI, por ejemplo por el uso de un soporte de plástico sumergida en una placa de Petri, a fin de mantener una distancia de ~ 5 mm desde la parte inferior de la placa. Ponga esta placa en una etapa XY micrométricocon el fin de controlar la posición de la muestra. </li><li> Enfocar un haz láser con ~ 5 duración nseg pulso en resonancia con la banda plasmónica longitudinal de los nanorods de oro (por ejemplo, a partir de un oscilador paramétrico óptico bombeado por el tercer armónico de un Q-switched Nd: YAG con la gama de longitud de onda de 400 - 2500 nm y duración del pulso de 5 nseg) perpendicular a la superficie de la película con un diámetro de punto ~ 300 micras. <ol><li> Colocar un atenuador en frente de la salida de láser para sintonizar la fluencia del láser y el uso de un divisor de haz para enfocar parte del haz de láser a un contador de energía (por ejemplo, un detector piroeléctrico) y controlar las fluctuaciones de fluencia. Mantener la fluencia óptica por debajo de ~ 1 mJ / cm 2 por impulso durante la alineación. Utilizar gafas de seguridad del láser adecuada cada vez que el láser está encendido. </li></ol></li><li> Sumergir un transductor de ultrasonidos (rango de frecuencia de 1 - 20 MHz) en la placa de Petri ~ 2 mm fuera de la superficie de la película y ajustar su posición mediante el uso de traducciones micrométricasy las etapas de rotación para maximizar la señal emitida PA de la película. </li><li> Determinar una fluencia sonda F LO que no dañe la muestra 6: <ol><li> Irradiar un punto de la muestra aleatoria a una fluencia alrededor de 1 mJ / cm 2 por impulso durante por lo menos 500 pulsos. Para cada pulso, adquirir la señal PA correspondiente del transductor de ultrasonidos y fluencia del láser desde el contador de energía con un osciloscopio. Nombrar la fluencia de la media, como prueba F LO. </li><li> Calcular la intensidad de la señal de PA como su amplitud de pico a pico como una función del número de impulsos. Con el fin de contrapeso las fluctuaciones de intensidad de láser, normalizar la amplitud de cada señal de PA a la relación de su propia influencia a juicio F LO. Analizar la tendencia de la intensidad de PA normalizado como una función del número de impulsos y verificar su estabilidad en el tiempo. </li><li> En el caso de inestabilidad, repita los pasos 4.4.1 a 4.4.3 con un menor valor de F LO <sarriba&gt; juicio. En el caso de la estabilidad, repetirlas con un valor de ensayo F LO superior en ~ 10%, hasta una pérdida de estabilidad surge. Ajuste la sonda de fluencia F LO como el segundo valor más alto de la prueba F LO que garantice la estabilidad. </li></ol></li><li> Medir una fluencia de umbral de la remodelación: <ol><li> Elegir otro punto de la muestra aleatoria y la sonda una intensidad media PA (I LO a) a más de 500 pulsos a F LO. </li><li> Establecer una fluencia nominal superior F LO y entregar 50 pulsos. Nombrar a su fluencia promedio como F exc. </li><li> Sondear una intensidad media PA (I LO b) a más de 500 pulsos a F LO una vez más. Se calcula la relación R = I LO b / I LO a. Un valor de R inferior a la unidad da evidencia de un cambio irreversible de las propiedades ópticas de la muestra. </li><li> Usar la plataforma XY micrométrico para mover la película y cambiar el point de la muestra al azar. Repita los pasos 4.5.1 a 4.5.4 con diferentes valores de F exc, a fin de tener unos valores de R por debajo, alrededor y encima de la unidad. 15 puntos son razonables. </li><li> Parcela R como una función de F exc e identificar el umbral de remodelación de fluencia F TH como que el valor cuando R comienza a diferir de un más allá de incertidumbre estadística. 6 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+as+new+nanochromophores+for+photothermal+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies.</a> J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).</li>
<li>Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+golden+age%3A+gold+nanoparticles+for+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The golden age: gold nanoparticles for biomedicine.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 2740-2779 (2012).</li>
<li>Hahn, M. A., Singh, A. K., Sharma, P., Brown, S. C., Moudgil, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+Contrast+Agents+for+in-Vivo+Bioimaging%3A+Current+Status+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as Contrast Agents for in-Vivo Bioimaging: Current Status and Future Perspectives.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399 (1), 3-27 (2011).</li>
<li>Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+gold+nanoparticles+in+targeted+cancer+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery.</a> Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).</li>
<li>Manohar, S., Ungureanu, C., Van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+as+molecular+contrast+agents+in+photoacoustic+imaging%3A+The+promises+and+the+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods as molecular contrast agents in photoacoustic imaging: The promises and the caveats.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 6 (5), 389-400 (2011).</li>
<li>Cavigli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+Affects+the+Stability+of+the+Photoacoustic+Conversion+of+Gold+Nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Size Affects the Stability of the Photoacoustic Conversion of Gold Nanorods.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (29), 16140-16146 (2014).</li>
<li>Chen, L. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+photoacoustic+stability+of+gold+nanorods+by+silica+matrix+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Enhanced photoacoustic stability of gold nanorods by silica matrix confinement.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016010(2010).</li>
<li>Ratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CW+laser-induced+photothermal+conversion+and+shape+transformation+of+gold+nanodogbones+in+hydrated+chitosan+films%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">CW laser-induced photothermal conversion and shape transformation of gold nanodogbones in hydrated chitosan films.</a> J. Nanopart. Res. 13, 4337-4348 (2011).</li>
<li>Mercatelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+readout+of+optically+encoded+gold+nanorods+using+an+ordinary+dark-field+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Quantitative readout of optically encoded gold nanorods using an ordinary dark-field microscope.</a> Nanoscale. 5 (20), 9645-9650 (2013).</li>
<li>Von Maltzahn, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computationally+guided+photothermal+tumor+therapy+using+long-circulating+gold+nanorod+antennas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas.</a> Cancer Res. 69 (9), 3892-3900 (2009).</li>
<li>Jokerst, J. V., Cole, A. J., Van De Sompel, D., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+for+ovarian+cancer+detection+with+photoacoustic+imaging+and+resection+guidance+via+Raman+imaging+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods for ovarian cancer detection with photoacoustic imaging and resection guidance via Raman imaging in living mice.</a> ACS Nano. 6 (11), 10366-10377 (2012).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reexamination+of+active+and+passive+tumor+targeting+by+using+rod-shaped+gold+nanocrystals+and+covalently+conjugated+peptide+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands.</a> ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).</li>
<li>Alkilany, A. M., Thompson, L. B., Boulos, S. P., Sisco, P. N., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods%3A+Their+potential+for+photothermal+therapeutics+and+drug+delivery%2C+tempered+by+the+complexity+of+their+biological+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods: Their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 190-199 (2012).</li>
<li>Centi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+antibody-conjugated+gold+nanorods+for+systemic+injections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of antibody-conjugated gold nanorods for systemic injections.</a> J. Nanobiotechnology. 12, 55(2014).</li>
<li>Jain, P. K., Eustis, S., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+coupling+in+nanorod+assemblies%3A+Optical+absorption%2C+discrete+dipole+approximation+simulation%2C+and+exciton-coupling+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Plasmon coupling in nanorod assemblies: Optical absorption, discrete dipole approximation simulation, and exciton-coupling model.</a> J. Phys. Chem. B. 110 (37), 18243-18253 (2006).</li>
<li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+coupling+of+gold+nanorods+at+short+distances+and+in+different+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries.</a> Nano Lett. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li>
<li>Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+Decoupling+in+Aggregates+of+Silanized+Gold+Nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).</li>
<li>Lapotko, D. O., Lukianova, E., Oraevsky, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+laser+nano-thermolysis+of+human+leukemia+cells+with+microbubbles+generated+around+clusters+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">Selective laser nano-thermolysis of human leukemia cells with microbubbles generated around clusters of gold nanoparticles.</a> Lasers Surg. Med. 38 (6), 631-642 (2006).</li>
<li>Choi, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+trojan+horse+for+delivery+of+therapeutic+nanoparticles+into+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">A cellular trojan horse for delivery of therapeutic nanoparticles into tumors.</a> Nano Letters. 7 (12), 3759-3765 (2007).</li>
<li>Dreaden, E. C., Mwakwari, S. C., La Austin,, Kieffer, M. J., Oyelere, A. K., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-gold+nanorod+conjugates+selectively+target+and+induce+macrophage+cytotoxicity+towards+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Small molecule-gold nanorod conjugates selectively target and induce macrophage cytotoxicity towards breast cancer cells.</a> Small. 8 (18), 2819-2822 (2012).</li>
<li>Yang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+phase-contrast+imaging+of+photothermal+treatment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+an+in+vitro+study+of+macrophages+as+a+vector+for+the+delivery+of+gold+nanoshells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time phase-contrast imaging of photothermal treatment of head and neck squamous cell carcinoma: an in vitro study of macrophages as a vector for the delivery of gold nanoshells.</a> J. Biomed. Opt. 17 (12), 128003(2012).</li>
<li>Vigderman, L., Manna, P., Zubarev, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Replacement+of+Cetyl+Trimethylammonium+Bromide+by+Cationic+Thiol+Ligands+on+the+Surface+of+Gold+Nanorods+and+Their+Extremely+Large+Uptake+by+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+%28English%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative Replacement of Cetyl Trimethylammonium Bromide by Cationic Thiol Ligands on the Surface of Gold Nanorods and Their Extremely Large Uptake by Cancer Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. (English). 51 (3), 636-641 (2012).</li>
<li>Richard, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> J. Biol. Chem. 278 (1), 585-590 (2003).</li>
<li>Delehanty, J. B., Boeneman, K., Bradburne, C. E., Robertson, K., Bongard, J. E., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+for+specific+intracellular+delivery+and+targeting+of+nanoparticles%3A+implications+for+developing+nanoparticle-mediated+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Peptides for specific intracellular delivery and targeting of nanoparticles: implications for developing nanoparticle-mediated drug delivery.</a> Ther. Deliv. 1, 411-433 (2010).</li>
<li>Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+growth+mechanism+of+gold+nanorods+%28NRs%29+using+seed-mediated+growth+method%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Preparation and growth mechanism of gold nanorods (NRs) using seed-mediated growth method.</a> Chem. Mater. 15 (10), 1957-1962 (2003).</li>
<li>Ratto, F., Matteini, P., Rossi, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape+control+in+the+overgrowth+of+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Size and shape control in the overgrowth of gold nanorods.</a> J. Nanopart. Res. 12 (6), 2029-2036 (2009).</li>
<li>Niidome, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-modified+gold+nanorods+with+a+stealth+character+for+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo applications.</a> J. Control. Release. 114 (3), 343-347 (2006).</li>
<li>Tatini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependent+biological+profiles+of+PEGylated+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Size dependent biological profiles of PEGylated gold nanorods.</a> J. Mater. Chem. B. 2, 6072-6080 (2014).</li>
<li>Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., Centi, S., Dei, L., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+films+doped+with+gold+nanorods+as+laser-activatable+hybrid+bioadhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Chitosan films doped with gold nanorods as laser-activatable hybrid bioadhesives.</a> Adv. Mater. 22 (38), 4313-4316 (2010).</li>
<li>Matteini, P., Ratto, F., Rossi, F., de Angelis, M., Cavigli, L., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+nanocomposite+films+for+laser-activated+tissue+bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Hybrid nanocomposite films for laser-activated tissue bonding.</a> J. Biophotonics. 5 (11-12), 868-877 (2012).</li>
<li>Matteini, P., Tatini, F., Cavigli, L., Ottaviano, S., Ghini, G., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+as+a+photothermal+switch+for+controlled+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Graphene as a photothermal switch for controlled drug release.</a> Nanoscale. 6, 7947-7953 (2014).</li>
<li>Ratto, F., Witort, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmonic+Particles+that+Hit+Hypoxic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Plasmonic Particles that Hit Hypoxic Cells.</a> Adv. Funct. Mater. 25 (2), 316-323 (2015).</li>
<li>Chithrani, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+uptake%2C+transport%2C+and+processing+of+gold+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Molec.+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular uptake, transport, and processing of gold nanostructures.</a> Molec. Membrane Biol. 27 (7), 299-311 (2010).</li>
<li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells%2C+relieves+immunosuppression%2C+and+improves+chemotherapeutic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73 (3), 1128-1141 (2013).</li>
<li>Mantovani, A., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+anticancer+therapies+with+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The interaction of anticancer therapies with tumor-associated macrophages.</a> J. Exp. Med. 212 (4), 435-445 (2015).</li>
<li>Panni, R. Z., Linehan, D. C., DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+to+combat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages to combat cancer.</a> Immunotherapy. 5 (10), 1075-1087 (2013).</li>
<li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+fate+of+PEGylated+gold+nanoparticles+is+dependent+on+both+cell-penetration+peptides+and+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and fate of PEGylated gold nanoparticles is dependent on both cell-penetration peptides and particle size.</a> ACS Nano. 5 (8), 6434-6448 (2011).</li>
<li>Yuan, H., Fales, A. M., Vo-Dinh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+peptide-functionalized+gold+nanostars%3A+Enhanced+intracellular+delivery+and+efficient+NIR+photothermal+therapy+using+ultralow+irradiance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">TAT peptide-functionalized gold nanostars: Enhanced intracellular delivery and efficient NIR photothermal therapy using ultralow irradiance.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (28), 11358-11361 (2012).</li>
<li>Ladest, S., Fales, A. M., Domard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-membrane+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-membrane hydrogels.</a> Nature. 452, 76-79 (2008).</li>
<li>Matteini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermally+activated+hybrid+films+for+quantitative+confined+release+of+chemical+species%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+%28English%29%22%5BJournal%5D)">Photothermally activated hybrid films for quantitative confined release of chemical species.</a> Angew. Chem. Int. Ed. (English). 52, 5956-5960 (2013).</li>
<li>Khor, E., Lim, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+applications+of+chitin+and+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantable applications of chitin and chitosan.</a> Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).</li>
<li>Kennedy, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+enhance+gold+nanoparticle+delivery+to+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res.+Lett%22%5BJournal%5D)">T cells enhance gold nanoparticle delivery to tumors in vivo.</a> Nanoscale Res. Lett. 6 (1), 283(2011).</li>
<li>Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+destruction+of+murine+macrophage+cells+with+bioconjugated+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods.</a> J. Nanopart. Res. 9 (6), 1109-1124 (2007).</li>
<li>Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+imaging+of+mesenchymal+stem+cells+in+living+mice+via+silica-coated+gold+nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells in living mice via silica-coated gold nanorods.</a> ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2012).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+coated+with+multilayer+polyelectrolyte+as+contrast+agents+for+multimodal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods coated with multilayer polyelectrolyte as contrast agents for multimodal imaging.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (34), 12552-12557 (2007).</li>
<li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+laser+assisted+microvascular+repair+and+end-to-end+anastomosis+by+means+of+indocyanine+green-infused+chitosan+patches%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo laser assisted microvascular repair and end-to-end anastomosis by means of indocyanine green-infused chitosan patches: A pilot study.</a> Lasers Surg. Med. 45 (5), 318-325 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La idea de orientar los macrófagos asociados a tumores se está convirtiendo en un concepto de gran alcance para combatir el cáncer 34, 35, 36. Aquí, en lugar de su destrucción, estas células son reclutados como vehículos celulares para llevar nanobastones de oro en un tumor, por la explotación de su tropismo. Esta perspectiva requiere un cuidadoso diseño de las partículas, su integración en las células y su caracterización. Hemos encontrado que la fotoestabilidad de...

Durante la última década, diversas partículas plasmónicas como nanorods oro, nanocápsulas y nano-cajas, han recibido una atención considerable para aplicaciones en óptica biomédica 1, 2, 3, 4. En desacuerdo con nanoesferas de oro estándar, estas partículas nuevas resuenan en la ventana de infrarrojo cercano (NIR), que proporciona para la penetración más profunda óptica a través del cuerpo y mayor contraste óptico sobre componentes endógenos 1. Esta característica ha despertado interés para aplicaciones innovadoras, tales como la formación de imagen fotoacústica (PA) y la ablación fototérmica de cáncer. Sin embargo, varias cuestiones restringen la penetración clínica de estas partículas. Por ejemplo, su activación óptica tiende a inducir su sobrecalentamiento y modificar sus formas funcionales hacia perfiles más esféricas, que impulsa un fotoinestabilidad 5, 6, 7, 8 </sup&gt;, 9. Otro tema que domina el debate científico es su liberación sistémica en los tumores. En particular, nanobastones oro combinan tamaños que son ideales para impregnar los tumores que muestran una mayor permeabilidad y retención y la facilidad de conjugación con sondas específicas de marcadores malignos. Por lo tanto, su preparación para una inyección directa en el torrente sanguíneo se percibe como un esquema viable 10, 11, 12, 13. Sin embargo, esta ruta sigue siendo problemática, con la mayoría de las partículas de quedar capturado por el sistema de fagocitos mononucleares 10, 11, 12. Además, otra preocupación es la estabilidad óptica y bioquímica de las partículas después de la circulación a través del cuerpo 14. Cuando las partículas pierden su estabilidad coloidal y agregada, sus características plasmónicas y la dinámica de transferencia de calor pueden sufrir de acoplamiento plasmónica 15, </shasta&gt; 16, 17 y 18 a través del sobrecalentamiento. Más recientemente, el concepto de explotar el tropismo de macrófagos asociados al tumor ha surgido como una alternativa inteligente 19, 20, 21. Estas células tienen una capacidad innata para detectar e impregnar los tumores con alta especificidad. Por lo tanto, un punto de vista puede ser para aislar estas células de un paciente, cargarlos con nanorods de oro en vitro y luego inyectar de nuevo en el paciente, con la intención de utilizarlos como vehículos celulares responsables de la entrega. Otra ventaja sería contar con un mayor control sobre la estabilidad óptica y la bioquímica de las partículas, debido a que su interfaz biológica sería construida in vitro. Aún así, las prestaciones de estos vehículos celulares como agentes de contraste ópticos necesitan un análisis crítico. En este trabajo se describe la preparación y temas críticos de Cellular vehículos que contienen nanorods de oro para la formación de imágenes de cáncer de PA. Nanorods oro PEGilados se modifican con compuestos de amonio cuaternario 22, a fin de lograr un perfil catiónico que se espera para promover su interacción con las membranas plasmáticas 23, 24. Estas partículas se someten a la absorción eficiente y no específica de la mayoría de tipos celulares, es de esperar sin interferir mucho con sus funciones biológicas. macrófagos murinos se cargan con hasta un máximo de 200, 000 nanobastones oro catiónicos por célula, que quedan confinadas dentro de las vesículas de endocitosis apretados. Esta configuración debe surgir la preocupación, debido a la amenaza de acoplamiento plasmónica y transversal sobrecalentamiento dentro de estas vesículas. Por lo tanto, los macrófagos se incrustan en hidrogeles biopoliméricos que imitan los tejidos biológicos, con el fin de verificar que la mayor parte de la estabilidad de la conversión de PA de las partículas se retiene en la transferencia del medio de crecimiento a las vesículas de endocitosis. effectivcriterios de medición electrónicos se elaboran con el fin de medir la estabilidad de conversión de PA en condiciones de interés inmediato para obtener imágenes de PA. Un umbral de remodelación se establece en el mismo inicio de la inestabilidad óptica después de un tren de pulsos de láser 50 con la tasa de repetición típico de 10 Hz. Estamos seguros de que estos resultados pueden proporcionar el impulso para el desarrollo de nuevas estrategias para suministrar partículas plasmónicas a los tumores.

<table><tbody><tr><td>Bromuro de hexadeciltrimetilaminamonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>Para sintetizar nanovarillas de</td></tr><tr><td>oro Cloruro de oro (III) trihidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>Para sintetizar nanovarillas de oro</td></tr><tr><td>Nitrato</td><td>de plata Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>Para sintetizar nanovarillas de oro</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Para sintetizar nanovarillas de oro</td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Para sintetizar nanosemillas de oro</td></tr><tr><td>MeO-PEG-SH</td><td>Iris Biotech</td><td>PEG1171</td><td>Para PEGilar nanovarillas de oro. Peso molecular: alrededor de 5.000 Da.</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Para PEGilar nanovarillas de oro y solubilizar quitosano</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Para PEGilar nanovarillas de oro</td></tr> <tr><td>(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-bromuro de trimetilamonio</td><td>Sigma-Aldrich 733305</td><td></td><td>Para modificar nanovarillas de oro con compuestos de amonio cuaternario</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Para solubilizar (11-mercaptoundecilo)-N,N,N-bromuro de trimetilamonio</td></tr><tr><td>Polisorbato 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Para centrifugar nanovarillas de oro pegilado</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Para suspender nanovarillas de oro antes de la incubación con células y para tratar pellets de células</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Línea celular murina de monocitos/macrófagos</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F Medio de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>Para añadir al medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Para añadir al medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Para añadir al medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>NEST</td><td>705001</td><td>Cultivo celular </td></tr><tr><td>plato Raspador de células</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>Para separar células</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>Para fijar células</td></tr><tr><td>Quitosano, Sigma-Aldrich</td><td>de bajo peso molecular</td><td>448869</td><td>75-85% desacetilado. Peso molecular: alrededor de 120.000 Da.</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>Para insolubilizar el quitosano y generar el hidrogel</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de poliestireno</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>Utilizados como moldes para fabricar hidrogeles de quitosano</td></tr><tr><td>Oscilador óptico paramétrico bombeado por el tercer armónico de un láser Nd:YAG Q-switched</td><td>Continuum, Santa Clara, EE. UU. Surelite</td><td>OPO plus</td><td>Fuente de excitación óptica para ensayos fotoacústicos</td></tr><tr><td>Detector piroeléctrico&nbsp;</td><td>Gentec, Quebec, Canadá</td><td>QE8SP</td><td>Para monitorear la fluencia óptica para pruebas fotoacústicas</td></tr><tr><td>Hidrófono de aguja preamplificado</td><td>Precision Acoustic, Dorset, Reino Unido</td><td>Modelo con diámetro de sensor de 1 mm y rango de frecuencia de 1-20 MHz</td><td>Para medir señales fotoacústicas</td></tr></tbody></table>

análisis preparación y fotoacústica de vehículos celulares que contienen oro nanorods

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

nanorods oro son atractivos para una variedad de aplicaciones biomédicas, tales como la ablación fototérmica y la formación de imagen fotoacústica de cáncer, gracias a su absorbancia óptica intensa en la ventana del infrarrojo cercano, baja citotoxicidad y el potencial para el hogar en los tumores. Sin embargo, su entrega a los tumores sigue siendo un problema. Un enfoque innovador consiste en la explotación de la tropismo de macrófagos asociados al tumor que se puede cargar con nanorods de oro en vitro. A continuación, se describe la preparación y la inspección de los vehículos fotoacústica celulares que contienen nanorods oro. nanorods oro PEGilados se modifican con compuestos de amonio cuaternario, con el fin de conseguir un perfil de catiónico. Tras contacto con los macrófagos de ratón en placas de Petri ordinarias, se encuentran estas partículas a someterse a la captación masiva en vesículas de endocitosis. A continuación, estas células se incrustan en hidrogeles biopoliméricos, que se utilizan para verificar que la estabilidad de la conversión fotoacústicade las partículas se retiene en su inclusión en los vehículos celulares. Estamos seguros de que estos resultados pueden proporcionar una nueva inspiración para el desarrollo de nuevas estrategias para suministrar partículas plasmónicas a los tumores.

En este caso, la viabilidad de los vehículos celulares que contienen nanorods de oro para la formación de imágenes de cáncer de PA se muestra junto con los resultados típicos del protocolo. Las imágenes TEM de la figura 1 muestran el aspecto habitual de las partículas después de la etapa 1 y sus vehículos celulares después de la etapa 2. La preparación de las partículas y de las células para obtener imágenes d...

Mostramos la preparación y abordamos la viabilidad de vehículos celulares que contienen nanovarillas de oro para la obtención de imágenes fotoacústicas del cáncer.

Análisis preparación y fotoacústica de Vehículos celulares que contienen oro Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

El objetivo general de este protocolo es utilizar vehículos celulares que contienen nanobarras de oro como una estrategia innovadora para entregar partículas plasmónicas a tumores. Nuestro protocolo puede ayudar a responder preguntas clave sobre el desarrollo de enfoques fotoacústicos y fototérmicos para imaginar y tratar el cáncer mediante el uso de agentes de contraste exógenos. Este método se basa en el tropismo de los macrófagos asociados a tumores para entregar partículas plasmónicas a los tumores.La idea consiste en aislar estas células de un paciente, cargarlas con partículas plasmónicas in vitro y luego inyectarlas nuevamente en su hospedador con la intención de utilizarlas como receptáculos de estrógeno. Una de las ventajas de este enfoque es la posibilidad de obtener un mayor control sobre la estabilidad óptica y bioquímica de las partículas, ya que su interfaz biológica se construye completamente in vitro. Para comenzar, purifique seis mililitros de nanobarras de oro recubiertas con cetrimonio a una concentración de oro de 450 micromolar, utilizando dos centrifugaciones, seguidas de decantación y lavado en bromuro de cetrimonio acuoso 500 micromolar.A continuación, agregue 1,5 mililitros de tampón acetato 100 milimolar con bromuro de cetrimonio y polisorbato 20 al recipiente que contiene el precipitado de partículas de oro. Luego, agregue 7,5 microlitros de alfa-Metoxi-omega-mercapto polietilenglicol 10 milimolar en agua y deje reaccionar durante 30 minutos a 37 grados Celsius. A continuación, agregue 7,5 microlitros de bromuro de mercaptoundecil trimetil amonio 100 milimolar en dimetilsulfóxido.Luego, deje que la reacción repose durante 24 horas a 37 grados Celsius. Después de 24 horas, agregue 4,5 mililitros de polisorbato 20 al 0,005 % en agua. Ahora, utilizando esta solución suave de polisorbato 20, purifique las partículas mediante cuatro ciclos de centrifugación y decantación.Finalmente, transfiera las partículas a 600 microlitros de solución salina tamponada con fosfato estéril. La concentración nominal de oro debería ser ahora de 4,5 milimolar. Para preparar las células, siembre dos placas de 60 milímetros con medio millón de células monocíticas macrófagas en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado y cultívelas durante 24 horas.Después de 24 horas, sustituya el medio celular por medio fresco, suplementado con las nanobarras catiónicas de oro preparadas, para obtener una concentración final de 100 micromolar de oro en cada placa de Petri. A continuación, continúe la incubación durante otras 24 horas. Al día siguiente, revise las células bajo un microscopio.Deben presentar una morfología normal y muchas vesículas intracelulares oscuras. Si las células tienen buen aspecto, lávelas con medio fresco, desprenda las células utilizando un raspador y combine las células de dos placas para obtener al menos dos millones de células en una sola muestra. A continuación, centrifugue las muestras a 120 G durante 6 minutos para eliminar cualquier exceso de nanobarras de oro catiónicas.Deseche los sobrenadantes. Los pellet celulares deben verse casi negros. Suspender los pellet en dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato y contar las células utilizando una cámara de Neubauer.Luego, mezcle las suspensiones que contienen dos millones de células y centrifúgelas a 120 G durante seis minutos. Resuspenda los pellets en dos mililitros de formaldehído al 3,6 % en solución salina tamponada con fosfato y deje que las células se fijen durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, elimine el fijador mediante tres lavados con solución salina tamponada con fosfato.Un día antes de comenzar este procedimiento, prepare 500 microlitros de una solución ácida de quitosano de bajo peso molecular al 3% peso por volumen. Ajuste un pH de 4,5 mediante la adición de ácido acético. Para mezclar completamente la solución, déjela homogenizar durante 24 horas a 40 grados Celsius.Al día siguiente, mezcle los macrófagos murinos preparados con nanobarras de oro con los 500 microlitros de la solución de quitosano. Para obtener fantasmas de 50 micrones de espesor, cargue 250 miligramos de la mezcla en moldes de poliestireno de 1,9 centímetros cuadrados. Deje reposar las muestras bajo una campana durante 24 horas.Al día siguiente, trate las muestras con 500 microlitros de hidróxido de sodio acuoso 1 molar, con el fin de inducir la reticulación, y enjuáguelas con 10 mililitros de agua ultrapura. Analice la estabilidad de la conversión fotoacústica utilizando un microscopio fotoacústico personalizado, que incluye un oscilador paramétrico óptico, un atenuador para ajustar el flujo óptico y un transductor de ultrasonidos. Comience suspendiendo la película de quitosano que contiene los macrófagos en agua desionizada usando un soporte de plástico sumergido en un tanque de agua.Determine un flujo de sonda que no dañe la muestra y que produzca una emisión fotoacústica con una relación señal-ruido suficiente. Establezca un flujo de prueba y los parámetros de adquisición. Para cada pulso del láser, adquiera la señal fotoacústica correspondiente desde el transductor de ultrasonido.Calcule la relación entre la intensidad fotoacústica y el flujo láser para cada pulso. Analice su tendencia en función del número de pulso y verifique su estabilidad a lo largo del tiempo. En caso de inestabilidad, repita esta medición con un flujo de prueba más bajo.En el caso de estabilidad, la fluencia de prueba puede utilizarse como fluencia de sonda, siempre que su emisión fotoacústica presente una relación señal-ruido adecuada. A continuación, mida una fluencia umbral de remodelado. Elija un punto aleatorio de la muestra, ajuste el láser a la fluencia de sonda y mida una intensidad fotoacústica promedio, A, durante 500 pulsos.Luego, aumente la fluencia nominal por encima de la fluencia de sonda y aplique 50 pulsos. Denomine su fluencia promedio como F excitación. Restablezca el láser a la fluencia de sonda y repita la medición, tomando la intensidad fotoacústica promedio, B, a lo largo de 500 pulsos.Ahora, calcule la relación R de B respecto a A. Un valor de R inferior a la unidad indica que ha ocurrido un cambio irreversible en las propiedades ópticas de la muestra. A continuación, utilice la etapa micrométrica para mover la película y cambiar aleatoriamente el punto de medición de la muestra. Luego, repita la medición de R para diferentes valores de excitación F, de modo que obtenga varios valores de R alrededor y por debajo de la unidad.Aproximadamente 15 puntos de R constituyen una colección razonable de datos. Luego, grafique R como función de la excitación F e identifique el umbral de remodelación como la fluencia en la que R se desvía de la unidad sin incertidumbre. Típicamente, las nanobarras de oro catiónicas experimentan una acumulación masiva en los macrófagos, que mantienen su morfología normal.Se observa que las partículas están confinadas dentro de vesículas endocíticas estrechas. Más adelante en el proceso, la inclusión en el hidrogel de quitosano no parece afectar la morfología celular. Las células están bien dispersas a lo largo de la muestra, como se observa mediante una micrografía.Los controles de películas de quitosano que contienen nanobarras de oro sin células son homogéneos. Las bandas plasmónicas de las nanobarras de oro se conservan en sus vehículos celulares. Efectos como el acoplamiento plasmónico o una absorción diferente de partículas con distintos tamaños y formas no desempeñaron un papel sustancial en estos protocolos.Después de recopilar los datos, la tendencia de R como función de la excitación de F da una idea de los datos y del análisis necesario para determinar el umbral de F. Aquí, el umbral de F fue de aproximadamente 11 milijulios por centímetro cuadrado. Las mediciones fotoacústicas fueron altamente precisas con una relación señal-ruido mayor a 20 durante 500 pulsos.Nuestro protocolo es innovador con respecto a los métodos existentes en el diseño de las partículas y en el estudio de su fotostabilidad. La modificación de nanobarras de oro pegiladas con cationes de amonio cuaternario proporciona una alta eficiencia de absorción celular manteniendo la estabilidad coloidal. La medición de la estabilidad de la conversión fotoacústica mediante la definición del umbral de remodelación es cuantitativa y reproducible.Dado que estas partículas están destinadas a utilizarse como agentes de contraste para la imagen fotoacústica, una sonda fotoacústica es ideal para probar sus características funcionales. Los vehículos celulares de las partículas plasmónicas son visibles como agentes de contraste para la imagen fotoacústica. Su fotostabilidad es la misma que la de las partículas plasmónicas libres.El enfoque de nuestro trabajo actual se centra en la fisiología de estas células, prestando especial atención a su viabilidad y actividad quimiotáctica.

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