Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca ^{2 +} Envejecido en las neuronas del hipocampo

El objetivo general de este procedimiento es investigar la remodelación del calcio en el cerebro envejecido utilizando imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia de calcio citosólico y mitocondrial en cultivos a largo plazo de neuronas del hipocampo de fraternidad, que se considera un modelo de envejecimiento neuronal. Este método puede ayudar a comprender preguntas clave en el campo del envejecimiento, como cómo la remodelación del calcio intracelular contribuye a la excitotoxicidad y al daño neuronal, ambos relacionados con la sobrecarga de calcio. La principal ventaja de esta técnica es que es posible seguir de cerca la remodelación del calcio en neuronas individuales utilizando cultivos in vitro a diferentes DYS a partir de la misma duplicación de la muestra de esta técnica a través de la terapia de un accidente cerebrovascular o enfermedad celular porque es variable, nuevo objetivo relacionado con la sobrecarga de calcio en enfermedades relacionadas con este agente.

Después de ver este video, Jesús tiene una buena comprensión de cómo realizar imágenes de fluorescencia y reminiscencia de calcio citosólico y mitocondrial en cultivos a corto y largo plazo de neuronas de hipocampo de rata. Para comenzar este procedimiento, distribuya los cubreobjetos en una tira de paraforma en una placa de Petri. A continuación, aplique 200 microlitros de poli D licina a un miligramo por mililitro en cada cubreobjetos y trate durante la noche.

Al día siguiente, lavar los cubreobjetos con agua estéril destilada dos veces cada 15 minutos durante 90 minutos en condiciones estériles. Coloque los cubreobjetos en el multi y manténgalos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5%CO2 hasta su uso. Para aislar las neuronas del hipocampo, abra el cráneo de las crías de rata recién nacidas con unas tijeras estériles, extraiga el cerebro con una espátula y lávelo rápidamente en medio F 12 de jamón.

A continuación, haga un corte diagonal con el bisturí en cada hemisferio y transfiéralo a la placa de Petri que contiene jamones F 12 medio bajo el microscopio. Deseche las meninges. Identifique cuidadosamente el hipocampo en una ubicación cóncava característica sobre la corteza.

A continuación, separa el hipocampo de la corteza tirando de él con cuidado y retirándolo con unas tijeras oculares. A continuación, transfiera las piezas del hipocampo a un vial que contenga 1,8 mililitros de solución de pepano prefiltrada. Incubarlos a 37 grados centígrados con agitaciones suaves ocasionales durante 15 minutos.

A continuación, añada 90 microlitros de una solución de ADN. Añade 50 microgramos por mililitro y envuélvelos durante otros 15 minutos. Después de eso, transfiera el tejido a un tubo de centrífuga de 10 mililitros y lave los fragmentos con medio de cultivo neurobasal fresco.

Obtener una suspensión celular pasando los fragmentos de tejido a través de una pipeta de plástico de cinco mililitros. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 160 G durante cinco minutos. A continuación, retire el supinato con una pipeta de plástico estéril para pastos y suspenda el pellet con cuidado en un mililitro de medio de cultivo neurobasal con una pipeta automatizada de un mililitro.

A continuación, mida la densidad de células con una cámara de recuento de neubauer. Agregue 10 microlitros de suspensión celular y cuente el número de células bajo el microscopio. A continuación, realice los cálculos correspondientes para obtener de 40 a 80 microlitros de suspensión celular, que contiene unas 30.000 células.

En la placa de cuatro pocillos que contenía 500 microlitros de medio neurobasal, se reprodujeron alrededor de 30.000 células por cada pocillo que contenía cubreobjetos de vidrio. Manténgalos en la incubadora durante dos a cinco días in vitro para neuronas jóvenes o más de 15 días in vitro para neuronas envejecidas. En este procedimiento, incube las células con menos de 2:00 AM durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

A continuación, transfiera los cubreobjetos a la cámara de profusión. Después de eso, coloque la cámara de profusión con el cubreobjetos en el soporte del microscopio invertido. Seleccione el campo microscópico y perfunda las células continuamente con HBS precalentado.

Posteriormente, epi ilumina las células a 340 y 380 nanómetros. Alternativamente, registre la luz emitida a 520 nanómetros cada cinco a 10 segundos con una cámara fluorescente, que es filtrada por un espejo fira de dos diics. Para analizar las imágenes fluorescentes grabadas, primero abra el archivo del experimento con el software Aqua Cosmos, haga clic en relación y seleccione el rango de relación deseado.

Calcule la relación píxel por píxel en las imágenes resultantes para obtener una secuencia de imágenes de proporción. A continuación, resta el fondo ajustando el botón de eliminación de fondo. Después de eso, presione iniciar cálculo.

A continuación, presione el botón de secuencia de tiempo completo y borre los ROI antiguos para el análisis cuantitativo de celdas individuales. Establecer nuevos ROIs o los ROIs correspondientes a las neuronas individuales. Para graficar las grabaciones individuales, exporte los valores de fluorescencia de la relación correspondientes a cada ROI al programa de laboratorio Origin haciendo clic en gráfico.

A continuación, haga clic en calcular y guarde el archivo TXT. Después de eso, haga el cálculo correspondiente para estimar el tamaño del aumento en la relación de fluorescencia en respuesta a cada estimulación para transfectar neuronas cultivadas con el plásmido mutante MIT. Primero, prepare 50 microlitros de solución A que contiene reactivo de transfección en un vial.

A continuación, prepare 50 microlitros de solución B que contenga plásmido MIT ute en un vial. Agregue la solución B a la solución A e incube durante 20 minutos. Después de eso, transfiera los cubreobjetos que contienen neuronas del hipocampo a nuevas placas múltiples que contengan 200 microlitros de TF neurobasal fresco. A continuación, añada 100 microlitros de la solución A y B gota a gota sobre cada cubreobjetos e incube durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, retire el medio. Lavar las células con tf basal neuro fresco. Una vez que regrese, la cubierta se desliza al medio de cultivo neurobasal original y cultive las células durante 24 horas después de la transfección para permitir una expresión eficiente y la orientación de la sonda.

A continuación, agregue cuatro microlitros de sellador TEREZIN N a 200 microlitros de HBS para obtener una concentración final de cuatro micromolares. Mezclar suavemente e incubar durante dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de dos horas, transfiera los deslizamientos de la cubierta a la cámara de perfusión y examine continuamente con una solución HBS precalentada.

Para registrar las imágenes de bioluminiscencia de la concentración de calcio mitocondrial, seleccione el campo microscópico que contiene las células que expresan APO corin como se muestra por emisión de fluorescencia. A continuación, apague la luz del microscopio. Retire la caja contenedora dicroica ubicada en el camino de luz.

A continuación, apague la luz de excitación y cierre la caja oscura para una oscuridad total. Perfundir las células con medio HBS, con o sin soluciones de prueba precalentadas a 37 grados centígrados. A continuación, capture las imágenes de emisión fotónica cada 10 segundos con una cámara de conteo de fotones manejada con un procesador de imágenes.

A continuación, agregue dig toin para liberar todos los fotones restantes Para analizar imágenes bioluminiscentes que reflejan el calcio mitocondrial. Abra la imagen de fluorescencia GFP. Seleccione los ROI individuales dibujando alrededor de las celdas transfectadas.

A continuación, copia y pega los mismos ROI en cada imagen de la secuencia. Capturas de pantalla. Después de eso, exporte los valores de emisión fotónica para cada ROI al software específico para el cálculo del gráfico de clic.

Para calcular los valores de cada ROI, seleccione el valor total y utilice el ROI actual para todas las imágenes. A continuación, pulse calcular, guarde el archivo de texto y exporte los datos. A continuación, realice los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de los aumentos de calcio mitocondrial en respuesta a cada estímulo mostrado.

Aquí están las imágenes representativas de campo claro y pseudo color de cultivos a corto y largo plazo de neuronas del hipocampo antes y después de la estimulación con 100 micromolares y MDA colores más cálidos que reflejan una concentración elevada de calcio citosólico. Estos trazos muestran los registros representativos de una sola célula de la concentración de calcio citosólico en respuesta a 100 micromolares y MDA en cultivos a corto y largo plazo de neuronas del hipocampo. Nótese que los aumentos de la concentración de calcio citosólico son mucho mayores a largo plazo que en las neuronas cultivadas a corto plazo.

En este experimento, las neuronas del hipocampo cultivadas se transfectaron con la korina dirigida a las mitocondrias de baja afinidad fusionada con GFP incubada con cuatro selladores micromolares terezina, y se sometieron a imágenes de bioluminiscencia de la concentración de calcio mitocondrial. Aquí, las grabaciones que muestran la liberación de fotoemisiones que reflejan el calcio mitocondrial en neuronas del hipocampo cultivadas a corto y largo plazo. Un micromolar MDA 100 aumentó la concentración de calcio mitocondrial en las neuronas envejecidas, pero no en las neuronas jóvenes del hipocampo cultivadas después de este procedimiento.

Otros métodos, como la evaluación justa a la izquierda, pueden combinarse con imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia en las mismas células para responder a preguntas adicionales como la susceptibilidad a las células neuronales, el plomo asociado al envejecimiento, la neurodegeneración y la isquemia.