Name: Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca 2 + Envejecido en las neuronas del hipocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Aprende a investigar el remodelado del calcio en el envejecimiento neuronal mediante imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia en cultivos de neuronas de hipocampo de rata. Este método permite estudiar la excitotoxicidad y el daño neuronal asociados.

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Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2012-37146) y la Junta de Castilla y León (BIO103/VA45/11, VA145U13 y BIO/VA33/13), España. El MCR contó con el apoyo de la Junta de Castilla y León (España) y el Fondo Social Europeo. Agradecemos al difunto Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) por el plásmido GFP Aequorin mitocondrial.

Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido manejados bajo los protocolos aprobados por la instalación de alojamiento de los animales de la Universidad de Valladolid, de acuerdo con la Convención Europea 123 / Consejo de Europa y la Directiva 86/609 / CEE. 1. Corto y Largo Plazo Cultura de las neuronas del hipocampo de rata <ol><li> Preparación de poli-D-lisina recubierto, 12 mm cubreobjetos de vidrio. <ol><li> Esterilizar 12 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro en etanol durante al menos 24 h. Deje que se seque en condiciones estériles. </li><li> Distribuir los cubreobjetos en una tira de Parafilm en una placa de Petri. Cubrir la superficie de cada cubreobjetos con 200 l de 1 mg / ml de poli-D-lisina. Permitir el tratamiento de O / N. </li><li> El día siguiente lavado los cubreobjetos con agua bidestilada estéril cada 15 min durante 90 min en condiciones estériles. </li><li> Llenar una placa de cuatro pozos multiplaca con 500 l de Neurobasal medio de cultivo por pocillo. Neurobasal medio de cultivo debe ser complementado conSuero bovino fetal al 10%, 2% B27, 1 mg / ml de gentamicina y 2 mM L-glutamina. </li><li> Coloque el cubreobjetos en la placa multiplaca. Mantener en un humidificado 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora hasta su uso. </li></ol></li><li> Aislamiento de las neuronas del hipocampo de ratas neonatales. <ol><li> Preparar 1,8 ml de solución de papaína (directa comprado) en un vial (20 l / ml) en condiciones estériles: para obtener una concentración final de 20 l / ml de añadir alrededor de 40 l papaína en 1,8 ml de Hank, más 0,6% de BSA (l debe calcularse dependiendo de las condiciones de proveedores). De Hank 0,6% de BSA se prepara mezclando 85 ml de medio HBSS con 15 ml de albúmina de suero bovino al 4% (BSA, preparado la solución de 4 g de BSA en 100 ml HBSS). Preparar en una campana estéril. </li><li> Incubar la papaína en Hank de más 0,6% de BSA durante 30 min a 37 ºC antes de su uso. Filtrar la solución usando un filtro de 0,22 micras antes de su uso. </li><li> Preparar medio F-12 de Ham añadiendo DulbeccoModificado polvo de Medio de Eagle (13,5 g por L) en 900 ml de agua bidestilada estéril. A continuación, añadir 6 g de HEPES y 336 mg NaHCO3 y ajustar el pH a 7,42 con NaOH 4 N. Añadir agua estéril para obtener una solución de 1 L y filtrarla usando una polietersulfona 0,20 micras (PES) botella de filtro superior. Realizar este proceso en una campana estéril. Finalmente saturar la solución con CO 2 en condiciones estériles antes de su uso. Soluciones Almacenar a 4 ºC y utilizarlos refrigerada. </li><li> La eutanasia a recién nacido (P0) crías de ratas por decapitación y se lava la cabeza en medio HBS estéril. Abra el cráneo con la ayuda de unas tijeras estériles. Extraer el cerebro con una espátula y lavar rápidamente en medio F-12 de Ham. </li><li> Haga un corte diagonal con la ayuda de un bisturí en cada hemisferio (Figura 1B), y llevarla a una placa de Petri que contiene medio F-12 de Ham. </li><li> Meninges Descartar cuidadosamente con la ayuda de unas pinzas de disección y bajo una lupa. </li> &lt;li&gt; Identificar el hipocampo en una zona cóncava característica más de la corteza usando la lupa. Luego, separe el hipocampo de la corteza tirando cuidadosamente de una frontera y de sacarlo de su posición con unas tijeras oculares. </li><li> Transferir el tejido del hipocampo a una placa de 4 bien lleno de medio estéril de Hank carente Ca 2+ y Mg 2+, más 0,6% de BSA y lavar el tejido del hipocampo. Sin retirar los medios de comunicación cortar el tejido en trozos pequeños (alrededor de 2 x 2 mm) utilizando las mismas tijeras oculares. </li><li> Transferencia piezas de hipocampo a un vial que contiene 1,8 ml de solución de papaína pre-filtrada. Entonces incuban a 37 ºC con ocasional, agitación suave. 15 min después, añadir 90 l de solución de DNasa I (50 mg / ml final) y se incuba durante 15 min adicionales. </li><li> Transferir el tejido a un tubo de centrífuga de 10 ml y lavar los fragmentos con frescos Neurobasal medio de cultivo. Obtener suspensión de células haciendo pasar los fragmentos de tejido a través de un pip plástico 5 mlette. </li><li> Suspensión de células Centrifugar a 160 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante usando una pipeta Pasteur de plástico estéril y suspender pellet cuidadosamente con una pipeta de 1 ml automatizados en 1 ml de medio de cultivo Neurobasal. </li><li> Medir la densidad de células usando una cámara de recuento Neubauer. Coloque el cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer. Añadir 10 l de suspensión celular. Asegúrese de que la suspensión celular entra en la cámara de manera uniforme y sin hacer burbujas. Contar el número de células bajo el microscopio y realizar cálculos correspondientes para obtener una gota adecuada de 40 a 80 l que contiene 30 x 10 3 células. El número total de células dependerá del número de animales utilizados. </li></ol></li><li> A corto plazo y la cultura a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata. <ol><li> Sobre la placa de cuatro pozos multiplaca que contiene 500 l de Neurobasal medio de cultivo preparado antes y se mantienen en la incubadora, la placa alrededor de 30 x 10 3 células en una caída de alrededor de 50 l a cadapocillo de la placa multiplaca que contiene uno poli-D-lisina, 12 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro. </li><li> Mantener las células del hipocampo primaria en un humidificado 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora durante 2-5 días in vitro (DIV, a corto plazo, las culturas jóvenes) o&gt; 15 DIV (a largo plazo, las culturas de edad) antes de experimentos sin necesidad de cambiar la cultura medios de comunicación. </li></ol></li></ol> 2. Fluorescencia de Imagen de citosólica de Ca2 + Concentración <ol><li> Preparación de las soluciones de ensayo para imágenes de fluorescencia. <ol><li> Preparar una solución externa de solución salina tamponada con HEPES (HBS) que contiene, en mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 1, glucosa 10, sodio-HEPES 10 (pH 7,42). </li><li> Preparar una solución exento externa, Mg 2+, solución salina tamponada con HEPES (HBS) que contiene, en mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl2 1, glucosa 10 y 10 HEPES (pH 7,42). </li><li> Resuelva salina NMDA en Mg 2 + libre, tamponada con HEPES (HBS) a una final concentración de 100 mM y complementarlo con 10 mM glicina. </li><li> Preparar una solución de HBS que contenía KCl en lugar de NaCl mediante la resolución de (en mM): KCl 145, MgCl 2 1, CaCl 2 1, glucosa 10 y HEPES 10 (pH 7,42). </li></ol></li><li> La carga de las células del hipocampo con fluorescente sonda de calcio fura2 / AM. <ol><li> Tome el cultivo de células que contienen cubreobjetos fuera de la incubadora y lavarlos con medio HBS a RT transfiriéndolos a una nueva placa de cuatro pozos multiplaca que contiene 500 l de HBS por pocillo. </li><li> Se incuban las células con fura2 / AM 4 M (preparado en el mismo medio HBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente (25 ºC) en un lugar oscuro. </li><li> Después de 60 minutos, lavar cubreobjetos con medio HBS fresco. </li></ol></li><li> Grabación de imágenes de fluorescencia de citosólico [Ca 2+] en células cultivadas. <ol><li> Encienda la lámpara, microscopio, sistema de perfusión, cámara de fluorescencia y el ordenador. </li><li> Coloque los cubreobjetos en una plataforma para termostatizadoabiertas 12 mm cubreobjetos de cristal en la platina del microscopio invertido y seleccionar un campo microscópico utilizando un objetivo de 40X (aceite, NA: 1,3). Perfundir células continuamente con precalentado (37 ºC) medio HBS en ausencia o presencia de sustancias de ensayo. Mantener el flujo a una velocidad de aproximadamente 5-10 ml / min. Nota: sistema de perfusión celular para células vivas está montado en una plataforma para termostatizado abiertas 12 mm cubreobjetos de vidrio. Sistema de perfusión por gravedad 8 líneas equipadas con un controlador de válvula se utiliza para perfundir las soluciones. Una bomba de vacío es responsable de la eliminación de cualquier exceso de medio. Las soluciones se calentaron usando un sistema de calefacción en el tubo. </li><li> Capturar una imagen de fondo con el obturador cerrado en ambas longitudes de onda de excitación. </li><li> Epi-iluminar células alternativamente a 340 y 380 nm. Record luz emitida a 520 nm cada 5-10 seg con una cámara de fluorescencia, que se filtra por un espejo dicroico fura-2. </li><li> Cuando finalice el período de registro, guarde la secuencia completa of imágenes emiten en 520 nm en el ordenador para su posterior análisis. </li></ol></li><li> Análisis de imágenes fluorescentes grabados. <ol><li> Abra el archivo de experimento. Usando el software aquacosmos, haga clic en &#39;Relación&#39; y seleccione el rango de relación deseada. Calcular la relación de pixel por pixel en las imágenes resultantes a fin de obtener una secuencia de imágenes de relación. </li><li> Reste fondo ajustando la &#39;eliminación de fondo&#39;. Pulse &#39;cálculo de inicio&#39;. </li><li> Pulse &#39;todo momento secuencia&#39; botón y borrar las antiguas regiones de interés (ROI). Para el análisis cuantitativo de las células individuales, establecer nuevas regiones de interés o regiones de interés correspondientes a las neuronas individuales. Promedio de todos los valores de la relación en cada píxel correspondientes a cada ROI y cada imagen para obtener una grabación de valores de fluorescencia ratio para ROI individuales (células). </li><li> Para graficar las grabaciones individuales exportar los valores de relación de fluorescencia correspondientes a cada retorno de la inversión a un progr gráficaa.m. </li><li> Hacer los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de las subidas de fluorescencias proporción en respuesta a cada estimulación mediante un análisis de datos adecuado y graficando software. </li></ol></li></ol> 3. La bioluminiscencia de imágenes de Ca2 + mitocondrial Concentración <ol><li> La transfección de las neuronas del hipocampo en cultivo con el plásmido mitGAmut. NOTA: Las células se transfectaron primero con el plásmido que contiene una secuencia mitGAmut mitocondrias-orientada y un aequorina mutado carente de un sitio de unión de Ca2 + fusionado a la proteína fluorescente verde (GFP). Esta construcción detecta grandes aumentos en mitocondrial de Ca 2 + captación y permite la identificación de células transfectadas por la fluorescencia GFP. El plásmido fue desarrollado y proporcionado amablemente por el P. Brulet y compañeros de trabajo 18 (CNRS, París). <ol><li> Preparar Neurobasal TF, que contiene Neurobasal medio de cultivo, que carece de suero fetal bovino, B27, gentamicy 2 mM L-glutamina. </li><li> Preparar 50 l de Neurobasal TF PLUS 2,5 l reactivo de transfección en un vial (Solución A). Preparar 50 l de Neurobasal TF PLUS 4 g mitGAmut plásmido en un vial (Solución B). Añadir con cuidado la solución B sobre la solución A. Permitir la mezcla durante 20 minutos, sin agitar. </li><li> Transfiera los cubreobjetos que contienen las neuronas del hipocampo a nuevas placas multiplaca que contienen 200 l de TF Neurobasal fresco. </li><li> Añadir gota a gota 100 l de solución A + B sobre cada cubreobjetos. Incubar durante 30 min. Retire el medio. Lavar una vez las células con TF Neurobasal fresco. Devolver los cubreobjetos a la original Neurobasal medio de cultivo. </li><li> Neuronas de cultivo para un 24 h más a 37 ºC y 5% de CO 2 después de la transfección para permitir la expresión eficiente y la orientación de la sonda. </li></ol></li><li> Preparación de las soluciones de ensayo para imágenes de bioluminiscencia. <ol><li> Preparar soluciones HBS contienen NMDA 100 mM o 145 mM KCl comoanteriormente (Paso 2.1). Prepare la solución HBS conteniendo mM Ca 2 + 10 plus digitonin 100 mM. </li></ol></li><li> Reconstitución de aequorina mitocondrias-dirigida con coelenterazina n. <ol><li> Cubreobjetos de transferencia que contiene las neuronas del hipocampo transfectadas a una placa de cuatro pocillos que contenía 200 l de HBS. </li><li> Añadir 4 l de coelenterazina n (200 M) a 200 l de HBS para una concentración final de 4 mM y mezclar suavemente. Incubar durante 2 horas a RT (25 ºC) y en la oscuridad. </li></ol></li><li> Grabación de imágenes de bioluminiscencia de mitocondrial [Ca2 +]. <ol><li> Encienda el microscopio, la lámpara, el sistema de perfusión, cámara de bioluminiscencia y el ordenador. </li><li> Transferir a un cubreobjetos reconstituidas (37 ºC) cámara de perfusión termostatizada y perfundir continuamente con solución pre-calentado HBS a una velocidad de 5-10 ml / min. </li><li> El uso de un objetivo de 40X (aceite, NA: 1,3), seleccione un campo microscópico que contiene células que expresan la unapoaequorins como se muestra por la emisión de fluorescencia asociado con la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) utilizando los filtros FITC. Un campo típico puede contener 1-2 células transfectadas. Capturar la imagen de fluorescencia de GFP, usando una cámara CCD. </li><li> Apague la luz del microscopio. Quite la caja que contiene dicroico-ubicado en la vía de la luz. Apague la luz de excitación y cerrar la caja oscura de completa oscuridad. </li><li> Perfundir células a 5-10 ml / min con medio HBS con o sin soluciones de prueba pre-calentado a 37 ºC. </li><li> Captura de imágenes de emisión fotónicos cada 10 seg con una cámara de recuento de fotones manejado con un procesador de imagen. </li><li> Al final de cada experimento, permeabilizar las células con 0,1 mM de digitonina en 10 mM CaCl 2 en HBS con el fin de liberar a todos los restantes emisiones fotónicos. Nota: Estas emisiones fotónicas deben sumarse para estimar el total de emisiones fotónicas, un valor requerido para la calibración de Ca 2+ concentraciones &lt;./ li&gt; <li> Imágenes de bioluminiscencia tienda en el ordenador la imagen de fluorescencia de GFP asociado con capturaron antes de la proyección de imagen de recuento de fotones. </li></ol></li><li> Análisis de imágenes de bioluminiscencia que reflejan mitocondrial [Ca2 +]. <ol><li> Cuantificar las emisiones fotónicas utilizando software específico. Las emisiones fotónicos pueden ser convertidos a Ca 2+ mitocondrial libre de concentración ([Ca2 +] mit) utilizando el algoritmo descrito por Brini et al. 15. </li><li> Abra la imagen de fluorescencia de GFP experimento y. Seleccionar regiones de interés (ROIs) con la ayuda de software específico por dibujar la forma de las células transfectadas de acuerdo con las imágenes de fluorescencia capturados al comienzo del experimento. </li><li> Pegue las mismas regiones de interés en cada imagen. Total de emisiones fotónicas en cada retorno de la inversión se calculan con un software específico para obtener el valor de emisión de luminiscencia (L) para cada celda en cada punto en el tiempo. </li><li> Suma todo el emiss fotónicoiones en las imágenes de bioluminiscencia, incluidos los obtenidos después de digitonina permeabilización, utilizando el software específico, para obtener una imagen de bioluminiscencia que contiene todas las emisiones fotónicos. </li><li> Los valores de exportación de emisiones fotónicas para todas las regiones de interés para un software específico para los cálculos. Para ello, haga clic en &#39;Graph&#39; con el fin de calcular los valores de bioluminiscencia para cada ROI en cada momento. Seleccione &quot;valor total&quot; y &quot;utilizar ROI actual para todas las imágenes. Pulse &#39;calcular&#39;. Guarde el &#39;txt.file&#39; y exportar datos a una hoja de cálculo. Por cada ROI, [Ca 2 +] mit se calcula utilizando el siguiente algoritmo: [Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; dónde, R = [L / (L λ total)] 1 / n L es la luminiscencia emitida en el momento de la medición en cada región de interés. L total esla luminiscencia total restante después de la adición de los recuentos presentes en el tejido en ese momento en el momento de la medición para cada región de interés. λ, K TR, K R y n son constantes cuyos valores dependen combinación de aequorina (tipo salvaje o mutado) y coelenterazin utilizado (de tipo salvaje o de tipo n), así como la temperatura 16 de grabación. Para la combinación usada aquí (AEQ y coelenterzine n mutado), a 37 ºC, se utilizaron los siguientes valores: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1204 y λ = 0,138. </li></ol></li><li> Hacer los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de los aumentos en la bioluminiscencia en respuesta a cada estímulo mediante un análisis de datos adecuado y graficando software. </li></ol>

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Ninguno de los autores tiene intereses contrapuestos o intereses contrapuestos.

La remodelación de Ca 2 + homeostasis intracelular en el envejecimiento del cerebro se ha relacionado con la pérdida cognitiva, aumento de la susceptibilidad a daños isquémico, la excitotoxicidad y la neurodegeneración. Para investigar esta hipótesis in vitro, procedimientos de imagen Ca 2+ están disponibles. Por desgracia, las culturas viables de las neuronas del hipocampo de edad no son fiables. Recientemente, se ha observado que los cultivos a largo plazo de las neuronas del hipocampo d...

La excitotoxicidad es uno de los mecanismos más importantes que contribuyen al daño neuronal y muerte celular en insultos neurológicos tales como isquemia, y en algunas enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer 1. Este tipo de neurotoxicidad está mediada principalmente por el glutamato actúa sobre Ca 2+ receptores ionotrópicos, -permeable NMDA (NMDAR) 2. La exposición de las neuronas cultivadas a glutamato puede conducir a la excitotoxicidad 3, lo que provoca la apoptosis neuronal 4. Nosotros y otros han informado anteriormente de que la vulnerabilidad neuronal a la apoptosis inducida por NMDA puede cambiar con el desarrollo in vitro y el envejecimiento de 5-8. Es ampliamente aceptado que un aumento en la concentración de Ca2 + citosólico-libre ([Ca2 +] cyt) conduce a la activación de las células. Sin embargo, si este aumento es demasiado alta y / o sostenida suficiente, puede desencadenar la muerte celular 9. Por otra parte, se ha propuestoque excitotoxicidad requiere Ca 2+ mitocondrial captación 10, ya que el tratamiento de las neuronas con las neuronas protegidas desacoplador mitocondrial contra glutamato inducida por la muerte celular 11. Si mitocondrias ocupan demasiado Ca 2+, se puede producir la apertura de la transición de la permeabilidad mitocondrial, lo que lleva a la liberación de citocromo c y otros factores pro-apoptóticos, y la apoptosis que induce. Recientemente hemos demostrado que este mitocondrial de Ca 2 + captación está directamente relacionado con la susceptibilidad dependiente de la edad a la excitotoxicidad, midiendo directamente inducida por NMDA mitocondrial de Ca 2 + captación en las neuronas del hipocampo individuales 5, un método que se informa en este artículo. El hipocampo, involucrado en procesos fisiológicos tales como el aprendizaje, la memoria y otros procesos cognitivos 12, es altamente vulnerable al envejecimiento y los trastornos neurodegenerativos 13. Se ha propuesto que, después de varias semanas in vitro, se cultivaronlas neuronas del hipocampo muestran un número de características típicas de las neuronas de edad 14. En consecuencia, las neuronas del hipocampo en cultivo a largo plazo pueden proporcionar un modelo integral para investigar Ca 2+ mecanismos mediadas de mayor excitotoxicidad en el envejecimiento. El objetivo general del método presentado es, por lo tanto, para investigar los cambios sustanciales en el Ca 2+ intracelular homeostasis o Ca 2+ remodelación en el envejecimiento del cerebro incluyendo las respuestas el diferencial Ca 2+ provocadas por agonistas de los receptores NMDA en un largo plazo neuronas del hipocampo en cultivo . El método incluye una descripción detallada de la cultura de las neuronas del hipocampo de rata y el seguimiento de las concentraciones de Ca2 + citosólico y mitocondrial mediante fluorescencia y imágenes de bioluminiscencia en las neuronas individuales, respectivamente. Imágenes de fluorescencia de Ca 2+ citosólico en las neuronas cultivadas es un procedimiento estándar. Sin embargo, este método es menos fiable para subcelular Ca 2+ mediciones incluyendo mitocondrial de Ca2 +. Las razones para esto son la falta de orientación adecuada de sondas sintéticas y afinidad inapropiado para Ca 2+ concentraciones que pueden cambiar en las mitocondrias del bajo nivel M, incluso al nivel mM. El uso de Ca 2 + sondas basadas en proteínas como, por ejemplo, aequorina, ha permitido a la focalización a orgánulos subcelulares y el uso de derivados de diferentes Ca 2 + afinidades utilizando diferentes coelenterazines o sondas mutados que carecen de sitios de unión específica 15 Ca 2+. De esta manera, imágenes de bioluminiscencia de células que expresan aecuorina mitocondrias-dirigida puede permitir el seguimiento de mitocondriales de Ca 2 + concentraciones en neuronas individuales. Sin embargo, este procedimiento puede requerir el uso de cámaras de conteo de fotones o cámaras CCD ultrasensibles de imágenes de bioluminiscencia 16-18. Este método puede producir nuevos resultados que debe ser confirmada en más establmodelos cies de envejecimiento del cerebro como, por ejemplo, secciones de cerebro de animales viejos.

<table><tbody><tr><td>medio de cultivo neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>medio HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Medio F-12 de jamón</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I (de páncreas bovino)</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal Bobine</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio de 12 mm</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>placas multiplato de 4 pocillos</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petry</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazina n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 Microscopio TV</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de iluminación Xcite</td><td>Cámara de fluorescencia EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIM Cámara CCD de conteo de fotones</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8 Controlador de válvulas</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de calefacción SH-27B&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquacosmos Software</td><td>Hamamatsu Fotónica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; envejecido en las neuronas del hipocampo

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

La susceptibilidad a la muerte celular neuronal asociada a la neurodegeneración y la isquemia se incrementan excesivamente en el cerebro envejecido pero los mecanismos responsables están mal conocido. La excitotoxicidad, un proceso que se cree que contribuir al daño neuronal inducido por ambos insultos, está mediada por la activación de receptores de glutamato que promueve Ca 2 + afluencia y mitocondrial Ca 2 + sobrecarga. Un cambio sustancial en Ca 2 + homeostasis intracelular o remodelación de Ca2 + intracelular homeostasis puede favorecer el daño neuronal en las neuronas viejas. Para la investigación de Ca 2+ remodelación en el envejecimiento se han utilizado imágenes de células vivas en cultivos a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata que se asemejan en algunos aspectos las neuronas in vivo edades. Para este fin, las células del hipocampo son, en primer lugar, recién dispersa de nuevos hipocampo de rata nacida y chapada en cubreobjetos recubierto, vidrio poli-D-lisina. A continuación, los cultivos se mantienen en medios de comunicación controlados por varios días o varias wEeks para la investigación de las neuronas jóvenes y mayores, respectivamente. En segundo lugar, las neuronas cultivadas se cargan con fura2 y sometidos a mediciones de la concentración citosólica de Ca2 + utilizando imágenes de fluorescencia ratio digital. En tercer lugar, las neuronas cultivadas son transfectadas con plásmidos que expresan un tándem de aequorina baja afinidad y GFP apuntado a las mitocondrias. Después de 24 h, aequorina dentro de las células se reconstituye con coelenterazina y las neuronas son sometidos a imágenes de bioluminiscencia para la monitorización de la concentración de Ca 2+ mitocondrial. Este procedimiento de tres pasos permite la monitorización de citosólica y mitocondrial Ca 2 + respuestas a los estímulos relevantes como, por ejemplo, el agonista del receptor de glutamato NMDA y comparar si estas y otras respuestas están influenciadas por el envejecimiento. Este procedimiento puede producir nuevos conocimientos en cuanto a cómo el envejecimiento influencia citosólica y mitocondrial Ca 2 + respuestas a los estímulos seleccionados, así como las pruebas de medicamentos seleccionados destinadas a prevenir célula de la neuronamuerte en enfermedades relacionadas con la edad.

Aquí se describe un método simple para evaluar Ca 2+ remodelación y los efectos del NMDA en citosólica y mitocondrial [Ca2 +] en las neuronas de edad. La Figura 1 muestra el esquema del procedimiento para el aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratas neonatales. Antes de empezar, tenemos que prepararnos, recubiertos, cubreobjetos de vidrio de poli-D-lisina estériles y colocarlos en una placa de 4 pocillos. A continuación, las ratas neonatales son asesinados y el cereb...

La remodelación intracelular de Ca2+ en el envejecimiento puede contribuir a la excitotoxicidad y al daño neuronal, procesos mediados por la sobrecarga de Ca2+. Nuestro objetivo fue investigar la remodelación del Ca2+ en el cerebro envejecido utilizando imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia de Ca2+ citosólico y mitocondrial en cultivos a largo plazo de neuronas del hipocampo de rata, un modelo de envejecimiento neuronal.

Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Envejecido en las neuronas del hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar la remodelación del calcio en el cerebro envejecido mediante imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia del calcio citosólico y mitocondrial en cultivos a largo plazo de neuronas hipocampales de rata, que se considera un modelo del envejecimiento neuronal. Este método puede ayudar a comprender preguntas clave en el campo del envejecimiento, como la forma en que la remodelación del calcio intracelular contribuye a la excitotoxicidad y al daño neuronal, ambos relacionados con la sobrecarga de calcio. La principal ventaja de esta técnica es que permite seguir de cerca la remodelación del calcio en neuronas individuales utilizando cultivos en diferentes DÍS in vitro a partir del mismo espécimen. La duplicación de esta técnica surge a través de o terapia de un accidente cerebrovascular o enfermedad celular, porque constituye un objetivo novedoso relacionado con la sobrecarga de calcio en estas enfermedades asociadas a este agente.Después de ver este video, Jesús tendrá un buen entendimiento de cómo realizar imágenes de fluorescencia y resonancia de calcio citosólico y mitocondrial en cultivos a corto y largo plazo de neuronas del hipocampo de rata. Para comenzar este procedimiento, distribuya las laminillas sobre una tira de paraform en una placa de Petri. Luego, aplique 200 microlitros de poli-D-lisina al un miligramo por mililitro sobre cada laminilla y trátelas durante la noche.Al día siguiente, lave las laminillas con agua estéril doblemente destilada cada 15 minutos durante 90 minutos en condiciones estériles. Coloque las laminillas en la placa multipozo y manténgalas en una incubadora humectada a 37 grados Celsius y 5 %CO₂ hasta su uso. Para aislar las neuronas hipocampales, abra el cráneo de las crías de rata recién nacidas con tijeras estériles, extraiga el cerebro con una espátula y lávelo rápidamente en medio Ham's F12.Luego realice un corte diagonal con el bisturí en cada hemisferio y transfiéralo a la placa de Petri que contiene medio Hams F12 bajo el microscopio. Deseche las meninges. Identifique cuidadosamente el hipocampo en una ubicación característica cóncava sobre la corteza.Luego, separe el hipocampo del cortex tirando de él cuidadosamente y extráigalo usando tijeras de ojo. A continuación, transfiera los fragmentos de hipocampo a un vial que contenga 1,8 mL de solución de pepane previamente filtrada. Incúbelos a 37 grados Celsius con agitación suave ocasional durante 15 minutos.Luego, agregue 90 microlitros de la solución de ADN 1. Añada 50 microgramos por mililitro e incube durante otros 15 minutos. Después de eso, transfiera el tejido a un tubo cónico de 10 mililitros y lave los fragmentos con medio de cultivo neurobasal fresco.Obtenga una suspensión celular pasando los fragmentos de tejido a través de una pipeta plástica de cinco mililitros. A continuación, centrifugue la suspensión celular a 160 G durante cinco minutos. Posteriormente, retire el sobrenadante utilizando una pipeta Pasteur plástica estéril y suspenda cuidadosamente el botón celular en un mililitro de medio de cultivo neuro basal utilizando una pipeta automática de un mililitro.A continuación, mida la densidad celular utilizando una cámara de conteo de Neubauer. Añada 10 microlitros de suspensión celular y cuente el número de células bajo el microscopio. Luego realice los cálculos correspondientes para obtener entre 40 y 80 microlitros de suspensión celular, que contenga aproximadamente 30.000 células.En la placa de cuatro pocillos que contiene 500 microlitros de medio neurobasal, siembre alrededor de 30.000 células en cada pocillo que contenga cubreobjetos de vidrio. Incube las células de dos a cinco días in vitro para neuronas jóvenes o más de 15 días in vitro para neuronas envejecidas. En este procedimiento, incube las células con menos de 2:00 AM durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.Luego transfiera las laminillas a la cámara de perfusión. A continuación, coloque la cámara de perfusión con la laminilla en el portaobjetos del microscopio invertido. Seleccione el campo microscópico y perfunda las células continuamente con HBS precalentado.Posteriormente, ilumine epiluminiscencia las células a 340 y 380 nanómetros. Alternadamente, registre entonces la luz emitida a 520 nanómetros cada cinco a 10 segundos con una cámara de fluorescencia, que está filtrada por un espejo dicróico fira dos. Para analizar las imágenes de fluorescencia registradas, primero abra el archivo del experimento utilizando el software Aqua Cosmos, haga clic en relación y seleccione el rango de relación deseado.Calcule la relación píxel a píxel en las imágenes resultantes para obtener una secuencia de imágenes de relación. Luego reste el fondo ajustando el botón de eliminación de fondo. Después, presione iniciar cálculo.A continuación, presione el botón de toda la secuencia temporal y borre las ROI antiguas para el análisis cuantitativo de células individuales. Establezca nuevas ROI o las ROI correspondientes a las neuronas individuales. Para graficar las grabaciones individuales, exporte los valores de fluorescencia de razón correspondientes a cada ROI al programa Origin Lab haciendo clic en gráfico.Luego, haga clic en calcular y guarde el archivo TXT. Después de eso, realice el cálculo correspondiente para estimar el tamaño del aumento en la relación de fluorescencia en respuesta a cada estimulación para transfectar neuronas en cultivo con el plásmido mutante MIT. Primero, prepare 50 microlitros de la solución A que contiene el reactivo de transfección en un vial.A continuación, prepare 50 microlitros de la solución B que contiene el plásmido MIT ute en un vial. Añada la solución B a la solución A e incube durante 20 minutos. Después, transfiera las laminillas que contienen neuronas hipocampales a nuevas placas multipozo que contengan 200 microlitros de neuro basal TF fresco. Luego añada 100 microlitros de la solución A y B gota a gota sobre cada laminilla e incube durante 30 minutos.Después de 30 minutos, retire el medio. Lave las células con neuro basal tf fresco. Vuelva a colocar las laminillas en el medio de cultivo neuro basal original y cultive las células durante 24 horas después de la transfección para permitir una expresión y localización eficientes de la sonda.A continuación, agregue cuatro microlitros de sellador TEREZIN N a 200 microlitros de HBS para obtener una concentración final de cuatro micromolar. Mezcle suavemente e incube durante dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de dos horas, transfiera las laminillas a la cámara de perfusión y perfunda continuamente con solución de HBS precalentada.Para registrar las imágenes de bioluminiscencia de la concentración de calcio mitocondrial, seleccione el campo microscópico que contenga las células que expresan APO corin, tal como se muestra mediante la emisión de fluorescencia. A continuación, apague la luz del microscopio. Retire la caja que contiene el divisor dicróico ubicada en la trayectoria de la luz.Luego, apague la luz de excitación y cierre la caja oscura para lograr una oscuridad completa. Perfunda las células con medio HBS, con o sin soluciones de prueba previamente calentadas a 37 grados Celsius. A continuación, capture las imágenes de emisión fotónica cada 10 segundos mediante una cámara de conteo de fotones manejada con un procesador de imágenes.A continuación, agregue dig toin para liberar todos los fotones restantes y analizar las imágenes bioluminiscentes que reflejan el calcio mitocondrial. Abra la imagen de fluorescencia GFP. Seleccione ROIs individuales dibujando alrededor de las células transfectadas.Luego copie y pegue las mismas ROI en cada imagen de la secuencia. Capturas de pantalla. Después, exporte los valores de emisión fotónica para cada ROI al software específico para el cálculo; haga clic en gráfico.Con el fin de calcular los valores de cada ROI, seleccione el valor total y utilice el ROI actual en todas las imágenes. Posteriormente, presione calcular, guarde el archivo de texto y exporte los datos. A continuación, realice los cálculos correspondientes para estimar el tamaño del aumento en calcio mitocondrial en respuesta a cada estímulo mostrado.A continuación se muestran las imágenes representativas de campo brillante y pseudocolor de cultivos a corto y largo plazo de neuronas hipocampales antes y después de la estimulación con 100 micromolar y MDA; los colores más cálidos reflejan una concentración elevada de calcio citosólico. Estos trazos muestran grabaciones representativas a nivel de célula individual de la concentración de calcio citosólico en respuesta a 100 micromolar y MDA en cultivos a corto y largo plazo de neuronas hipocampales. Obsérvese que los aumentos en la concentración de calcio citosólico son mucho mayores en neuronas cultivadas a largo plazo que en las cultivadas a corto plazo.En este experimento, neuronas hipocampales cultivadas fueron transfectadas con la korina dirigida a mitocondrias de baja afinidad fusionada a GFP, incubadas con cuatro micromoles de sellador terezina, y sometidas a imágenes de bioluminiscencia de la concentración de calcio mitocondrial. Aquí se muestran las grabaciones que evidencian la emisión de fotones reflejando el calcio mitocondrial en neuronas hipocampales cultivadas a corto y largo plazo. Una concentración de 100 micromoles de MDA aumentó la concentración de calcio mitocondrial en neuronas envejecidas, pero no en neuronas hipocampales jóvenes cultivadas, tras seguir este procedimiento.Otros métodos como la evaluación de daño celular pueden combinarse con imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia en las mismas células para responder preguntas adicionales, como la susceptibilidad a la degeneración neuronal asociada con el envejecimiento y la isquemia.

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Investigación

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Neurociencia

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes...

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Fuente: Ulivi, A. F., et. al. Imagen longitudinal de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos. J. Vis. Exp. (2019) Este video muestra imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas piramidales marcadas fluorescentemente en un ratón vivo,  mostrando la preparación, la alineación de las cánulas y la obtención de imágenes de dendritas y espinas dendríticas para estudiar la estructura neuronal en la región CA1 del hipocampo.

Imágenes longitudinales de dos fotones de neuronas marcadas con fluorescencia en un hipocampo de ratón vivo 

Source: Calvo-Rodríguez, et al. Imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia de Ca style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'&gt;2+ en neuronas del hipocampo envejecidas. J. Vis. Exp. (2015). Este video demuestra el uso de imágenes de fluorescencia para medir los niveles de calcio citosólico en cultivos de hipocampo de...

Imágenes de calcio in vitro en cultivos de hipocampo de rata a corto y largo plazo

Fuente: Krishnamurthy, K. et al. Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica. J. Vis. Exp. (2021)Este video muestra imágenes de calcio en tiempo real para monitorear la actividad sináptica en neuronas mutantes de ELA que expresan un biosensor de calcio codificado genéticamente. Describe los pasos para preparar las neuronas para la obtención de imágenes, estimular la dinámica del calcio y registrar la fluorescencia para medir los...

Imágenes de fluorescencia de la dinámica sináptica del calcio en un modelo in vitro de esclerosis lateral amiotrófica

Fuente: Kamei, R., et. al., Imágenes crónicas de dos fotones in vivo de la microglía en el hipocampo del ratón. J. Vis. Exp. (2022)El video demuestra la configuración y el proceso de obtención de imágenes para la microscopía de dos fotones in vivo de la dinámica microglial en el hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) y la circunvolución dentada, lo que garantiza una alineación óptica óptima y una evaluación de la integridad estructural.

Imágenes in vivo de dos fotones de la dinámica microglial en el hipocampo del ratón

Aquí presentamos una novela Ca 2+ -Imagenología enfoque utilizando un reportero bioluminiscente. Este método utiliza una construcción GFP-aequorina fundida que se une a Ca 2+ y emite luz, eliminando la necesidad de excitación luz. Significativamente este método permite la proyección de imagen continua de largo, el acceso a las estructuras cerebrales profundas y alta resolución temporal.

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Aprende a investigar el remodelado del calcio en el envejecimiento neuronal mediante imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia en cultivos de neuronas de hipocampo de rata. Este método permite estudiar la excitotoxicidad y el daño neuronal asociados.

Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca

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