Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

El objetivo general de este método es etiquetar las neuronas y sus proyecciones axonales con el fin de rastrear sus conexiones con los núcleos cerebrales objetivo o de origen de interés. Este método ayuda a responder preguntas clave en neurociencia, como los patrones de conectividad entre diferentes áreas o subpoblaciones neuronales del cerebro, así como su importancia funcional para un circuito neuronal determinado. La principal ventaja de esta técnica es el aumento de la precisión del objetivo durante las inyecciones de trazadores.

Esto se logra mediante el uso de equipos ópticos básicos para visualizar núcleos cerebrales marcados con fluorescencia. Otra ventaja de este método es que permite el genotipado no invasivo de ratones que expresan proteínas fluorescentes bajo el control de promotores neuronales. Al genotipar cachorros, verifique la expresión de los marcadores fluorescentes respectivos utilizando un puntero láser con la longitud de onda de excitación adecuada.

Al mismo tiempo, use gafas de filtro que bloqueen la longitud de onda de excitación, pero pasen la longitud de onda de emisión. Apunte el láser a la parte posterior de la cabeza o a la médula espinal del cachorro en cuestión. Tenga cuidado de no hacer brillar el láser en los ojos de la P y mantenga la exposición al láser corta.

Los marcadores fluorescentes excitados deben ser visibles a través de la piel. Cuando el ratón es mayor, se pueden identificar las neuronas individuales de los tejidos recolectados. Después de anestesiar al ratón y comprobar si hay ausencia de reflejos, retire la piel sobre el cráneo, corte la piel a lo largo de la parte posterior de la cabeza hasta la sección media del cráneo.

Incluso en ratones mayores de más de un mes, la fluorescencia se puede observar a través de los ojos del animal. A continuación, utilizando PBS trans Cardi congelado perfunde el marcador positivo animal con una aguja de calibre 30, después de cinco a 10 minutos, se eliminará la mayor parte de la sangre. A continuación, extirpa el cerebro y disecciona la región de interés.

Aquí, el cuerpo trapezoidal, que son dos bulbos prominentes en la región ventral del cerebro, contiene la región de interés. Los núcleos ventrales de los cuerpos trapezoidales o VNTB comienzan con la transferencia de la región encefálica explantada de interés a una placa de solución diseccionante oxigenada. Allí. Asegure el plano con agujas de jeringa de calibre 30 para que el área de inyección sea accesible en la parte superior.

Para la inyección, utilice pipetas de inyección tiradas de vidrio de silicato Bo que se fabrican en tres o cuatro ciclos de extracción. Cargue la pipeta con la siguiente solución. La subunidad B de la toxina del cólera se conjuga con Alexa FLUORA 4 5 55, que es principalmente para el transporte retrógrado.

Con el puntero láser y las pipetas de inyección, todas montadas y listas para usar, proceda a apuntar el haz a la región o células cerebrales marcadas que se van a inyectar. Observe el campo a través de las gafas de filtro de paso de banda para ver a qué neuronas dirigirse con la pipeta de inyección. Utilice el micromanipulador para colocar la pipeta en el área de interés.

Luego, usando un inyector de presión configurado para administrar pulsos de 50 milisegundos a 15 PS, inyecto la sustancia trazadora en dos a 10 pulsos. Deje que pasen de 10 a 15 segundos entre pulsos para que el tinte inyectado pueda extenderse. Al inyectar tetraetilo rumina, estimule eléctricamente la región con el electrodo estimulante que administra pulsos TTL.

Asegúrese de que el electrodo esté conectado a tierra en la solución del baño. Emite ocho pulsos TTL a ocho voltios, cada uno de 50 milisegundos de duración con intervalos de 50 milisegundos. Estimula la región con 10 a 20 repeticiones de pulso durante varios minutos.

Los núcleos cerebrales varían en tamaño, densidad neuronal y tipos de células. Esto significa que es posible que sea necesario ajustar la duración y el número de presiones y/o pulsos eléctricos para lograr resultados óptimos de etiquetado para una región cerebral determinada. Con el láser y las gafas, compruebe la señal del trazador fluorescente.

El tinte debe ser absorbido por las células y esparcido alrededor del área inyectada. Después de la inyección, incubar los troncos encefálicos en líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado a temperatura ambiente durante una a cuatro horas. Mantenga la oxigenación durante la incubación, luego fije el tejido en aldehído paraformado al 4%.

En PBS durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente, el tejido se puede cortar y montar una inyección intergrado en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal o VNTB. El uso de tetraetil rodina dextrina muestra que las proyecciones del VNTB se extienden hasta el núcleo medial del cuerpo trapezoidal, o MNTB. A continuación, se inyectó al MNTB chole toína, subunidad B, que retro se etiquetó en gran medida como VNTB.

Con mayor detalle, los somas de las células VNTB entéricas glicánicas parecían ser los siguientes. Al MNTB se le inyectó la etiqueta retrógrada dextrina tri. A diferencia del patrón punteado del etiquetado CTB, el marcaje trit de dextrina era denso y similar al GOGI.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar las neuronas y sus procesos con mayor precisión. La técnica demostrada le ayuda a identificar áreas cerebrales y subpoblaciones neuronales que participan en un circuito neurológico determinado Una vez dominado, el procedimiento de inyección se puede realizar en unos 30 minutos si se realiza correctamente. Este procedimiento puede combinarse fácilmente con otros métodos como la inmunoquímica o la limpieza del cerebro para responder a preguntas adicionales sobre la morfología, la direccionalidad o la funcionalidad de las proyecciones neuronales y otras estructuras neuronales.