Name: La medición de la dispersión no linealidades de una nanopartícula Individual plasmónicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: Aprende a medir las no linealidades de dispersión en nanopartículas plasmónicas individuales para mejorar la resolución en microscopía óptica. Este método saturable ofrece contraste no fotoquímico y superresolución estable.

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Este trabajo está respaldado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología bajo NSC-101-2923-M-002-001-MY3 y NSC-102-2112-M-002-018-MY3. Esta investigación también cuenta con el apoyo de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) a través del "Programa de Financiación para la Próxima Generación de Investigadores Líderes en el Mundo (Programa NEXT)", iniciado por el Consejo de Política Científica y Tecnológica (CSTP) y el Programa CORE Asiático de JSPS.

1. GNS preparación de muestras <ol><li> Antes de preparar la muestra, la solución de coloide sonicado 1 ml GNS durante al menos 15 min a aproximadamente 40 kHz para evitar la agregación de partículas, que puede causar el pico LSPR se desplace. </li><li> Caída de 100 a 200 l de GNS coloide en un portaobjetos de vidrio con silicato de aluminio y magnesio (MAS) de recubrimiento comercial para fijar el GNSS. </li><li> Después de al menos 1 minuto, retire el coloide adicional mediante el lavado con agua destilada. El tiempo de espera depende de la densidad de distribución requerida del GNSS. Típicamente, 1-3 resultados min en una densidad adecuada que permita que las partículas se pueden identificar fácilmente ya que la mayoría de ellos están aislados unos de otros. Agregación significativa puede ocurrir si el tiempo de espera es demasiado largo. </li><li> Secar la muestra purgando con gas nitrógeno. </li><li> (Opcional) Para asignar el GNSS en el cristal de alta resolución, realice microscopía electrónica de barrido (SEM) en esta etapa 23. Una imagen de ejemplo se proporciona en Figure 1, que muestra la densidad característica del GNSS. Utilice una emisión de campo SEM para adquirir la imagen. Una vez que el aceite se añade sobre la muestra (paso siguiente), será difícil para eliminar el aceite y observar la muestra con SEM. </li><li> Añadir una gota de aceite con el mismo índice de refracción sobre la muestra para cubrir el GNSS y para eliminar la fuerte reflexión desde el sustrato de vidrio. </li><li> Coloque una cubierta de vidrio en la parte superior de la muestra y sellarlo con esmalte de uñas. </li><li> Espere al menos 5 minutos hasta que el esmalte de uñas se seque. La muestra está lista ahora. </li></ol> 2. Alineación de Inicio incorporado confocal Microscopio <ol><li> Vea la Figura 2 para el esquema de configuración. Alinear el blanco camino iluminación de luz del cuerpo del microscopio en sí. Encienda la fuente de luz halógena del microscopio, y seguir el manual del fabricante del microscopio para lograr la condición de iluminación Köhler. Asegúrese de que los blancos rayos de luz halógena son casi paralelos al fondo deabertura del objetivo, que se refleja parcialmente por el divisor de haz 50/50, y luego se propagan hacia el láser. </li><li> Encienda los espejos galvano para garantizar que se mantienen en la posición inicial correcta, es decir, en el centro del rango de exploración. </li><li> Coloque al menos dos objetivos, hechos por una delgada hoja de papel con anillos concéntricos en él, a lo largo de la trayectoria de luz de halógeno, y alinearlos con el haz de halógeno. </li><li> Para llevar a cabo de imagen, seleccione el láser de 532 nm. Para realizar mediciones de espectroscopia, seleccione el láser súper continuo. Durante la alineación, la potencia de los láseres debe ser inferior a 10 mW en la abertura posterior de el objetivo de evitar la no linealidad. Entonces, colimar el haz de láser incidente opuesto a la viga de halógeno saliente con la ayuda de los dos objetivos. Cuando este proceso se haya completado, la alineación aproximada del rayo láser se ha logrado. </li><li> Alinear el rayo láser a través del centro de la abertura posterior de la lente objetivo. Por lo general, utilice un oil objetivo de inmersión. Añadir una gota de aceite entre la lente objetivo de inmersión en aceite y la muestra GNS. Use un tubo fotomultiplicador (PMT) como el detector para recoger las señales de dispersión de los GNSS. </li><li> Coloque un alfiler de 20 micras de diámetro delante de la PMT para bloquear fuera de foco de dispersión señales. Encienda los espejos galvano y PMT (a través del software de fabricación casera), ajuste la posición del agujero de alfiler y la altura de la etapa de la muestra para maximizar las señales de retrodispersión del GNSS, y luego observar un GNS individuales en una pantalla de ordenador. Una imagen muestra xy del GNSS con la alineación correcta se muestra en la Figura 2B. </li><li> Ligeramente cambiar la altura de la etapa de la muestra para comprobar la concentricidad del foco. Si no es concéntrico, ajustar la viga con los dos espejos en frente del escáner hasta el centro de la GNS se mantiene en la misma posición mientras se cambia la altura de la etapa de la muestra. Asegúrese de que la imagen xz del PSF es similar a la figura 2Cpara asegurar la alineación del haz correcta. Procesar estas dos imágenes con paso bajo y filtros suaves de Gauss. </li></ol> 3. Caracterización de la dispersión de no linealidad <ol><li> A baja intensidad de excitación (menos de 10 4 W / cm2), adquirir una imagen de nanopartículas de oro, siguiendo el protocolo 2.6. </li><li> Abre la imagen en ImageJ (o de cualquier otro software de análisis de imágenes). Dibuja una línea a través de uno de los GNSS en la imagen (ver Figura 2B), y el uso de Análisis -&gt; perfil Parcela de las herramientas ImageJ para recuperar el perfil de intensidad de dispersión. Montar el perfil del PSF elegido por una función de Gauss: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq2.jpg" /> donde Y es el valor de lectura PMT, y 0 es el valor de fondo (si lo hay), A es la amplitud de pico, w es la anchura, x es la coordenada espacial, y x c es el centro de coordinate de la función de Gauss. La FWHM del PSF correspondiente es (½ln2) w. Sobre la base de la apertura numérica (NA) del objetivo, la FWHM teórico del PSF confocal se puede estimar en aproximadamente 0.43l / NA, donde l es la longitud de onda de excitación. Compare estos dos números para comprobar la alineación del sistema de imagen. </li><li> Aumentar la intensidad de excitación cambiando manualmente el filtro de densidad neutra (ND) en la figura 2A, y registrar las imágenes de retrodispersión en cada nivel de intensidad. Tome el valor de la señal de dispersión desde el centro de cada uno GNS a diferentes intensidades de excitación, y trazar la curva de dispersión de las señales contra intensidades de excitación. Comprobar la linealidad de los primeros puntos, que debe exhibir una relación lineal cuando la intensidad de excitación es adecuadamente baja. Dibuja una línea sobre la base de ajuste lineal de los primeros puntos. Si la intensidad de dispersión de los puntos posteriores caen por debajo de la tendencia lineal, saturation se ha producido. </li><li> Después de observar la dispersión saturable, disminuir gradualmente la intensidad por debajo del umbral de saturación, y la imagen de la misma GNSS de nuevo para garantizar la reversibilidad de los comportamientos no lineales. </li></ol> 4. Medición de un Dispersión del Espectro de un Oro Nanosphere Individual <ol><li> Para medir el espectro de retrodispersión de una sola GNS, utilizar el láser super-continuo como la fuente de láser. La longitud de onda inicial del láser varía de 450 nm a 1750 nm. Para eliminar el exceso de energía infrarroja que podrían causar daños a la muestra y los componentes ópticos, coloque uno o dos espejos justo después de que el láser súper-continuo para reflejar la luz visible, y el uso del haz vertederos para recoger el exceso de luz infrarroja. </li><li> Siga los procedimientos de alineación de la Sección 2 para dirigir el láser súper continuo en el microscopio láser confocal de barrido. Use una banda ancha 50/50 BS para asegurar una cobertura espectral a través de todo el rango visible. </li><li> Adquirir unaimagen de los GNSS en vidrio. Localiza una sola GNS en la imagen, y fijar el foco de la luz de banda ancha incidente sobre la partícula. </li><li> Use un espejo flipping en frente de la PMT para dirigir la señal de retrodispersión hacia el espectrómetro, que está equipado con un dispositivo de acoplamiento de carga, y luego tomar un espectro de los GNS individuales seleccionados. Tenga cuidado de que el espectro aquí es una mezcla de GNS y dispersión de fondo debido a reflexiones de otras superficies. </li><li> Cambie de nuevo al detector PMT, y tomar otra imagen para confirmar que la posición de la partícula no ha cambiado. A continuación, cambiar el enfoque a un punto en el cual ninguna partícula está presente. Cambie de nuevo al espectrómetro, y tomar uno de espectro más, lo que representa el fondo. </li><li> Restar el espectro de fondo de la etapa 4.5 a partir del espectro de la etapa 4.4 para obtener un espectro de retrodispersión clara de una sola GNS. </li></ol> 5. Alineación de SAX Microscopio <ol><li> Vea la Figura 3para el esquema del microscopio SAX, donde se obtiene una modulación temporal sinusoidal ideales de la frecuencia de batido entre dos moduladores acústico-óptica (AOMs). En primer lugar, ajustar el tamaño del haz del láser para cumplir el requisito de los AOMs posteriores. Dividir la luz láser de 532 nm en dos haces mediante un divisor de haz 50/50. </li><li> Guía a los dos haces a través de los dos AOMs, con un solo haz de cruce a través de cada OMA. Las frecuencias de modulación de las dos AOMs deben ser diferentes. Por ejemplo, uno puede ser en 40,000 MHz y la otra a 40,010 MHz, dando una diferencia de frecuencia de 10 kHz. Esta frecuencia diferencia será la frecuencia de modulación fundamental f m para las señales de SAX. </li><li> Tome el primer orden haces difractados de ambos AOMs, y combinar los dos haces con cualquier otro divisor de haz 50/50. Ajuste los espejos después de los AOMs para colimar los dos haces. </li><li> Añadir un fotodetector que está conectado a un osciloscopio para controlar la modulatio temporalnorte. Dividir una pequeña porción del láser con un portaobjetos de vidrio, y enviarlo al fotodetector, como se muestra en la Figura 3. Con correcta de modulación y la superposición del haz, observar modulación de intensidad sinusoidal a la frecuencia principal f m, similar a la de la forma de onda mostrada en la Figura 4. Nota: El fondo de la modulación debe ser lo más bajo posible para lograr la máxima profundidad de modulación. Además, utilice la función de análisis de Fourier del osciloscopio para comprobar que la distorsión armónica de la modulación está disminuyendo. Para lograr la implementación SAX éxito, asegurar una modulación de la intensidad de excitación sinusoidal perfecta con no linealidad inicial minimizado. </li><li> Desconecte la salida eléctrica del fotodetector del osciloscopio y conectarse a la entrada de referencia de un amplificador lock-in. </li><li> Como se muestra en la Figura 3, alinear el haz de láser en el sistema confocal siguiendo los protocolos anteriores. MARIDOere, conecte la salida eléctrica de la PMT al amplificador lock-in como la entrada de señal. </li><li> Utilice una cubierta de vidrio en blanco como la muestra, y comprobar la linealidad del sistema de detección eléctrica aumentando gradualmente la potencia de excitación ,, como se muestra en la Figura 5, en el que el detector es lineal por debajo de un valor de lectura de 1-V. En todas las mediciones posteriores, tenga cuidado para restringir la lectura por debajo de este valor. </li><li> Ajuste la salida del amplificador lock-in para exportar la magnitud absoluta de la señal de tensión. Al cambiar el ajuste en el canal de referencia componente armónico, obtener las amplitudes de las señales de Sax, A 1, A 2, y así sucesivamente. </li><li> Exportar la señales lineales y no lineales del amplificador lock-in a una tarjeta de adquisición de datos, que también recibe las señales de voltaje de conducción de los espejos galvano de exploración de trama. Con la ayuda de un programa Labview personalizado, sincronizar las señales del amplificador y el lock-ingalvano espejos para formar una imagen. </li><li> Para optimizar la relación señal-ruido en las imágenes, seleccionar adecuadamente la adquisición de píxeles y tiempos de integración del amplificador lock-in. Por ejemplo, cuando la frecuencia de modulación f m principal de la excitación es de 10 kHz, es decir, cuando el período es de 100 microsegundos, establecer el tiempo de integración del amplificador lock-in que ser al menos tres veces más largo que el período. Añadiendo el tiempo del movimiento del espejo galvano, la velocidad de adquisición se fija en 1.500 píxeles por segundo en el modo de imagen SAX. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En el protocolo, hay varios pasos críticos. En primer lugar, en la preparación de las muestras, la densidad de las nanopartículas no debería ser demasiado alta, para evitar el acoplamiento entre partículas plasmónica. Si dos o más partículas son muy cerca uno del otro, los resultados de acoplamiento en la longitud de onda LSPR cambiando hacia longitudes de onda más largas, reduciendo así significativamente la no linealidad. Sin embargo, esta técnica de imagen en realidad los mapas de la distribución de los modos plasmón...

El estudio de la plasmónica ha atraído un gran interés por sus aplicaciones en muchos campos diferentes 1-4. Uno de los campos más investigados en la plasmónica es plasmónica de superficie, en el que la oscilación colectiva de electrones de conducción parejas con una onda electromagnética externa en una interfaz entre un metal y dieléctrico. Plasmónica de superficie ha sido explorado por sus potenciales aplicaciones en óptica sublongitud de onda, biofotónica, y microscopía 5,6. El fuerte aumento del campo en el volumen ultra pequeño de nanopartículas metálicas debido a localizada resonancia de plasmón superficial (LSPR) ha atraído una amplia atención, no sólo por su excepcional sensibilidad a los tamaños de partículas, forma de las partículas, y las propiedades dieléctricas del medio circundante 7 -10, pero también debido a su capacidad para estimular efectos ópticos no lineales inherentemente débiles 11. La sensibilidad excepcional de LSPR es valiosa para bio-detección y casi fietécnicas de imagen ld 12,13. Por otro lado, el aumento de la no linealidad de las estructuras plasmónicas puede ser utilizado en circuitos integrados fotónicos en aplicaciones tales como conmutación óptica y procesamiento de señales totalmente óptico 14,15. Es bien sabido que la absorción plasmónica es linealmente proporcional a la intensidad de excitación a niveles de baja intensidad. Cuando la excitación es lo suficientemente fuerte, la absorción alcanza la saturación. Curiosamente, a intensidades más altas, la absorción aumenta de nuevo. Estos efectos no lineales se llaman absorción saturable (SA) 15-17 y revertir la absorción saturable (RSA) 18, respectivamente. Se sabe que debido a la LSPR, la dispersión es particularmente fuerte en las estructuras plasmónicas. Basado en electromagnetismo fundamentales, la respuesta de la dispersión frente a la intensidad incidente debe ser lineal. Sin embargo, en las nanopartículas, dispersión y absorción están estrechamente vinculados a través de la teoría de Mie, y ambos pueden ser correoxpressed en términos de partes real e imaginaria de la constante dieléctrica. Bajo el supuesto de que una sola GNS se comporta como un dipolo bajo iluminación de luz, el coeficiente de dispersión (sca Q) y coeficiente de absorción (Q abs) a partir de una única nanopartícula plasmónica de acuerdo con la teoría de Mie se pueden expresar como 19 <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq1.jpg" /> donde x es 2 πa / λ, a es el radio de la esfera, y m es 2 ε m / ε d. Aquí, m ε y ε d corresponden a las constantes dieléctricas del metal y de los dieléctricos que rodean, respectivamente. Puesto que la forma del coeficiente de dispersión es similar a la de THcoeficiente de absorción de correo, por lo tanto se espera para observar la dispersión saturable en una sola nanopartícula plasmónica 20. Recientemente, la dispersión saturable no lineal en una partícula plasmónica aislado se demostró por primera vez 21. Es notable que en la saturación profunda, la intensidad de dispersión de hecho disminuyó ligeramente cuando la intensidad de excitación aumenta. Aún más notablemente, cuando la intensidad de excitación continuó aumentando después de la dispersión se saturó, la intensidad de dispersión se levantó de nuevo, que muestra el efecto de dispersión inversa saturable 20. De longitud de onda y los estudios dependientes del tamaño han demostrado una fuerte relación entre LSPR y no lineales de dispersión 21. La intensidad y longitud de onda de dispersión de dependencias plasmónica son muy similares a los de la absorción, lo que sugiere un mecanismo común que subyace a estos comportamientos no lineales. En términos de aplicaciones, es kno bienwn que no linealidad ayuda a mejorar la resolución de la microscopía óptica. En 2007, la excitación saturada se propuso (SAX) microscopía, que puede mejorar la resolución mediante la extracción de la señal saturada a través de una modulación sinusoidal temporal del haz de excitación 22. Microscopía SAX se basa en el concepto de que, para un punto focal del láser, la intensidad es más fuerte en el centro que en la periferia. Si la señal (ya sea de la fluorescencia o dispersión) exhibe un comportamiento de saturación, la saturación debe comenzar desde el centro, mientras que la respuesta sigue siendo lineal en la periferia. Por lo tanto, si hay un método para extraer sólo la parte saturada, dejará sólo la parte central mientras rechaza la parte periférica, mejorando así de manera efectiva la resolución espacial. En principio, no existe límite de ningún menor resolución en microscopía SAX, siempre que se alcance la saturación tan profundo y no hay daños muestra debido a la iluminación intensa. Se ha demostrado que la resolution de imágenes de fluorescencia se puede mejorar significativamente mediante la utilización de la técnica de SAX. Sin embargo, la fluorescencia sufre del efecto photobleaching. Combinando el descubrimiento de la no linealidad de dispersión y el concepto de SAX, microscopía de super-resolución basada en la dispersión se puede realizar 21. En comparación con microscopías de super-resolución convencionales, la técnica basada en la dispersión proporciona un método de contraste no blanqueo novela. En este trabajo, una descripción paso a paso se da a esbozar los procedimientos necesarios para obtener y extraer la no linealidad de la dispersión plasmónica. Se describen métodos para identificar las no linealidades introducidas por dispersión cambiando la intensidad incidente. Más detalles serán proporcionados a desentrañar cómo estos afectan linealidades imágenes de nanopartículas individuales y cómo resolución espacial se pueden mejorar en consecuencia por la técnica de SAX.

<table><tbody><tr><td>cuerpo de microscopio</td><td>Olympus, Japón</td><td>Lente de objetivo BX-51</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus, Japón</td><td>UPlanSapo, 100X, NA 1.4</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro de 80 nm</td><td>BBI Solutions, Reino Unido</td><td>EM. Láser supercontinuo GC80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fianium, Reino Unido</td> Espejos dieléctricos de banda ancha <td>SC400-2-PP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs, EE. UU.</td><td>Emisión de campo BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>JEOL, Japón</td><td>JSM-6330F</td><td></td></tr><tr><td>espectrómetro</td> opcional <td>Andor Technology, Reino Unido</td> Dispositivo de carga acoplada <td>Shamrock 163</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor Technology, Reino Unido</td><td>iDus Moduladores acústico-ópticos DV420A-OE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IntraAction Corp., EE. UU.</td><td>AOM-402AF1</td><td></td></tr><tr><td>amplificador de bloqueo</td><td>Stanford Research Systems, EE. UU.</td><td>SR-830</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio deslizante recubierto de</td><td>MAS Matsunami Glass, Japón,</td> <td>S9215</td><td></td></tr></tbody></table>

la medición de la dispersión no linealidades de una nanopartícula individual plasmónicas

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Plasmónica, que se basa en la oscilación colectiva de electrones debido a la excitación de la luz, implica campos eléctricos locales fuertemente mejorados y, por lo tanto, tiene aplicaciones potenciales en óptica no lineal, que requiere una intensidad óptica extraordinaria. Una de las no linealidades más estudiadas en plasmónica es la absorción no lineal, incluyendo los comportamientos de saturación y saturación inversa. Aunque la dispersión y la absorción en nanopartículas están estrechamente correlacionadas por la teoría de Mie, no ha habido informes de no linealidades en la dispersión plasmónica hasta hace muy poco. 
El año pasado, no solo se demostró por primera vez la saturación, sino también la saturación inversa de la dispersión en una partícula plasmónica aislada. Los resultados mostraron que la dispersión saturable exhibe una clara dependencia de la longitud de onda, que parece estar directamente relacionada con la resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR). Combinados con las mediciones dependientes de la intensidad, los resultados sugieren la posibilidad de un mecanismo común subyacente a los comportamientos no lineales de dispersión y absorción. Estas no linealidades de la dispersión de una sola nanosfera de oro (GNS) son ampliamente aplicables, incluso en microscopía de superresolución e interruptores ópticos. 
En este artículo, se describe en detalle cómo medir la no linealidad de la dispersión en un solo GNP y cómo emplear la técnica de superresolución para mejorar la resolución de imágenes ópticas basada en la dispersión saturable. Este descubrimiento presenta la primera microscopía de superresolución basada en la dispersión no lineal, que es un nuevo método de contraste sin blanqueo que puede alcanzar una resolución tan baja como l/8 y potencialmente será útil en biomedicina y estudios de materiales.

La Figura 6 muestra el espectro medido desde un 80 GNS nm. Una curva calculada sobre la base de la teoría de Mie se da en la misma parcela, mostrando excelente acuerdo. El pico LSPR es de alrededor de 580 nm. En el siguiente experimento, la longitud de onda del láser era 532 nm, que fue elegido ya que se encuentra dentro de la banda plasmónica para mejorar la dispersión óptica con efecto plasmónica y permitir la dispersión de saturación 21. La Figura 7 pre...

Se descubrieron dispersiones saturables e inversas saturables en partículas plasmónicas aisladas y se adoptaron como un nuevo método de contraste sin blanqueo en microscopía de superresolución. Aquí se explican en detalle los procedimientos experimentales de detección y extracción de dispersión no lineal, así como cómo mejorar la resolución con la ayuda de la microscopía de excitación saturada.

La medición de la dispersión no linealidades de una nanopartícula Individual plasmónicas

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

El objetivo general de este experimento es demostrar la mejora de la resolución mediante dispersión no lineal proveniente de nanoestructuras plasmónicas. En el campo de la microscopía óptica, el contraste y la resolución son los factores más importantes. Nuestra técnica se extiende al campo de la superresolución con un nuevo contraste basado en dispersión.La principal ventaja de esta técnica es que la dispersión de las nanopartículas es intensa, altamente no lineal y no presenta desvanecimiento. Quien demostrará el procedimiento será Hsuan Lee, un estudiante destacado de mi laboratorio.El experimento se realizará sobre una mesa óptica, donde hay un microscopio y dos fuentes láser. La primera fuente láser es un láser de onda continua de 532 nanómetros utilizado para la obtención de imágenes.El segundo es un láser de supercontinuo utilizado para mediciones de espectroscopía. Este es un esquema de la configuración básica tanto para imágenes como para espectroscopía. Las muestras se montarán sobre una etapa de posicionamiento piezoeléctrica en el microscopio confocal.La luz del láser de 532 nanómetros atraviesa un filtro de densidad neutra. El haz es dirigido por un divisor de haz hacia espejos galvanométricos que proporcionan un escaneo en raster en el plano focal del objetivo del microscopio confocal. La luz dispersada hacia atrás es recogida por el objetivo y enfocada en el detector.Comience alineando la trayectoria de iluminación con luz blanca del microscopio. Utilice la fuente de luz halógena en iluminación de condensador. Para verificar la alineación del diafragma interno, asegúrese de observar bordes nítidos en el octágono mediante el ocular o la CCD.A continuación, utilice un trozo de papel para verificar la trayectoria externa de la luz. Compruebe que los haces sean parcialmente reflejados por el divisor de haz y se propaguen hacia el láser moviendo el papel a lo largo de la trayectoria de la luz. Ahora, tenga listos objetivos de papel para ayudar en el alineamiento adicional.Los objetivos deben estar sobre papel delgado con anillos concéntricos. Coloque estos objetivos a lo largo del trayecto del haz de manera que queden alineados con el haz halógeno. Aquí, un objetivo está posicionado en la abertura trasera del lente objetivo.Este es otro objetivo colocado a lo largo del trayecto óptico. A continuación, encienda el láser de 532 nanómetros utilizado para la formación de imágenes con el fin de alinearlo. Utilice los objetivos de papel para ayudar a colimar la luz láser incidente opuesta al haz de halógeno.Continúe con el alineamiento más preciso del haz láser antes de retirar los objetivos y continuar. Después de alinear el láser, obtenga una muestra preparada de nanoesferas de oro para el experimento. Esta muestra contiene nanoesferas de oro de 80 nanómetros en aceite.La mezcla se sella entre dos placas de vidrio. Continúe montando la muestra en la platina del microscopio y agregando aceite de inmersión. En este punto, prepare el sistema de detección para la adquisición de imágenes.Recopile la luz dispersada con el tubo fotomultiplicador al final del trayecto óptico. En dirección opuesta al trayecto del haz, coloque un orificio de 20 micrómetros de diámetro para bloquear la luz dispersada desenfocada que llega al tubo fotomultiplicador. Continúe con la adquisición de imágenes encendiendo los espejos galvanométricos y el fotomultiplicador.Observe el monitor del ordenador para ver el escáner trasero en la señal de las nanopartículas de oro. Maximice la señal del escáner trasero ajustando la posición del diafragma y la altura del portaobjetos. Tras alinear el microscopio confocal, caracterice la no linealidad de dispersión de la muestra.Para hacer esto, primero utilice un medidor de potencia para medir la potencia del láser después de la lente del objetivo. La lectura debe ser inferior a 10 microvatios, lo que corresponde a una intensidad de excitación menor a 10 a la cuarta potencia vatios por centímetro cuadrado. Luego, adquiera una imagen de las nanopartículas de oro utilizando el tubo fotomultiplicador.Abra la imagen capturada en un software de análisis de imágenes para caracterizar el perfil de intensidad de dispersión. Seleccione una nanosfera de oro entre las que aparecen en la imagen y trace una línea a través de ella. Luego, siga los pasos requeridos en el software para obtener el perfil de dispersión.Ajuste el perfil a una gaussiana, lo que permite una verificación adicional del alineamiento del sistema de imagen. Ahora, comience a escanear sistemáticamente a través de las intensidades de excitación. Primero, cambie el filtro de densidad neutra para aumentar la intensidad de excitación.Determine la nueva intensidad de excitación y registre la imagen de dispersión hacia atrás en el nuevo nivel de intensidad. Utilice la imagen para extraer un perfil de dispersión de una nanosfera como antes. Represente gráficamente el perfil de dispersión e identifique su valor en el centro de la esfera como la señal de dispersión.Repita estos pasos varias veces para construir una gráfica de la señal de dispersión frente a la intensidad de excitación. En esta figura, los puntos azules representan los datos. La línea roja es un ajuste polinómico.Existe una relación lineal entre la señal de dispersión y los valores bajos de la energía de excitación. La caída por debajo de esta relación lineal indica que se ha producido saturación. El siguiente paso consiste en realizar espectroscopía en una única nanoesfera de oro.Este esquema proporciona una visión general del montaje. Utilice una fuente láser de continuo superpuesto con un rango de longitud de onda de 450-1750 nanómetros. Además, utilice un divisor de haz de banda ancha 50/50 para asegurar la cobertura espectral en todo el espectro visible.Coloque un espejo giratorio delante del tubo foto multiplicador para dirigir la luz hacia el espectrómetro, que está equipado con un dispositivo de carga acoplada. El láser de continuo superpuesto debe alinearse utilizando el mismo procedimiento que el láser de 532 nanómetros.En la salida del láser de supercontinuo, tome algunas precauciones para eliminar el exceso de potencia infrarroja del sistema. Coloque espejos reflectantes de luz visible en la trayectoria óptica justo después de la salida del láser, antes de enviar el haz al microscopio. En conjunto con los espejos, utilice absorbentes de haz para recoger la radiación infrarroja que podría dañar el sistema.Con el láser alineado, adquiera e image las nanosferas de oro. Observe la imagen e identifique una sola nanosfera para su estudio. Fije el enfoque de la luz amplia incidente sobre la nanosfera elegida.A continuación, asegúrese de que el espectrómetro esté en la trayectoria óptica. En esta posición, el espejo basculante dirige la luz incidente al tubo fotomultiplicador. Reoriente el espejo para dirigir la luz incidente hacia el espectrómetro.Proceda a recopilar datos sobre el espectro de dispersión de la única nanopartícula de oro. Como en este ejemplo, el espectro medido será una mezcla de dispersión de la nanosfera y fondo debido a reflexiones. Después de tomar el espectro, regrese el espejo basculante.Gírelo para dirigir la luz hacia el tubo fotomultiplicador. Tome otra imagen para confirmar que la nanopartícula de oro no ha cambiado de posición. A continuación, desplace el enfoque de la luz de banda ancha hacia un punto donde no haya partículas.Cambie nuevamente el espejo para dirigir la luz al espectrómetro y proceda a realizar otra medición espectral. El nuevo espectro corresponde al fondo. Se restará del espectro de la nanosfera de oro.Aquí se muestra el espectro de dispersión hacia atrás claro obtenido al restar el espectro de fondo del espectro con las nanoesferas de oro. La microscopía de excitación saturada de la muestra requiere un montaje diferente. Este es el esquema del microscopio de excitación saturada.La fuente láser es un láser de 532 nanómetros. Utilice un divisor de haz 50/50 para crear dos haces a partir de la fuente láser. Pase cada haz a través de un modulador acusto-óptico separado.Las diferentes frecuencias moduladoras generan una frecuencia de batido que servirá como frecuencia de modulación de las señales de excitación saturadas. Combine los haces difractados de primer orden procedentes de los moduladores acustoópticos mediante otro divisor de haz 50/50. Para monitorear la modulación temporal, utilice una lámina de vidrio para desviar una pequeña porción de la luz láser hacia un fotodetector.Para verificar el sistema, conecte el detector de fotos a un osciloscopio. Asegúrese de que no haya ninguna muestra colocada. Evalúe la señal del detector de fotos en el osciloscopio.La señal debe ser un senoide en la frecuencia de batido si la modulación y el solapamiento del haz son correctos. Para este experimento, la frecuencia de batido esperada es de 10 kilohercios. Esfuerce por obtener un senoide lo más perfecto posible con una no linealidad mínima.El siguiente paso consiste en incorporar un amplificador de detección síncrona al sistema. Para la microscopía de excitación saturada, el amplificador de detección síncrona recibe una entrada desde el detector fotoeléctrico y el tubo fotomultiplicador. Desconecte la salida del detector fotoeléctrico del osciloscopio y conéctela a la entrada de referencia del amplificador.Conecte la salida del tubo fotomultiplicador al amplificador de detección síncrona como entrada de señal. Envíe la salida del amplificador a una tarjeta de adquisición de datos. En este momento, monte la muestra sobre la platina del microscopio.Utilice la misma muestra con nanoesferas de oro de 80 nanómetros en aceite selladas entre dos placas de vidrio. Regrese al amplificador de bloqueo mientras realiza las mediciones. Configure el amplificador para exportar la magnitud absoluta de la señal de voltaje.En este caso, seleccionando R en el panel de visualización del canal 1. Cambie el ajuste del componente armónico en el canal de referencia para obtener las amplitudes máximas de excitación. Estas imágenes en color se forman utilizando un software personalizado para sincronizar y combinar las señales del amplificador de bloqueo y los voltajes de accionamiento de los motores galvanométricos.La imagen del microscopio electrónico de barrido es para comparación. Las imágenes demuestran el aumento de resolución con diferentes componentes armónicos. El espectro medido de una nanosfera de oro de 80 nanómetros está en rojo.La curva sólida calculada utilizando la teoría de Mie muestra una excelente concordancia. La resonancia de plasmón superficial localizada se encuentra a 580 nanómetros. Las imágenes de dispersión, arriba, y los perfiles lineales, abajo, presentan características diferentes en función de la intensidad de excitación.En intensidades bajas, la función de dispersión puntual tiene un perfil gaussiano estándar. Intensidades más altas provocan un aplanamiento y ensanchamiento de la función, lo que indica saturación. En valores más elevados, la intensidad central no es la máxima, dando lugar a una función de dispersión puntual con forma de dona.Finalmente, la intensidad central vuelve a ser el pico durante la saturación inversa. Los puntos de datos azules en esta gráfica de la intensidad central a diferentes intensidades de excitación revelan tanto el comportamiento de saturación como el de saturación inversa. Los puntos de datos se ajustan a un polinomio de quinto orden representado en rojo.Estos datos pueden utilizarse para extraer los componentes de frecuencia armónica. Los componentes armónicos también pueden encontrarse directamente utilizando el amplificador de detección. Este gráfico izquierdo corresponde a datos experimentales.El gráfico de la derecha es el resultado del cálculo utilizando el ajuste polinómico de quinto orden. Ambos gráficos presentan depresiones a intensidades específicas a lo largo de las curvas. Por ejemplo, tres depresiones en el segundo armónico.Además, en cada gráfico, para cada orden armónica, la pendiente aumenta después del primer mínimo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de tres horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante verificar la calidad de la modulación sinusoidal, la linealidad del sistema de detección y la estabilidad mecánica de la muestra.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo lograr la mejora de la resolución basada en la dispersión no lineal de nanoestructuras plasmónicas. Esta técnica ofrece una muestra prometedora para que los investigadores en el campo de la microscopía de superresolución exploren nuevos contrastes en otras interacciones fundamentales entre la luz y la materia.

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Research

Investigación

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