Name: Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprende a evaluar la migración de células de cáncer de pulmón bajo campos eléctricos utilizando un dispositivo microfluídico multicanal. Este método revela cómo los inhibidores de cinasa afectan la electrotaxis tumoral.

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Este trabajo cuenta con el apoyo financiero del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (Contrato no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) y el Programa de Investigación en Nanociencia y Nanotecnología, Academia Sinica, Taiwán.

1. Diseño y Fabricación de la viruta de MDF <ol><li> Dibuja un patrón de capa acrílica individual utilizando software comercial, tales como AutoCAD, y guardar el patrón. <ol><li> Revisar el diseño del patrón de lámina acrílica de cuatro capas en la Figura 1A y confirmar las conexiones entre capas. </li></ol></li><li> Fabrique todas las hojas de acrílico y la cinta de doble cara mediante ablación láser usando un láser scriber CO 2 (Figuras 1B, 2A y 2B). 16 <ol><li> Encienda el Scriber láser y conectar el equipo a la computadora portátil de control. </li><li> Ejecute el software comercial y abrir el patrón diseñado en el paso 1.1, haga clic en &quot;archivo de patrones diseñados.&quot; </li><li> Coloque un pedazo de hoja de acrílico blanco o cinta de doble cara en el escenario XYZ del scriber láser. </li><li> Establecer el foco del haz de láser en la superficie de la lámina de acrílico o cinta de doble cara con un auto-alignment stick proporcionado por el fabricante de la punta de trazar láser. </li><li> Enviar el patrón diseñado para la punta de trazar de láser para el mecanizado directo de la lámina de acrílico o cinta de doble cara. </li></ol></li><li> Retire el papel protector de las hojas de acrílico utilizando pinzas y soplar la superficie limpia con gas nitrógeno. </li><li> Pila de las hojas de acrílico y unir juntos bajo una presión de 2 kg / cm 2 en un dispositivo de unión térmica durante 45 minutos a 110 ° C para formar el / conjunto de canal estimulación eléctrica de flujo. </li><li> Preparar la cubierta de vidrio de microscopio como el sustrato de cultivo celular en el chip. <ol><li> Ponga la cubierta de vidrio a una cubeta y llenar el frasco con una dilución de diez veces del detergente que figuran en la lista de materiales. </li><li> Ponga la cubierta de vidrio y jarra de tinción en una Steri-limpiador ultrasónico y limpiar la cubierta de vidrio durante 15 minutos. </li><li> Vierta el detergente diluido fuera del tarro tinción, vuelva a llenar el recipiente con agua destilada y repetir el paso 1.5.2 3 veces. </li><li> Se seca la cubierta de vidrio limpiado mediante soplado con gas nitrógeno antes de adherir a la cinta de doble cara. </li></ol></li><li> Pegue la cubierta de vidrio limpiado a la / conjunto de canal estimulación eléctrica de flujo con la cinta de doble cara con dibujos en el paso 1.2. </li><li> Adherirse 13 piezas de adaptadores de acrílico a las aberturas individuales en la capa 1 del conjunto de chips MDF con pegamento. El conjunto de chips MDF es entonces completa (Figura 2D). </li><li> Esterilizar el conjunto completo de chip MDF con 30 min de irradiación UV antes de su uso. </li></ol> 2. Configuración de la Red Puente La sal de la viruta de MDF <ol><li> Antes de su uso, esterilizar todos los tubos de plástico, las tuercas con los dedos, y tubos de microcentrífuga que se muestran en la Figura 3B mediante el establecimiento de un tiempo de retención de 15 min a 121 ° C en el autoclave. </li><li> Conecte los tubos fluoroplástico (Figura 3B-i) a la asamblea chip de MDF a través de la entrada del medioy los adaptadores de salida muestran en la Figura 1A. </li><li> Conecte el cono Luer de la entrada del medio y la salida de los tubos de plástico en la figura 3B-i a las llaves de paso de 3 vías. </li><li> Tomar 2,5 ml de CO 2 salina tamponada con fosfato -equilibrated (PBS) usando una jeringa de 3 ml y conectar la jeringa a la llave de paso de 3 vías del tubo de plástico de entrada. Conectar una jeringa vacía de 3 ml a la llave de paso de 3 vías del tubo de plástico de salida. Las dos jeringas son así interconectados a través del chip MDF. NOTA: Incubar la PBS en el 37 ° C 5% -CO 2 incubadora de células de cultivo O / N para obtener CO 2 -equilibrated PBS. </li><li> Selle las aberturas del azul y los adaptadores verdes (Figura 1A) en la hoja de PMMA Capa 1 con las tuercas con los dedos sólidos blancos (Figura 3B-iii). </li><li> Llene los canales del puente de sal y cámaras de cultivo con el CO 2 -equilibrated PBS en la jeringa se describe en el paso de instalación 2.4. Evitarla formación de burbujas. </li><li> A continuación, poner el CO 2 -equilibrated PBS que contiene chips de MDF en el 37 ° C 5% CO 2 incubadora de cultivo celular para O / N de incubación. Esto permite que el aire disuelto en la cinta de doble cara para formar burbujas en las cámaras. </li><li> Enjuague de distancia las burbujas en los canales por un flujo rápido de PBS en el canal utilizando las dos jeringas. Bombear el PBS de ida y vuelta si es necesario. </li><li> Escurrir el PBS en los canales a través de la llave de paso de 3 vías conectada al tubo de salida medio. </li><li> Utilizando una nueva jeringa de 3 ml, tomar 2,5 ml de CO 2 -equilibrated Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (véase el paso 3.5), y reemplazar la jeringa conectada a la entrada con el nuevo. Vuelva a llenar los canales con el medio. </li><li> Preparación de la red de puente de sal. <ol><li> Eliminar temporalmente las tuercas sólidos (Figura 3B-iii) en los adaptadores verdes (Figura 1A) e inyectar 3% caliente (&gt; 70 ° C) de agarosa al bri salcanal dge a través de la abertura en la adaptadores verdes (Figura 1). NOTA: Preparación de agarosa caliente: Disolver 1,5 g de polvo de agarosa en 50 ml de PBS. Esterilizar estableciendo un tiempo de retención de 20 min a 121 ° C en el autoclave. </li><li> Detener la inyección de la agarosa cuando el líquido llena tres cuartas partes de la longitud del canal de puente salino. </li><li> Sellar los poros en los adaptadores verdes (Figura 1A) atornillando las tuercas de sólidos (Figura 3B-iii) después de la inyección de agarosa. </li><li> Vuelva a colocar las tuercas sólidos sobre los adaptadores azules (Figura 1A) con las tuercas con los dedos tubulares translúcidos (Figura 3B). </li><li> Cargue el 3% precalentado agarosa en las tuercas tubulares (Figura 3B-IV). </li><li> Insertar los electrodos de Ag / AgCl (Figura 3B-V) en las tuercas tubulares (Figura 3B-iv) antes de lasolidificación de la agarosa. </li></ol></li><li> Después de completar la configuración de la red de puente de sal, inyectar las células de cáncer de pulmón CL1-5 en las cámaras de cultivo, una de las cámaras a la vez. </li></ol> 3. Preparación de las células cancerosas y puesta en marcha para el Experimento Electrotactic <ol><li> Cultura regular de línea celular de cáncer de pulmón CL1-5. <ol><li> Cultura de las células de cáncer de pulmón, CL1-5 obtenidos del Prof. Pan-Chyr Yang, 17 en el medio completo en un frasco de cultivo celular 75T a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. El medio completo se compone de DMEM y suero bovino fetal al 10% (FBS). Sub-cultivar las células cada 3 ó 4 días. Las células utilizadas para la realización de experimentos electrotaxis están a menos de 25 pasajes de la fuente original. </li></ol></li><li> Añadir 2 ml de tampón de tripsina 0,25% a las células en crecimiento exponencial CL1-5 y se incuba durante 2 min en el 37 ° C 5% -CO 2 incubadora de cultivo celular para detachmen celularest. </li><li> Terminar el proceso de desprendimiento con 6 ml de DMEM 10% de FBS y centrifugar las células a 300 g durante 5 min a TA. Entonces desechar el medio y suspender el sedimento celular con 5 ml de PBS. </li><li> Contar el número de células en el PBS. Luego tomar 1 x 10 6 células y centrifugar a 300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Deseche la PBS. Suspender las células con pre-calentado CO 2 -equilibrated DMEM y ajustar la densidad de las células a ser de 1 × 10 6 células / ml. NOTA: Incubar el medio completo en el 37 ° C 5% CO 2 cultivo celular incubadora O / N para obtener el CO 2 -equilibrated DMEM. </li></ol> 4. Configuración para las Experimento Electrotactic <ol><li> Desde la salida del chip MDF, inyectar 0,3 ml, 1 × 10 6 / ml, de las células en el chip. </li><li> Incubar el chip MDF sembrado de células en la incubadora de cultivo celular (fijado en 37 ° C y 5% de CO 2) durante 2-4 horas. </li><li> Configuración de MDF microsistema fluídico. <ol><li> Instale el sistema de microfluidos MDF en un calentador de cristal de óxido de indio y estaño transparente (ITO). Medir la temperatura del chip de MDF con un termopar de tipo K recortado entre el chip MDF y vidrio ITO. Controle el calentador de ITO con un controlador proporcional-integral-derivativo (PID). Ajuste la temperatura de incubación de microfluidos sistema de MDF de 37 ° C con el controlador PID. NOTA: La fabricación del calentador de ITO y la configuración del sistema de calentamiento de células de cultivo se describen en los informes anteriores 18,19. </li><li> Montar el conjunto de chip de MDF de temperatura controlada en la etapa motorizada XYZ controlada por ordenador en un microscopio invertido. El uso de la platina motorizada se describe en el paso 5.1. Bombear el medio completo en las cámaras de cultivo a través de las entradas con una bomba de jeringa de cuatro canales. </li></ol></li><li> Bombear el medio completo en el chip MDF con un caudal de 20 l / hr. Los residuos cultura del cabolets se recoge en los tubos de microcentrífuga (que se muestran como &quot;residuos&quot; en la figura 3A). </li><li> Se incuban las células para otro 16-18 horas a 37 ° C en el chip de MDF. </li><li> Para reemplazar el medio, bombear el medio que contiene 50, 25, 5 y 0 inhibidor de quinasa mu M, respectivamente, en cada cámara de cultivo a una velocidad de flujo de 20 l / min durante 10 min. NOTA: Preparar una solución madre 10 mM del inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho Y27632 mediante la adición de 3 ml de agua estéril para el inhibidor de 10,6 mg quinasa. Diluir la solución madre 10 mM a 50, 25, y 5 mM, respectivamente, utilizando 10% de medio FBS DMEM. </li><li> Se incuban las células en el inhibidor de la quinasa durante otros 60 min a 37 ° C. Ajuste el caudal medio de 20 l / h. Utilice la misma temperatura cultura y la tasa se ha descrito anteriormente en los pasos posteriores fluir. </li><li> Utilice cables eléctricos para conectar una fuente de alimentación DC para el chip MDF a través de los electrodos de Ag / AgCl en el chip. </li><li> Conectar en serie un i amperímetron el circuito eléctrico. Utilice el amperímetro para vigilar la corriente eléctrica en el chip de MDF. </li><li> Encienda la fuente de alimentación de CC y ajuste el amperímetro actual a 86.94 mu mediante el ajuste de la tensión de alimentación de entre 15 y 19 V. NOTA: Teniendo en cuenta la ley de Ohm, E = I / (s A eff), donde I es la corriente eléctrica que fluye a través del material a granel, es decir, el medio de cultivo en la cámara de electrotactic, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) es el conductividad del medio de cultivo, A eff (= 0,21 mm 2 para una anchura de 3 mm x 0,07 mm de altura) es el área de sección transversal efectiva de la cámara de electrotactic, y la corriente eléctrica (I) necesaria para generar un 300 mV / mm EF en el chip de MDF es 86,94 mu. </li></ol> 5. Adquisición y Análisis de Imágenes celulares <ol><li> Controlar la platina motorizada mediante un programa MATLAB GUI. Con el sistema de microfluidos MDF montado en el microscope, mueva el chip a las regiones de observación mediante la platina motorizada. </li><li> Imágenes de células registro utilizando una cámara digital réflex de lente única (SLR) montadas en el microscopio. </li><li> Tomar imágenes microscópicas utilizando una lente objetivo 4X a intervalos de 15 min durante 2 horas. </li><li> Análisis de la migración celular. <ol><li> Ejecute NIH ImageJ 1,47 V. </li><li> Analizar la distancia desde la inicial a las posiciones finales de centroide de la célula. </li><li> Ir a &quot;Archivo&quot; → &quot;Importar&quot; → &quot;Secuencia de imágenes,&quot; e importar nueve imágenes para el análisis de la migración celular. La primera imagen es el resultado del tiempo cero, y la última imagen es el resultado de 120 min. </li><li> Ir a &quot;Analizar&quot; → &quot;Establecer Medidas&quot; y marque la casilla junto a &quot;centroide&quot; </li><li> Haga clic en el icono &quot;Freehand Selecciones&quot;. </li><li> Representar el borde de las celdas seleccionadas en la primera imagen. </li><li> Ir a &quot;Editar&quot; → </em&gt; &quot;Selección&quot; → &quot;Añadir a Manager&quot; </li><li> Ir a la novena imagen y representar el borde de las mismas células seleccionadas en la primera imagen. Las posiciones de células pueden ser rastreados utilizando el segundo a las imágenes octavo. </li><li> Ir a &quot;Editar&quot; → &quot;Selección&quot; → &quot;Añadir a Manager&quot; </li><li> Repita los pasos 5.4.5 al 5.4.9 para recopilar datos de 90 a 100 células. </li><li> Ir a &quot;Analizar&quot; → &quot;Medida&quot; para obtener el resultado de las posiciones inicial y final de las celdas seleccionadas. NOTA: La velocidad de migración se define como la longitud media de movimiento de la célula por hora. La direccionalidad se define como coseno, donde es el ángulo entre el vector de la dcEF (cátodo del ánodo al) y el vector desde el punto de partida de una célula a su posición final. La direccionalidad es -1 para las células que migran hacia el ánodo y 1 para las células que migran hacia el cátodo. Para un grupo de azar mirejilla de celdas, la direccionalidad es 0. 2 </li></ol></li></ol>

<ol><li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+movement+of+rat+prostate+cancer+cells+in+direct-current+electric+field%3A+involvement+of+voltagegated+Na%2B+channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity.</a> J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).</li>
<li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+receptor+signaling+is+essential+for+electric-field-directed+migration+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells.</a> J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).</li>
<li>Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li>
<li>Huang, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+human+lung+cancer+cell+line+CL1-5+in+response+to+a+direct+current+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field.</a> PLoS One. 6, e25928(2011).</li>
<li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+ordered+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds.</a> Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).</li>
<li>Tsai, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+EGFR+and+RTK+signaling+in+the+electrotaxis+of+lung+adenocarcinoma+cells+under+direct-current+electric+field+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation.</a> PLoS One. 8, e73418(2013).</li>
<li>Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+chemical+and+electrical+stimulation+on+lung+cancer+cells+using+a+multichannel-dual-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip.</a> Biomicrofluidics. 8, (2014).</li>
<li>Faupel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electropotential+evaluation+as+a+new+technique+for+diagnosing+breast+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions.</a> Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).</li>
<li>Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+rat+prostate+gland+in+vitro%3A+identified+single-cell+and+transepithelial+%28lumen%29+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials.</a> BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).</li>
<li>McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+dimensions+in+cell+science%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrical dimensions in cell science.</a> J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).</li>
<li>Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on-chip%3A+shear+deformation+of+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells.</a> Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).</li>
<li>Lin, F., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+chemotaxis+in+a+simple+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">T cell chemotaxis in a simple microfluidic device.</a> Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).</li>
<li>Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+studying+cell+migration+in+single+or+co-existing+chemical+gradients+and+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields.</a> Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).</li>
<li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).</li>
<li>Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+laser+micromachining+and+universal+surface+modification+of+PMMA+for+device+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).</li>
<li>Chu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+invasive+and+metastatic+subpopulations+from+a+human+lung+adenocarcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).</li>
<li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+cell-culture+microchamber+with+a+variably+controlled+concentration+gradient+generator+and+flow+field+rectifier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier.</a> Biomicrofluidics. 2, 24105(2008).</li>
<li>Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITO+patterning+by+a+low+power+Q-switched+green+laser+and+its+use+in+the+fabrication+of+a+transparent+flow+meter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316(2007).</li>
<li>Pu, J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+polarization+in+a+strong+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Golgi polarization in a strong electric field.</a> J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+directly+induces+pre-angiogenic+responses+in+vascular+endothelial+cells+by+signaling+through+VEGF+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors.</a> J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Nos pareció que el proceso de adherirse adaptadores de acrílico en la capa 1 del chip MDF a ser complicado. La aplicación de sólo 1 a 2 l de pegamento es suficiente para adherirse firmemente el adaptador en el chip de MDF. Grandes cantidades de cola como resultado una polimerización incompleta del pegamento y la falta de adhesión. Una vez que los adaptadores de acrílico estaban firmemente adherido sobre el chip MDF, fuga de líquido en el sistema de microfluidos rara vez se produjo. Además, O / N de incubación dentro de ...

El comportamiento de las células adherentes que se mueven hacia un ánodo o cátodo bajo una corriente de campo eléctrico directo (dcEF) se conoce como electrotaxis. El comportamiento electrotactic de las células juega un papel importante en la embriogénesis, la regeneración del nervio, y la curación de la herida. 1 Las células tumorales tales como células de cáncer de próstata de rata, células de cáncer de mama 2, 3 y pulmonares células de adenocarcinoma 4-8 han demostrado movimiento electrotactic bajo una dcEF aplicado . El EF fisiológica se ha medido en tejidos de la glándula. 9,10 electrotaxis También se ha informado en las células tumor de la glándula asociada a 2,3. Tomados en conjunto, los electrotaxis de células de cáncer se considera que es un factor de metástasis. 11 El control de la orientación eléctrica de las células cancerosas en virtud de dcEF puede ser un enfoque potencial para el tratamiento futuro de cáncer. Sin embargo, hoy en día, el mecanismo molecular detallado de electrotaxis sigue siendo controvertido. Por lo tanto, una investigación de la influence de la estimulación eléctrica sobre la migración de células de cáncer puede facilitar el desarrollo de estrategias para el tratamiento del cáncer. Recientemente, los dispositivos bio-microfluidos se han fabricado para el estudio de las respuestas celulares a fluir la fuerza de corte, 12 gradientes químicos, 13 y eléctrica estímulos 4 in vitro. La fabricación de dispositivos de microfluidos utilizando bio-polidimetilsiloxano (PDMS) o polimetilmetacrilato (PMMA, también conocido como acrílico) ha reducido con éxito la tasa de fracaso de tales experimentos. Por otra parte, el uso de dispositivos de microfluidos de base acrílica como un prototipo para la investigación de temas biológicos es más simple que el uso de chips de PDMS. Varias funciones en los dispositivos de base acrílica se han desarrollado para electrotaxis estudio. Sin embargo, ninguno de los diseños anteriores son capaces de probar simultáneamente los efectos de varias condiciones químicas y el campo eléctrico en las células para electrotaxis estudio. Por lo tanto, hemos desarrollado un dispositivo de microfluidos-multichannel doble de campo eléctrico (MDF) cuatro canales de cultivo independientes y ocho condiciones experimentales diferentes en un chip que contiene chips. El chip de MDF de base acrílica, primero reportada por Hou et al., 8 integra la estimulación eléctrica y varios canales aislados químicamente. Estos canales aislados químicamente se pueden utilizar para la cultura diferentes tipos de células en un experimento. El dcEF en los canales es producida por una fuente de alimentación eléctrica. Dos campos eléctricos independientes, uno con la fuerza aplicada de campo eléctrico (EFS) y otro con 0 EFS, se llevan a cabo en cada canal aislado químicamente. De esta manera, el chip proporciona EF coexistente mejor controlado y la estimulación química. Además, los resultados de la simulación numérica de la difusión química dentro del chip MDF indican que no se produjo la contaminación cruzada entre los canales después de un periodo experimental de 24 hr. 8 En comparación con el Device reportado por Li et al., 14 el chip MDF proporciona un área de cultivo a mayor, lo que permite para su posterior análisis bioquímico de las células estimuladas eléctricamente. Además, con área de observación más grande del chip MDF, más células pueden ser observados en la prueba, por lo que el análisis de la velocidad de migración o direccionalidad de las células estimuladas eléctricamente es más preciso. Los diseños de chips de un solo canal de estudios previos reportados por Huang et al. 4 y Tsai et al. 15 sólo permiten un tipo de célula o químico a ensayar. Sin embargo, el chip MDF puede utilizarse para investigar los efectos de diversos productos químicos en electrotaxis, así como los efectos de la estimulación eléctrica en diferentes tipos de células. En otras palabras, el chip MDF permite el estudio de dosis eficaz de dependencias químicas.

<table><tbody><tr><td><reactivo fuerte> reactivo </medio</td> DMEM ><td></td><td></td><td></td>fuerte</tr> <tr><td></td><td>Gibco, Invitrogen, EE. UU.</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco, Invitrogen, EE. UU</td>. <td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco, Invitrogen, EE. UU.</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Vida básica</td><td>BL2651</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (clorhidrato)</td><td>Cayman Chemical Co</td><td>10005583</td><td></td></tr><tr><td>agarosa</td><td>LONZO, EE. UU.</td><td>Jeringa SeaKem LE AGAROSE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Terumo</td><td>3 ml con cono</td><td></td>Luer</tr><tr><td>llave de paso de 3 vías</td><td>Nipro</td><td>con cono</td><td></td>Luer</tr><tr><td>PMMA (acrílico)</td><td>HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwán</td><td></td><td>espesor 1 mm,</td></tr><tr><td>adaptador acrílico</td> de 2 mm <td>KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwán</td><td>1/4-28 puerto, tuerca personalizada de 10x10x6 mm</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>COLUMNA:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio para microscopio</td><td>Deckgl&auml; ser, Alemania</td> Cinta adhesiva de <td>doble cara de 24x60 mm</td><td></td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>PET 8018</td><td></td></tr><tr><td>superpegamento</td><td>3M</td><td>Scotch Liquid Plus Super Glue</td><td></td></tr><tr><td>TFD4 detergente</td><td>Franklab, Francia</td><td>Limpiador</td> estéril ultrasónico TFD4 <td></td></tr><tr><td></td><td>LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwán</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termo bonder</td><td>KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwán</td><td>trazador</td> láser de CO2 personalizado <td></td></tr><tr><td></td><td>grupo LTT, Taiwán</td><td>ISL-II</td><td></td></tr><tr><td>controlador proporcional-integral-derivado (PID)</td><td>JETEC Electronics Co., Japón</td><td>TTM-J40-R-AB,</td><td></td></tr> <tr><td>termopar tipo K</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td> Bomba de jeringa <td></td></tr><tr><td>de 4 canales</td><td>KdScientific, EE. UU</td>. Fuente de alimentación de <td>CC 250P</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GWInstek, Taiwán</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etapa del motor X-Y-Z</td><td>TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwán</td><td></td> microscopio invertido personalizado <td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus, Japón</td> Cámara SLR digital <td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Canon, Japón</td><td>60D</td><td></td></tr></tbody></table>

estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un multicanal dual-campo eléctrico chip de microfluidos

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

El comportamiento de la migración celular direccional bajo una corriente de campo eléctrico directo (dcEF) se conoce como electrotaxis. El papel importante de dcEF fisiológica en guiar el movimiento celular durante el desarrollo embrionario, la diferenciación celular, la curación de heridas y se ha demostrado en muchos estudios. Mediante la aplicación de chips de microfluidos a un ensayo electrotaxis, el proceso de investigación se acorta y los errores experimentales se reducen al mínimo. En los últimos años, los dispositivos de microfluidos hechas de sustancias poliméricas (por ejemplo, polimetilmetacrilato, PMMA, o acrílico) o polidimetilsiloxano (PDMS) han sido ampliamente utilizados en el estudio de las respuestas de las células a la estimulación eléctrica. Sin embargo, a diferencia de los numerosos pasos requeridos para fabricar un dispositivo de PDMS, la construcción simple y rápida de los micro acrílicos fl chip de uidic hace que sea adecuado tanto para la creación de prototipos dispositivo y la producción. Sin embargo, ninguno de los dispositivos reportados facilitar el estudio eficiente de la sustancia química simultánea y DCEF efectos sobre las células. En este informe, describimos nuestro diseño y fabricación de un multicanal basado en acrílico de campo eléctrico dual (MDF) de chips para investigar el efecto simultáneo de química y la estimulación eléctrica de las células del cáncer de pulmón. El chip MDF proporciona ocho combinaciones de estímulos eléctricos / químicos en una sola prueba. El chip no sólo acorta considerablemente el tiempo experimental requerido sino también aumenta la precisión en electrotaxis estudios.

Fabricación y montaje del dispositivo de MDF Un diagrama esquemático del chip MDF de base acrílica se muestra en la Figura 1A. Cuatro hojas de acrílico, una cubierta de vidrio, 13 adaptadores de acrílico, y un trozo de cinta de doble cara se utilizan en el montaje del chip MDF completado (Figura 2D). Sólo hay cuatro canales independientes de cultivo en el dispositivo de MDF. S...

Se han desarrollado muchos dispositivos microfluídicos para su uso en el estudio de la electrotaxis. Sin embargo, ninguno de estos chips permite el estudio eficiente de los efectos simultáneos del campo químico y eléctrico (FE) en las células. Desarrollamos un dispositivo basado en polimetilmetacrilato que ofrece una FE coexistente mejor controlada y estimulación química para su uso en la investigación de electrotaxis.

Estudios electrotaxis de pulmón células de cáncer utilizando un Multicanal Dual-campo eléctrico chip de microfluidos

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

El objetivo general de este experimento de microfluídica es evaluar los efectos de los inhibidores de quinasas sobre la migración de células tumorales bajo un campo eléctrico directo. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en los estudios de electrorepiración celular, como cuáles son las vías determinantes en la migración guiada por campo eléctrico de las células cancerosas. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un estudio de electrorepiración altamente reproducible y ahorrador de tiempo que puede implementarse fácilmente.La implicación de esta técnica se extiende hacia el diagnóstico del potencial metastásico del cáncer. Dado que la movilidad de las células cancerosas magnéticas puede aumentarse mediante un campo electrostático, este método puede proporcionar una prueba electrofisiológica intracelular de las células tumorales.También puede aplicarse al proceso de regeneración de la piel, como la cicatrización de heridas. Comience utilizando un programa de dibujo y diseño para trazar el patrón individual de la capa acrílica. Guarde el patrón y luego encienda el grabador láser.Conecte el grabador al portátil de control y haga clic en el archivo del patrón diseñado para abrir el patrón de la capa de acrílico. A continuación, coloque un trozo de lámina de acrílico virgen sobre la plataforma X, Y, Z del grabador láser y utilice la varilla de alineación automática adecuada correspondiente al grabador láser. Para ajustar el enfoque del haz láser sobre la superficie de la lámina.Envíe el patrón diseñado al grabador láser para el mecanizado directo de la lámina de acrílico. Luego, use pinzas para retirar el papel protector de las láminas de acrílico y limpie las superficies con gas nitrógeno. Ahora apile las láminas y únalas mediante unión térmica bajo una presión de dos kilogramos por centímetro cuadrado en un aparato de termosoldadura durante 45 minutos a 110 grados Celsius para formar el ensamblaje del canal de estimulación eléctrica de flujo.Después de preparar la cinta de doble cara de la misma manera, pegue el cubreobjetos limpio al ensamblaje del canal de estimulación eléctrica de flujo. Luego use pegamento instantáneo para adherir 13 piezas de adaptadores de acrílico a las aberturas individuales en la capa uno del ensamblaje del chip MDF, o chip de doble campo eléctrico multicanal, con el fin de configurar la red de puente salino del chip MDF. Comience conectando tubos plásticos rígidos a la ensambladura del chip MDF a través de los adaptadores de entrada y salida medianos.A continuación, conecte la punta cónica de los tubos plásticos de entrada y salida del medio a una llave de paso de tres vías. Conecte una jeringa de tres mililitros que contenga 2,5 mililitros de PBS equilibrado con dióxido de carbono a la llave de paso de tres vías del tubo plástico de entrada, y una jeringa vacía de tres mililitros a la llave de paso de tres vías del tubo plástico de salida. Utilice tuercas blancas sólidas de apriete manual para sellar las aberturas de los adaptadores azul y verde en la lámina acrílica de la capa uno. Luego, llene los canales del puente salino y las cámaras de cultivo con PBS equilibrado con dióxido de carbono, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas.Transfiera el chip a un incubador de cultivo celular con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante la noche para permitir que el aire disuelto en la cinta de doble cara forme burbujas dentro de las cámaras a la mañana siguiente. Utilice las dos jeringas para generar un flujo rápido de PBS y eliminar las burbujas, bombeando el PBS hacia adelante y hacia atrás según sea necesario. Cuando se hayan eliminado todas las burbujas, use la llave de paso de tres vías conectada al tubo de salida del medio para drenar el PBS de los canales.Luego, reemplace la jeringa conectada a la entrada con una jeringa de tres mililitros que contenga 2,5 mililitros de DM EM saturado con dióxido de carbono y rellene las cámaras con el medio cuando estén llenas. Retire las tuercas sólidas de los conectores verdes e inyecte 3 % de Aros calentado a al menos 70 grados Celsius en el canal del puente salino. A través de las aberturas en los conectores, prepare el puente salino caliente para la inyección, asegurando el bloqueo de la fila media entre las cámaras culturales.Deje de inyectar los agros cuando el compuesto llene tres cuartas partes de la longitud del canal del puente salino y vuelva a sellar los poros con las tuercas sólidas. Ahora reemplace las tuercas sólidas en los adaptadores azules por tuercas tubulares translúcidas de apriete manual y cargue aros en las tuercas tubulares. Luego inserte electrodos de plata y cloruro de plata en las tuercas tubulares antes de que el aro se solidifique.Para configurar un experimento electro tactic, inyecte 0,3 mililitros de células en el chip MDF a través del tubo de salida y devuelva el chip al incubador de cultivo celular. Después de dos a cuatro horas, instale el sistema microfluídico MDF sobre un calentador de vidrio transparente de óxido de indio y estaño y coloque un termopar tipo K entre el chip MDF y el vidrio de óxido de indio y estaño. Para medir la temperatura del chip, utilice un controlador proporcional integral derivativo para ajustar la temperatura de incubación del sistema microfluídico MDF a 37 grados Celsius y monte el conjunto del chip MDF con control de temperatura sobre la platina motorizada controlada por computadora XYZ de un microscopio invertido.Luego, utilizando una bomba de jeringas de cuatro canales, distribuya el medio completo en las cámaras de cultivo a través de las entradas a un flujo de 20 microlitros por hora. Recolecte los desechos del cultivo de las salidas en tubos microcentrífugos. Incube las células a 37 grados Celsius durante otras 16 a 18 horas.Al día siguiente, reemplace el medio en cada cámara con medio fresco suplementado con la concentración adecuada de inhibidor de quinasas durante 60 minutos de tratamiento. Luego conecte una fuente de alimentación de corriente continua al chip MDF a través de los electrodos de plata, cloruro de plata y en serie. Conecte un amperímetro al circuito eléctrico para monitorear la corriente eléctrica en el chip MDF.Finalmente, encienda la fuente de alimentación y ajuste el voltaje entre 15 y 19 voltios. Para establecer la corriente del amperímetro en 86,94 microamperios. En este experimento representativo con el sistema microfluídico MDF, células de cáncer de pulmón tratadas con diversas concentraciones del inhibidor de quinasas.Y 2 7 6 3 2 no exhibió cambios en la velocidad de migración celular con o sin estimulación eléctrica. Sin embargo, el tratamiento con Y 2 7 6 3 2 bajo la aplicación de un campo eléctrico redujo significativamente el carácter direccional de la migración de las células cancerosas. De hecho, a una concentración de 50 micromolar, el inhibidor de ROCK eliminó por completo el movimiento direccional de las células sin afectar su velocidad de migración.Además, hubo una correlación dependiente de la dosis entre las concentraciones químicas aplicadas y el índice de direccionalidad, lo que confirma la fiabilidad y eficiencia del sistema microfluídico MDF como método para estudiar axxis. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en siete u ocho horas si se realiza adecuadamente tras su desarrollo. Esta técnica libera a los investigadores en el campo de electro Texas para explorar nuevos enfoques en la piel.No olvide que trabajar con un raspador láser puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.

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Investigación

JoVE Journal

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