Name: Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda a injertar cuentas en extremidades de embrión de pollo para estudiar factores de crecimiento y vías de señalización. Este método permite analizar la expresión génica in vivo en biología del desarrollo.

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Este trabajo fue financiado en parte por un premio de la Universidad de Nottingham a DS. La RM está financiada por el Comité Superior para el Desarrollo de la Educación de Iraq.

Declaración de Ética: Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y las directrices éticas de la Universidad de Nottingham. 1. Preparación de perlas de heparina para Injerto <ol><li> Lávese las perlas de heparina a fondo en PBS antes de su uso. Nota: los granos se pueden almacenar a 4 ° C como una suspensión en PBS. <ol><li> Seleccione los granos para el injerto por sacarlos de la población con una pipeta de 20 l en una gota 1 ml de PBS. A continuación, utilice una micropipeta establece en 2 l para transferir perlas en una gota 20 l de PBS en una placa de Petri 3 cm. Elija cuentas basadas en el tamaño y, usando un estéreo microscopio de disección, la transferencia de granos seleccionados con una punta de pipeta P2; los cerca de 100 m de diámetro son ideales. </li></ol></li><li> Retire la PBS de las perlas. Retire la mayor parte del líquido con una pipeta de 20 l y el líquido residual por capilaridad con relojeros pinzas finas. Nota: Es importante eliminar tanto como sea posible por lo que el crecimiento de factor no se diluye cuando se añade a las perlas. </li><li> Pipetear el factor de crecimiento directamente sobre las perlas. Para FGF18 añadir 0,5 l de FGF18 recombinante reconstituido a 0,5 mg / ml en 0,1% de BSA en PBS. Coloque varias gotas de agua alrededor de los bordes del plato para evitar que el líquido se evapore. </li><li> Se incuban las perlas durante 1 hora a RT. Retire las gotas de agua del plato con una pipeta Pasteur y colocar en hielo listo para el injerto. </li><li> Si se requiere la transferencia (por bolas transparentes) 4-5 perlas al 2% de fenol rojo antes de injertar para ayudar a visualizar ellos. Enjuague en PBS antes de transferir al embrión. </li></ol> 2. Preparación de Cuentas AG 1-X2 para Injerto <ol><li> Antes de su uso derivatizar perlas con 0,2 N de ácido fórmico. <ol><li> Para ello use una espátula para transferir cuentas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 ml de 0,2 N de ácido fórmico y lavado en una plataforma de agitación durante 1 hora. </li><li> A continuación, retire el ácido fórmico con una pipeta p1000 y reemplazar con 1ml de agua. Lave durante 1 hora y repetir seis veces para eliminar el resto de ácido fórmico. </li><li> Retire el líquido residual con una pipeta p1000 y almacenar los granos a 4 ° C. Nota: No es necesario eliminar toda el agua residual en esta etapa. </li></ol></li><li> Retirar una pequeña pellet de perlas de aproximadamente 5-10 l de volumen de las existencias utilizando una pequeña espátula en una placa Petri 3 cm y añadir 1 ml de DMSO (o cualquier disolvente el fármaco se disuelve en). Nota: Esto debería proporcionar varios cientos de cuentas de las que permite seleccionar las del tamaño adecuado. </li><li> A continuación, utilice una pipeta P2 se establece en 2 l de transferir cuentas de aproximadamente 100 m de diámetro a una caída de 20 l de disolvente en otra placa de Petri 3 cm. </li><li> Eliminar el disolvente con una pipeta de 20 l y cualquier disolvente residual con una pipeta de 2 l. Reemplazar con 20 l de la droga que se aplicarán. NOTA: Para obtener la consistencia disolver el fármaco a una concentración de 100 mM en DMSO (o que se utiliza cada vez disolvente),alícuota en 20 l y se almacena a -80 ° C, ya que algunos inhibidores de moléculas pequeñas son inestables y es mejor evitar repetida congelación-descongelación. Si es necesario después diluir la droga a la concentración deseada antes de remojo los granos. Las concentraciones eficaces pueden necesitar ser determinado empíricamente para cada fármaco. </li><li> Incubar durante 1 hora. Proteger de la luz ya que muchas de estas moléculas son sensibles a la luz. </li><li> Antes de injerto de transferencia 4-5 perlas con una pipeta p2 establece en 2 l en 20 l de 2% de fenol rojo disueltos en agua. Realice este paso usando un microscopio de disección estéreo para visualizar las cuentas. Eliminar un solo grano con relojeros pinzas finas o un asa de alambre y enjuague en PBS antes de ser transferido al embrión. No deje perlas en un 2% de rojo fenol durante más de 15 minutos antes de su uso ya que esto puede causar la pérdida de la actividad. </li></ol> 3. Preparación de tungsteno Agujas <ol><li> Cortar alambre de tungsteno fino en 3-4 cm de longitud. Inserte un trozo de alambre en el extremo deuna pipeta Pasteur de vidrio y se funden en un mechero Bunsen para fijar en su posición. Prepara hasta 10 agujas para asegurarse de que hay piezas de repuesto si están dañados durante el uso. </li><li> Coloque el extremo del cable en una llama de soplete y mantenerlo allí hasta que el tungsteno se ilumina en blanco y la punta es aguda (unos 2-3 minutos). Nota: Durante el uso de la aguja se puede limpiar y volver a afilarse en el soplete, según sea necesario. NOTA: Estas agujas también pueden ser utilizados para hacer bucles para la transferencia de perlas. Toque suavemente la aguja para el banco y que se dobla para formar un bucle. </li></ol> 4. Los embriones Preparación de los injertos del grano <ol><li> Incubar huevos con el extremo romo hacia arriba hasta que alcanzan la etapa deseada (3-5 días para la mayoría de las manipulaciones extremidad Bud). Con unas pinzas contundente golpe en el extremo romo de romper la cáscara y luego usar las pinzas para quitar la cáscara y exponer el embrión. Asegúrese de que la membrana de la cáscara de huevo también se elimina. NOTA: 1-2 ml de PBS se puede agregar con una pipeta Pasteur para ayudar conesto si la membrana se adhiere a la yema. Pipeta suavemente la PBS sobre la superficie de la yema, sujete la membrana con las pinzas, teniendo cuidado de no dañar la yema, y ​​tire de él lejos del huevo. </li><li> Remover hasta 5 ml de albumen del huevo con una jeringa de 10 ml y una aguja de 19 G. Tome sólo tanto como sea necesario para asegurar que el embrión no tiene contacto con la cinta utilizada para sellar el huevo como la eliminación de grandes cantidades puede reducir las tasas de supervivencia de embriones. </li><li> Para visualizar el embrión añadir unas 5-6 gotas de artistas tinta china 15 ml de PBS que contenía 100 U de penicilina y estreptomicina 0,1 mg / ml. Inyectar 0,5 a 1 ml directamente bajo el embrión con una jeringa de 1 ml y una aguja de 25 G. </li><li> Añadir 2-3 ml de PBS con 1% de suero de ternera fetal y 100 U de penicilina y estreptomicina 0,1 mg / ml en el huevo para asegurar el embrión no deshidratar. Usando afiladas pinzas de relojero quitar la membrana vitelina y abrir el amnios en los esbozos de los miembros en desarrollo. Asegúrese de que el embrión no se seque y, Si es necesario, agregue más PBS / FCS. NOTA: Las yemas de las extremidades se pueden ver claramente como excrecencias emparejados en el flanco del embrión. En estas etapas el embrión se convertirá el lado este derecho es normalmente más alta. Como resultado normalmente es más fácil para injertar cuentas en las extremidades derechas y utilizar las que quedan como controles contralaterales. </li><li> Use un alambre de tungsteno afilado hacer una incisión en la yema de la extremidad en la que se implanta la perla. Evite cortar todo el camino a través de la yema de la extremidad cuando sea posible, aunque en etapas más jóvenes esto es difícil. NOTA: En los embriones de más edad (estadio HH 22 y más) es posible seleccionar regiones específicas de la yema de la extremidad para injertar, pero en etapas más jóvenes esto es más difícil, ya que la extremidad del brote en sí es pequeña. También es importante recordar que el primordio de la extremidad crecerá más allá del talón injertado así, especialmente en las etapas más jóvenes, el cordón se mantendrá en la extremidad proximal. </li><li> Recoge un grano, ya sea del factor de crecimiento o de drogas utilizando wa extra finotchmakers fórceps o un lazo hecho de una aguja de tungsteno. Si el cordón se ha empapado en DMSO o rojo de fenol, enjuague en PBS antes de aplicar para el embrión. Transferir el talón al embrión con el fórceps / asa de alambre. A continuación, utilice el alambre de tungsteno afilada para insertar el cordón en la incisión. </li><li> Añadir 1-2 ml de PBS / FCS al huevo asegurar que el embrión se mantiene hidratado pero evite aplicar directamente sobre el propio embrión ya que esto puede dañar los embriones y causar el talón sea desalojado. Sellar el huevo con cinta y volver a la incubadora. </li></ol>

<ol><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
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<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest%3A+a+long+and+still+ongoing+story%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li>
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<li>Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+application+of+retinoic+acid+to+the+limb+bond+mimics+the+action+of+the+polarizing+region%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region.</a> Nature. 296, 564-566 (1982).</li>
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<li>Anakwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+regulates+myogenic+differentiation+in+the+developing+avian+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing.</a> Development. 130, 3503-3514 (2003).</li>
<li>Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+timing+differentiation+during+limb+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The importance of timing differentiation during limb muscle development.</a> Current Biology. 8, 642-652 (1998).</li>
<li>Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scatter+factor%2Fhepatocyte+growth+factor+%28SF%2FHGF%29+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li>
<li>Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+FGF18+and+retinoic+acid+regulate+differentiation+of+chick+embryo+limb+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts.</a> Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).</li>
<li>Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klhl31+is+associated+with+skeletal+myogenesis+and+its+expression+is+regulated+by+myogenic+signals+and+Myf-5%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5.</a> Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).</li>
<li>Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28beta%29-catenin+in+the+developing+chick+myotome+is+regulated+by+myogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals.</a> Development. 127, 4105-4113 (2000).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+and+retinoic+acid+activity+gradients+control+the+timing+of+neural+crest+cell+emigration+in+the+trunk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk.</a> Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).</li>
<li>Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li>
<li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li>
<li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li>
<li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li>
<li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63(2008).</li>
<li>Scott, B. B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li>
<li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system%3A+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de injertos de cuentas aplicados directamente al desarrollo de tejidos in ovo es una herramienta poderosa para diseccionar el papel de la señalización del factor de crecimiento durante el desarrollo dando un control sin precedentes sobre el estado de desarrollo en que se aplican y la duración de la exposición. La elección del talón para cada tipo de molécula es importante. Moléculas hidrofóbicas pequeños, tales como los inhibidores aquí descritos y el ácido retinoico, por lo general s...

Embriones de aves han proporcionado una poderosa herramienta para el estudio del desarrollo durante muchos años 1. Una de sus características más útiles es que son relativamente fáciles de manipular. Desarrollo externo hace que sea posible abrir el huevo para acceder al embrión y realizar diversas micromanipulaciones incluyendo ejemplos tales como el sistema quimera codorniz-chick clásico para estudiar el destino celular 2,3, la inyección de los retrovirus para la sobreexpresión en tejidos específicos durante el desarrollo 4,5 y la cultura explante para identificar las fuentes de señalización de desarrollo 6. Más recientemente quimeras generada entre hosts sin marcar con injertos de una línea de pollo transgénico que expresa GFP ha demostrado que la combinación de injerto clásica y la modificación genética puede proporcionar importantes conocimientos sobre el desarrollo de 7,8. La facilidad con la que el embrión aviar puede ser manipulado ha hecho que sea un modelo excelente para el estudio de las extremidadesdesarrollo 9. La aplicación de factores de crecimiento específicos para los miembros en desarrollo in vivo ha sido fundamental en los factores que alteran los patrones extremidad 10,11 y continúa proporcionando conocimientos sobre este proceso 12 identificación. Este enfoque también se ha utilizado para estudiar los factores que regulan el desarrollo muscular y ha descubierto roles para numerosas señales tales como Wnts 13, BMPs 14 y 15 HGF. Recientemente, esta técnica se ha utilizado para investigar las señales que controlan la expresión génica en myogenic la yema del miembro y ha demostrado que las interacciones entre FGF18 y el ácido retinoico puede controlar el momento de la expresión de MyoD 16. Usando una combinación de factores de crecimiento y moléculas pequeñas que se pueden cargar en perlas y luego injertados directamente en los tejidos específicos en las etapas de desarrollo definidas da la oportunidad de intervenir en casi cualquier momento y la región durante el desarrollo. Esto ha sido utilizado para investigate muchos procesos incluyendo somito patrones 17,18, especificación neural 19, la migración de la cresta neural 20 y la extensión del eje 21. Aquí se describe un método para injertar perlas empapadas en cualquiera de los factores de crecimiento o inhibidores en el desarrollo de las extremidades de pollo. Esto ha sido utilizado para determinar los efectos de estas señales en la miogénesis mediante el análisis de la expresión génica específica de músculo con hibridación in situ. Se describen injertos utilizando heparina empapada perlas, que se utilizan para factores de crecimiento, o perlas de AG 1-X2 para las pequeñas moléculas hidrófobas tales como el ácido retinoico o inhibidores de moléculas pequeñas de las vías de señalización específicas. Sin embargo otras perlas están también disponibles que se han utilizado para ofrecer tanto FGFs 22 y 23 Shh.

<table><tbody><tr><td>Perlas acrílicas de heparina</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>Las perlas acrílicas de heparina utilizadas han sido descontinuadas. Sin embargo, hay un producto de reemplazo disponible, perlas de heparina y agarosa, n.º de gato H6508. Son transparentes, por lo que es más difícil trabajar con ellos, pero se pueden teñir con rojo fenol de la misma manera que las cuentas AG 1-X2,Cuentas</td></tr> <tr><td>AG 1-X2</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Affi Gel cuentas azules</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>Estas perlas se han utilizado con una variedad de factores de crecimiento, incluidos Shh y FGF, y se pueden usar para reemplazar las perlas de heparina</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>Vuelva a suspender en PBS con 0/1% de BSA, prepare alícuotas de un solo uso de 0.5-1ul y almacene a -80 ° C. Los lotes y los proveedores pueden variar, por lo que se deben probar diferentes concentraciones para determinar una dosis efectiva.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Señalización celular</td><td>9903</td><td>Hacer hasta 20mM de stock en DMSO y almacenar en alícuotas de un solo uso a -80&deg;C. Proteger de la luz.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>Resuspender en DMSO y almacenar en alícuotas de un solo uso a -80°C. Proteger de la luz.</td></tr><tr><td>Tinta china negra</td><td>Windsor y Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td><td>Aunque existen alternativas a este producto, se debe tener cuidado ya que algunas tintas son tóxicas para los embriones</td></tr><tr><td>Alambre de tungsteno, 0,1 mm de diámetro. 99,95%</td><td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Diluido 100X en PBS/tinta y PBS/FCS</td></tr></tbody></table>

injerto de cuentas en desarrollo miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción pathways afectan la expresión génica

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

El uso de embriones de pollo es posible probar directamente los efectos de cualquiera de los factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización sobre la expresión génica y la activación de vías de transducción de señal. Esta técnica permite la entrega de moléculas de señalización en las etapas de desarrollo definidas con precisión para momentos específicos. Después de esto, los embriones pueden ser cosechadas y examinaron la expresión de genes, por ejemplo mediante hibridación in situ, o activación de las vías de transducción de señales observados con la inmunotinción. En vídeo perlas de heparina empapados en FGF18 o AG perlas 1-X2 empapados en U0126, un inhibidor de MEK, están injertados en el esbozo de la extremidad in ovo. Esto demuestra que FGF18 induce la expresión de MyoD y la fosforilación de ERK y la expresión MyoD tanto endógenas como inducida FGF18 es inhibida por U0126. Cuentas empapados en un antagonista del ácido retinoico pueden potenciar la inducción prematura MyoD por FGF18. Este enfoque puede ser nosotrosed con una amplia gama de diferentes factores de crecimiento e inhibidores y se adapta fácilmente a otros tejidos en el embrión en desarrollo.

En la etapa HH 21 MyoD no se expresa en el desarrollo de las extremidades mioblastos aunque la tinción se puede ver en la miotoma de los somitas en desarrollo (Figura 1A). La Figura 1B muestra la hibridación in situ para MyoD 6 hr después de un injerto de talón FGF18. MyoD se induce en mioblastos cercanos a la perla, mientras que no hay expresión en el miembro contralateral. Co-injerto de un grano empapado en U0126, un inhibidor específico de MEK, bloques FGF18 inducción de Myo...

Mediante el injerto de perlas empapadas en factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización en embriones en desarrollo, es posible probar directamente sus efectos in vivo. En este protocolo, las perlas se injertan en la yema de la extremidad para determinar los efectos de estas moléculas en la expresión génica y la transducción de señales.

Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo determinar los efectos de los factores de crecimiento y los inhibidores en la expresión génica de las extremidades en desarrollo del embrión de pollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como cómo las moléculas de señalización influyen en el crecimiento y la diferenciación de las células in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método para probar directamente estos factores en el embrión.Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo de las extremidades, también puede aplicarse a otros sistemas, como el tejido neural, los somitos o la gastrulación. La demostración del procedimiento estará a cargo de Rebeea Mohammed, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar, transfiera un mililitro de las cuentas desde la solución stock original a un tubo nuevo.Deje que los gránulos sedimenten, luego retire el líquido y sustitúyalo con un mililitro de PBS. Repita este paso cinco veces y almacene los gránulos lavados a cuatro grados Celsius, como una suspensión en PBS. Seleccione los gránulos para el injerto, retirándolos de la solución stock lavada utilizando una pipeta de 20 microlitros y colóquelos en un mililitro de PBS.Utilizando un estereoscopio, seleccione cuentas que tengan aproximadamente 100 micrones de diámetro. Transfiera las cuentas seleccionadas en dos microlitros de líquido a una nueva placa de Petri que contenga una gota de 20 mililitros de PBS. A continuación, elimine el PBS de las cuentas. Primero, con una pipeta de 20 microlitros, y luego, retire el líquido residual por acción capilar utilizando unas pinzas finas de relojero.Es importante eliminar la mayor cantidad posible de líquido para que el factor de crecimiento no se diluya cuando se agregue a las perlas. Pipetee el factor de crecimiento directamente sobre las perlas. Para FGF18, agregue 0.5 micro-litros de FGF18 recombinante, reconstituido a 0.5 miligramos por mililitro en PBS con 0.1 por ciento de BSA.Luego, coloque varias gotas de agua alrededor de los bordes del recipiente para evitar que el líquido se evapore. Cuando esté listo, incube las perlas durante una hora a temperatura ambiente. Tras la incubación, retire las gotas de agua del recipiente con una pipeta de Pasteur y coloque el recipiente sobre hielo.Derivar los microgránulos, primero utilizando una espátula para transferirlos a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. A continuación, añada un mililitro de ácido fórmico 0,2 N e incube los microgránulos en el ácido sobre una plataforma agitadora durante una hora. Después, deje que los microgránulos sedimenten, retire el ácido fórmico y sustitúyalo por un mililitro de agua.Lave las perlas durante una hora en la plataforma agitadora y repita el lavado seis veces para eliminar cualquier ácido fórmico residual. Tras el último lavado, retire el líquido restante y almacene las perlas a cuatro grados Celsius. Utilice una espátula para retirar una pequeña porción de perlas de aproximadamente cinco a diez microlitros de volumen del stock, y coloque las perlas en una placa de Petri de 30 mililitros.Luego, agregue un mililitro de DMSO. A continuación, utilice una pipeta P2 ajustada a dos microlitros para transferir perlas de aproximadamente 100 micrones de diámetro a una gota de 20 microlitros de disolvente en otro plato de Petri de 30 mililitros. Retire la mayor parte del disolvente con una pipeta de 20 microlitros y cualquier disolvente residual con una pipeta de dos microlitros.Luego, cubra las perlas con 20 microlitros del fármaco que se aplicará, disuelto en DMSO. Incube las perlas en la solución de fármaco durante una hora. Proteja las perlas de la luz, ya que muchas moléculas de fármacos son sensibles a la luz.Para ayudar a visualizar las perlas, transfiera cuatro a cinco perlas en dos microlitros de líquido a 20 microlitros de rojo de fenol al dos por ciento disuelto en agua. Retire una sola perla con pinzas finas de relojero y enjuague la perla en PBS. No deje las perlas en la solución de rojo de fenol por más de 15 minutos antes de enjuagarlas, ya que esto puede provocar pérdida de actividad.Corte el alambre fino de tungsteno en trozos de tres a cuatro centímetros de longitud. A continuación, inserte un trozo del alambre en el extremo de una pipeta de Pasteur de vidrio y derrítalo en un mechero Bunsen para fijarlo en su posición. Prepare hasta 10 agujas para asegurar que haya repuestos en caso de que se dañen. A continuación, coloque el extremo del alambre en la llama de un soplete y manténgalo allí hasta que el tungsteno brille en blanco y la punta quede afilada.Esto lleva aproximadamente de dos a tres minutos. Añada de cinco a seis gotas de tinta china para artistas a 15 mililitros de PBS que contenga 100 unidades de penicilina y 0,1 miligramos de estreptomicina por mililitro. Para preparar los embriones de pollo, incube los huevos con el extremo romo hacia arriba hasta que alcancen la etapa deseada para la mayoría de las manipulaciones del brote de extremidad, que generalmente es de tres a cinco días.Cuando se alcance el punto temporal deseado, utilice pinzas romas para golpear suavemente el extremo romo del huevo y romper la cáscara. Luego, use las pinzas para retirar la cáscara y exponer el embrión. Asegúrese de que también se retire la membrana celular del huevo.Para visualizar el embrión, inyecte PBS suplementado con unas gotas de tinta china para artistas, debajo del embrión con una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 21. Luego, se puede retirar la membrana vitelina que recubre el embrión con pinzas finas. A continuación, agregue de dos a tres mililitros de PBS suplementado con un por ciento de suero de ternera fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina y 0,1 miligramos por mililitro de estreptomicina, dentro del huevo para asegurar que el embrión no se deshidrate.Utilizando fórceps afilados de relojero, abra el amnios sobre los brotes de las extremidades en desarrollo. En estas etapas, el embrión generalmente girará de modo que el lado derecho quede en la posición superior. Asegúrese de que el embrión no se seque agregando más solución de PBS suplementado cuando sea necesario.El amnios que rodea al embrión puede abrirse utilizando una fina aguja de tungsteno para exponer el miembro en desarrollo. A continuación, utilice el alambre de tungsteno afilado para realizar una incisión en el brote del miembro en el lugar donde se implantará la perla. Evite cortar completamente a través del brote del miembro, en la medida de lo posible.Aunque en etapas más tempranas esto es difícil. Tome una perla recubierta con el factor de crecimiento o con el fármaco utilizando pinzas finas de relojero. Si la perla ha sido sumergida en DMSO o en rojo de fenol, asegúrese de enjuagarla con PBS antes de aplicarla al embrión.Transfiera la bolita al embrión utilizando la pinza, y luego use el alambre de tungsteno afilado para insertar la bolita en el sitio de la incisión. Añada un volumen adicional de uno a dos mililitros de la solución de PBS suplementado al huevo para asegurar que el embrión se mantenga hidratado. Evite aplicar la solución directamente sobre el embrión, ya que esto puede dañar al embrión y provocar el desplazamiento de la bolita.A continuación, utilice una jeringa de diez mililitros, equipada con una aguja de calibre 19, para extraer solo la cantidad de albúmina necesaria para asegurar que el embrión no haga contacto con la cinta utilizada para sellar el huevo. Asegúrese de que la aguja no dañe la yema deslizándola por la parte interna del cascarón. Finalmente, selle el huevo con cinta y devuélvalo al incubador.Con el fin de confirmar que FGF18 es capaz de actuar a través de MEK para fosforilar ERK, los embriones se recolectaron una hora después del injerto de la perla y se inmunomarcaron para detectar la presencia de ERK fosforilada, que puede observarse rodeando la perla injertada en la imagen de la derecha. En la etapa HH 21, MyoD no se expresa en los mioblastos en desarrollo de las extremidades. Aunque se puede observar tinción en el miótomo de los somitas en desarrollo.Seis horas después de un injerto con una perla de FGF18, se puede observar la inducción de MyoD en mioblastos cercanos a la perla, mientras que no hay expresión en la extremidad contralateral. Esta expresión puede inhibirse mediante el injerto simultáneo de una perla recubierta con un inhibidor de MEK, como U0126.De manera similar, el injerto de una perla con U0126 en la etapa HH 21 reduce la expresión endógena de MyoD después de 24 horas, en comparación con la extremidad contralateral no tratada. En los brotes de extremidades, en la etapa HH 19, el FGF18 no induce a MyoD. Sin embargo, el injerto conjunto de perlas impregnadas con FGF18 y un antagonista del ácido retinoico puede superar este efecto, y se detecta MyoD ectópico.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro minutos, si se lleva a cabo correctamente. El desarrollo de esta técnica permitió a los investigadores en el campo de la biología del desarrollo explorar la señalización de los factores de crecimiento en el desarrollo embrionario. Al intentar esta técnica, es importante recordar no dejar que el embrión se seque.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo injertar perlas en embriones en desarrollo para determinar cómo la señalización de factores de crecimiento afecta el desarrollo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Aprenda a injertar cuentas en extremidades de embrión de pollo para estudiar factores de crecimiento y vías de señalización. Este método permite analizar la expresión génica in vivo en biología del desarrollo.

Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica (Video) | JoVE Journal

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