Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo determinar los efectos de los factores de crecimiento y los inhibidores en la expresión génica de las extremidades de embriones de pollo en desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del desarrollo, como cómo las moléculas de señalización influyen en el crecimiento y las diferenciaciones de las células in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método para probar estos factores directamente en el embrión.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo de las extremidades, también se puede aplicar a otros sistemas, como el tejido neural, los somitos o la gastrulación. La demostración del procedimiento estará a cargo de Rebeea Mohammed, una estudiante graduada de mi laboratorio. Para comenzar, transfiera un mililitro de las perlas de la solución madre original a un tubo nuevo.

Deje que las cuentas se asienten, luego retire el líquido y reemplácelo con un mililitro de PBS. Repita este paso cinco veces y almacene las perlas lavadas a cuatro grados centígrados, como una suspensión en PBS. Seleccione las perlas para el injerto, retirándolas de la solución madre lavada con una pipeta de 20 microlitros y colóquelas en un mililitro de PBS.

Con un estereoscopio, elija cuentas que tengan alrededor de 100 micras de diámetro. Transfiera las perlas seleccionadas en dos microlitros de líquido a una nueva placa de Petri que contenga una gota de 20 mililitros de PBS A continuación, retire el PBS de las perlas. Primero, con una pipeta de 20 microlitros y, a continuación, eliminar el líquido residual por capilaridad con unas pinzas de relojero fino.

Es importante eliminar la mayor cantidad de líquido posible para que el factor de crecimiento no se diluya cuando se agregue a las perlas. Pipetea el factor de crecimiento directamente sobre las perlas. Para FGF18, agregue 0.5 microlitros de FGF18 recombinante, agregue 0.5 miligramos por mililitro en PBS con 0.1 por ciento de BSA.

Luego, coloca varias gotas de agua alrededor de los bordes del plato para evitar que el líquido se evapore. Cuando esté listo, incube las perlas durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire las gotas de agua del plato con una pipeta Pasteur y coloque el plato sobre hielo.

Derivatice las cuentas, usando primero una espátula para transferir las cuentas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, añade un mililitro de ácido fórmico normal al 0,2 y hornea las perlas en el ácido en una plataforma de agitación durante una hora. A continuación, deje que las perlas se asienten, retire el ácido fórmico y reemplácelo con un mililitro de agua.

Lave las perlas durante una hora en la plataforma de agitación y repita el lavado seis veces para eliminar cualquier residuo de ácido fórmico. Después del último lavado, retire el líquido restante y guarde las perlas a cuatro grados centígrados. Use una espátula para quitar una pequeña paleta de cuentas de aproximadamente cinco a diez microlitros de volumen del caldo y coloque las cuentas en una placa de Petri de 30 mililitros.

A continuación, añade un mililitro de DMSO. A continuación, utilice una pipeta P2 ajustada a dos microlitros, para transferir perlas de aproximadamente 100 micras de diámetro, a una gota de 20 microlitros de disolvente en otra placa de Petri de 30 mililitros. Elimine la mayor parte del disolvente con una pipeta de 20 microlitros y cualquier disolvente residual con una pipeta de dos microlitros.

A continuación, cubra las perlas con 20 microlitros del fármaco a aplicar, disuelto en DMSO. Incube las perlas en la solución del medicamento durante una hora. Proteja las perlas de la luz, ya que muchas moléculas de medicamentos son sensibles a la luz.

Para ayudar a visualizar las perlas, transfiera de cuatro a cinco perlas en dos microlitros de líquido, en 20 microlitros de rojo de fenol al dos por ciento disuelto en agua. Retire una sola cuenta con pinzas de relojero fino y enjuague la cuenta en PBS. No deje perlas en la solución de rojo de fenol durante más de 15 minutos antes de enjuagarlas, ya que esto puede causar la pérdida de actividad.

Corte alambre fino de tungsteno en longitudes de tres a cuatro centímetros Luego, inserte una pieza del alambre en el extremo de una pipeta Pasteur de vidrio y derrita en un mechero Bunsen para fijarlo en su posición. Prepare hasta 10 agujas para asegurarse de que haya repuestos si están dañadas. A continuación, coloque el extremo del cable en la llama de un soplete y manténgalo allí hasta que el tungsteno brille en blanco y la punta esté afilada.

Esto tarda entre dos y tres minutos. Agregue de cinco a seis gotas de tinta china artística a 15 mililitros de PBS que contengan 100 unidades de penicilina y 0,1 miligramos de estreptomicina por mililitro. Para preparar los embriones de pollo, incube los huevos con el extremo romo hacia arriba hasta que alcancen la etapa deseada para la mayor manipulación de las yemas de las extremidades, que suele ser de tres a cinco días.

Cuando se alcance el punto de tiempo deseado, use pinzas romas para golpear el extremo romo del huevo y romper la cáscara. Luego, usa las pinzas para quitar la cáscara y exponer el embrión. Asegúrese de que también se elimine la membrana del óvulo.

Para visualizar el embrión, inyecte PBS suplementado con unas gotas de tinta china artística, debajo del embrión con una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 21. La membrana vitelina que recubre el embrión se puede extraer con pinzas finas. A continuación, agregue dos a tres mililitros de un PBS suplementado con un uno por ciento de suero fetal de ternero, 100 unidades por mililitro de penicilina y 0,1 miligramos por mililitro de estreptomicina, en el huevo para asegurarse de que el embrión no se deshidrate.

Con pinzas de relojero afiladas, abra el amnios sobre las yemas de las extremidades en desarrollo. En estas etapas, el embrión normalmente girará, de modo que el lado derecho esté más arriba. Asegúrese de que el embrión no se seque añadiendo más de la solución de PBS suplementada cuando sea necesario.

El amnios que rodea al embrión se puede abrir con una aguja fina de tungsteno para revelar la extremidad en desarrollo. Luego, use el alambre de tungsteno afilado para hacer una incisión en la yema de la extremidad donde se implantará la cuenta. Evite cortar todo el camino a través de la yema de la extremidad, siempre que sea posible.

Aunque en etapas más tempranas, esto es difícil. Toma una cuenta, recubierta con el factor de crecimiento o el medicamento con pinzas extra finas de relojero. Si la perla se ha empapado en DMSO o rojo fenol, asegúrese de enjuagarla con PBS antes de aplicarla al embrión.

Transfiera la cuenta al embrión con las pinzas y luego use el alambre de tungsteno afilado para insertar la cuenta en el lugar de la incisión. Agregue uno o dos mililitros adicionales de la solución suplementada de PBS al huevo para garantizar que el embrión se mantenga hidratado. Evita aplicar la solución directamente sobre el embrión, ya que esto puede dañar el embrión y hacer que la perla se desprenda.

A continuación, utilice una jeringa de diez mililitros, equipada con una aguja de calibre 19 para extraer solo la cantidad de albúmina necesaria para garantizar que el embrión no entre en contacto con la cinta utilizada para sellar el óvulo. Asegúrese de que la aguja no dañe la yema, deslizándola por el interior de la cáscara. Finalmente, selle el huevo con cinta adhesiva y devuélvalo a la incubadora.

Con el fin de confirmar que FGF18 es capaz de actuar a través de MEK para fosforilar ERK, los embriones se recolectaron una hora después del injerto de perlas y se inmunotiñeron para detectar la presencia de ERK fosforilada, que se puede ver alrededor de la perla injertada en la imagen de la derecha. En el estadio 21 de la HH, la MyoD no se expresa en los mioblastos de las extremidades en desarrollo. Aunque la tinción se puede ver en el miotoma de los somitas en desarrollo.

Seis horas después de un injerto de perla de FGF18, se puede ver MyoD inducido en el mioblasto cerca de la perla. Mientras que no hay expresión en la extremidad contralateral. Esta expresión puede inhibirse mediante el co-injerto de una perla, recubierta de un inhibidor de MEK como el U0126.

De manera similar, el injerto de una cuenta U0126 en la etapa HH 21 reduce la expresión endógena de MyoD después de 24 horas, en comparación con la extremidad contralateral no tratada. En las yemas de las extremidades, en la etapa HH 19, FGF18 no induce MyoD. Sin embargo, el co-injerto de perlas empapadas en FGF18 y un antagonista del ácido retinoico puede superar esto, y se detecta MyoD ectópico.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en tres o cuatro minutos, si se realiza correctamente. El desarrollo de esta técnica permitió a los investigadores en el campo de la biología del desarrollo explorar la señalización de los factores de crecimiento en el desarrollo embrionario. Al intentar esta técnica, es importante recordar que no debe dejar que el embrión se seque.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo injertar cuentas en embriones en desarrollo para determinar cómo la señalización de los factores de crecimiento afecta el desarrollo.