RM funcional Optogenética
19 de abril de 2016
Este protocolo describe los pasos y el análisis de datos necesarios para realizar con éxito la resonancia magnética funcional optogenética (ofMRI). ofMRI es una técnica novedosa que combina la lectura de fMRI de alto campo con la estimulación optogenética, lo que permite el mapeo específico del tipo de célula de los circuitos neuronales funcionales y su dinámica en todo el cerebro vivo.
El objetivo general de este procedimiento de imagen es combinar la IRMf con estimulación optogenética para la cartografía específica por tipo celular de circuitos neuronales funcionales y sus dinámicas en todo el cerebro vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como determinar el papel de elementos específicos de los circuitos cerebrales en la generación de la actividad cerebral global. La principal ventaja de esta técnica es que permite la estimulación específica por tipo celular y una lectura de actividad cerebral global con resolución espacial relativamente alta.
Este procedimiento será demostrado por Jia Liu y Zhongnan Fang, estudiantes de posgrado en mi laboratorio. Después de anestesiar al animal según se describe en el protocolo escrito, afeite la cabeza con una maquinilla eléctrica y realice un triple lavado quirúrgico sobre la piel utilizando Betadine y una enjuagada con etanol al 70 %. A continuación, inmovilice el cráneo del animal en un aparato estereotáxico.
Use un escalpelo para realizar una incisión media en el cuero cabelludo de 15 a 20 milímetros. Retraiga el cuero cabelludo utilizando hemostatos quirúrgicos fijados al periostio. Identifique las localizaciones de Lambda y Bregma en el cráneo, luego posicione la broca sobre la región de interés, o ROI.
Realice una pequeña craneotomía sobre la región de interés (ROI) con un taladro dental, teniendo cuidado de no perforar el cerebro. Inserte lentamente una aguja conectada a la jeringa de microlitros a través de la craneotomía hasta la región de interés en el cerebro. Luego, utilice un controlador de bomba de microjeringa para inyectar dos microlitros de la solución del vector en la región de interés.
Una vez finalizada la inyección, espere 10 minutos y luego retire lentamente la jeringa a una velocidad de 0,5 milímetros por minuto. Tras la inyección, seque la superficie del cráneo. Confirme las coordenadas de la región de interés e inserte el implante de brida hasta la profundidad objetivo a una velocidad de 0,5 milímetros por minuto.
Finalmente, fije el implante de la virola al cráneo utilizando cemento dental. Una vez que el cemento dental haya solidificado, cierre la incisión con puntos de sutura alrededor de la tapa de cemento dental. Comience conectando el cable de conexión fibroóptico a una fuente de luz láser y mida la salida en la punta del barril del cable de conexión mediante un medidor de potencia.
Ajuste el nivel de potencia adecuado para producir la salida deseada en la punta del cable de fibra óptica, que está implantado dentro del cerebro. Evite la fuga de luz desde el implante cubriendo los ojos del animal. Luego, coloque la bobina sobre la cabeza del animal.
Utilice un manguito de brida para sujetar el cable de fibra óptica al implante de brida. Inserte la camilla con el animal en el orificio del escáner. Monitoree la frecuencia respiratoria, el CO2 tidal y la temperatura corporal durante todo el experimento ajustando el ventilador artificial para mantener los valores fisiológicos dentro de los límites adecuados.
Conecte los cables BNC desde el puerto de disparo del escáner de MRI al generador de funciones. Seleccione una secuencia de posicionamiento y haga clic en escanear en la ventana de operación. Haga clic en continuar para obtener la imagen de la ubicación de la cabeza del animal.
Si el cerebro no está en el isocentro, ajuste la posición de la cabeza del animal y repita el escaneo de posicionamiento hasta que el cerebro esté en el isocentro. Adquiera una imagen anatómica de alta resolución para verificar la integridad general del cerebro y confirmar la ubicación del implante de fibra óptica. Luego, seleccione una secuencia ponderada en T2.
Ajuste el número de cortes y luego haga clic en escanear para adquirir las imágenes anatómicas coronales de alta resolución ponderadas en T2. Finalmente, seleccione una secuencia eco de gradiente multinivel, luego haga clic en continuar para adquirir la imagen funcional. Este protocolo utiliza fMRI optogenética para estimular la corteza motora en un modelo animal.
Este mapa de activación muestra vóxeles activados en la corteza motora y el tálamo, lo que indica conexiones sinápticas de largo alcance entre estas regiones. Aquí, la señal en negrita se muestra para los vóxeles activos en la corteza motora y el tálamo durante la estimulación optogenética de la corteza motora. La función de respuesta hemodinámica tálámica muestra una respuesta retardada en relación con la respuesta en la corteza motora tras la estimulación.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar cirugías de implante e imágenes por resonancia magnética funcional optogenética. Una vez dominado, este procedimiento de imágenes puede completarse en dos horas. Al intentar este procedimiento, es muy importante monitorear al animal y mantener su fisiología dentro de los límites normales.
Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar métodos complementarios, como la electrofisiología para investigar la dinámica temporal de la actividad neuronal, o la inmunohistoquímica para validar la expresión y especificidad de la opsina. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para que los neurocientíficos investigaran la conectividad funcional en un cerebro intacto y vivo. No olvide que trabajar con un escáner de MRI puede ser extremadamente peligroso.
Siempre se deben tomar precauciones, como mantener el equipo magnético suficientemente alejado del escáner, al seguir este procedimiento.
Resumen
Este protocolo describe el procedimiento y el análisis de datos para realizar imágenes por resonancia magnética funcional optogenética (ofMRI), una técnica que integra fMRI de alto campo con estimulación optogenética. Este método permite a los investigadores mapear circuitos neuronales funcionales y sus dinámicas en cerebros vivos con especificidad de tipo celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de imagen
- Optogenética
Antecedentes
- ofMRI combina la fMRI con la estimulación optogenética.
- Esta técnica permite la cartografía precisa de circuitos neuronales.
- Aborda preguntas clave sobre las funciones de los circuitos cerebrales.
- Una resolución espacial alta es una ventaja significativa de este método.
Objetivo del estudio
- Demostrar el uso de la ofMRI para estudiar circuitos neuronales.
- Proporcionar un protocolo detallado para investigadores.
- Destacar la importancia de monitorear los parámetros fisiológicos durante el procedimiento.
Métodos Utilizados
- Preparación del animal y anestesia.
- Craniotomía e inyección de la solución vectorial en el cerebro.
- Implantación del cable de fibra óptica y conexión a una fuente de luz láser.
- Uso del escáner de MRI para la adquisición de imágenes y datos.
Resultados principales
- Los mapas de activación muestran conexiones entre la corteza motora y el tálamo.
- Se demostró una respuesta hemodinámica retardada en el tálamo.
- Implementación exitosa de la estimulación optogenética durante la adquisición de imágenes.
- El procedimiento puede completarse en aproximadamente dos horas.
Conclusiones
- La ofMRI es una herramienta valiosa para estudiar la conectividad funcional en el cerebro.
- Mantener la fisiología del animal es crucial durante el procedimiento.
- Los métodos complementarios pueden mejorar la comprensión de la dinámica de la neuroactividad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La resonancia magnética funcional optogenética (ofMRI) permite la interrogación específica por tipo celular de circuitos neuronales con resolución espacial de todo el cerebro, apoyando la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos neuropsiquiátricos. Al vincular la manipulación precisa de circuitos con lecturas de actividad cerebral global, el método mejora la reducción de riesgos mecanicistas y la confianza predictiva en hipótesis iniciales sobre dianas. Esta capacidad facilita la selección de carteras al aclarar la conectividad funcional relevante para modelos de enfermedad y mecanismos terapéuticos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de elementos específicos del circuito cerebral en la generación de actividad global, apoyando la prueba de hipótesis terapéuticas.
- Valor operativo: Proporciona estimulación específica por tipo celular con lectura de alta resolución espacial de la dinámica cerebral.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera mapas de activación que muestran conexiones sinápticas de largo alcance, como entre la corteza motora y el tálamo, para el diseño de ensayos basados en circuitos.
- Valor operativo: Proporciona mediciones cuantitativas de la señal BOLD que permiten la comparación de condiciones de estimulación y respuestas de la red.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante la cartografía de la conectividad funcional en cerebros intactos y vivos en estados sanos y patológicos.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante imágenes no invasivas y repetibles de la actividad neuronal.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la biología del descubrimiento al permitir la comprobación de hipótesis sobre la función de circuitos, en la selección mediante salidas cuantitativas listas para ensayos y en la investigación traslacional a través de la cartografía conectómica relevante para enfermedades.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis, la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos de los blancos neuronales.
- Selección: Proporciona estandarización de ensayos, reproducibilidad y lecturas cuantitativas de BOLD para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Genera datos de la función de respuesta hemodinámica y mapas de activación para comparar la participación de circuitos en distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante el monitoreo de todo el cerebro en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma reutilizable para la validación de blancos basados en circuitos en diversos programas de descubrimiento en neurociencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos, reducción de ambigüedad mecanicista en hipótesis basadas en circuitos.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad del mapeo de activación cerebral específico por circuitos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en etapas avanzadas en programas neuropsiquiátricos.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en la interacción con el objetivo a nivel de circuito.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neurociencia, optogenética y física de resonancia magnética para la implantación quirúrgica y la adquisición de imágenes.
- Necesita un escáner de resonancia magnética de alto campo, una fuente de luz láser, implantes de fibra óptica y sistemas de monitoreo fisiológico.
- Exige estandarización entre equipos para protocolos quirúrgicos, parámetros de entrega de luz y secuencias de imagen.
- Implica consideraciones de adaptación entre especies, regiones cerebrales y sistemas de expresión de opsinas.
- Incluye limitaciones prácticas como la invasividad quirúrgica, la dispersión de la luz en el tejido y la complejidad en la interpretación de la señal hemodinámica.
