Name: RM funcional Optogenética (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Aprende a realizar resonancia magnética funcional optogenética para mapear circuitos neuronales específicos en cerebros vivos. Esta técnica combina estimulación óptica con alta resolución espacial para estudiar conectividad cerebral.

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Este trabajo fue financiado por el Premio R00 de los NIH/NIBIB (4R00EB008738), el Premio de la Fundación Okawa para la Beca de Investigación, el Premio al Nuevo Innovador del Director de los NIH (1DP2OD007265), el Premio NSF CAREER (1056008) y la Beca de Investigación de la Fundación Alfred P. Sloan. J.H.L. desea agradecer a Karl Deisseroth por proporcionar los plásmidos de ADN utilizados para los experimentos optogenéticos. Los autores también desean agradecer a Andrew Weitz y Mankin Choy por editar el manuscrito y a todos los miembros del Laboratorio Lee por su ayuda con los experimentos de resonancia magnética.

Declaración de Ética: Los procedimientos experimentales que aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford (IACUC). 1. Preparación de cables de conexión y la férula Implantes Nota: A pesar de que los cables de conexión y los implantes de casquillo están disponibles en el mercado, la producción de estos en casa permite diseños especiales y costará menos. <ol><li> Para preparar un cable de conexión de fibra para la entrega de luz desde el láser para el implante en el cerebro, primero escindir la fibra óptica a la longitud deseada. <ol><li> Usando un cuchillo de fibra, terminar la fibra óptica para producir un extremo plano en el punto de terminación. Si la fibra se ha recubierto con una chaqueta, tira de la chaqueta con una herramienta de fibra-stripping de antemano. </li><li> Escindir el otro extremo de la fibra óptica para producir la longitud deseada para el cable, asegurando que el cable es lo suficientemente largo para extenderse desde la fuente de luz para el animal dentro del orificio deel escáner. </li></ol></li><li> Mezcle una pequeña cantidad de pegamento epoxi en una proporción 1: 1 sobre una hoja de papel de aluminio poco antes de la siguiente etapa, como el pegamento de epoxi se vuelve demasiado viscosa para su uso 5 min después de la mezcla. </li><li> El uso de una paleta de madera, aplicar suavemente pegamento epoxi a la parte de la fibra que se coloca dentro del lado cóncavo de la férula de cerámica y luego aplicar una pequeña gota sobre la superficie de la parte plana de la férula. Después de insertar en el casquillo, asegúrese de que una pequeña longitud de fibra (&lt;0,5 mm) sobresale de la parte plana de la férula de cerámica. Deje que el pegamento epoxi se endurezca O / N para obtener resultados óptimos. </li><li> En el lado del cable de conexión de fibra óptica que conectará a la fuente de luz láser, aplicar suavemente pegamento epóxico a la parte de la fibra que se coloca dentro de la parte cóncava de la férula del conector FC / PC y luego aplicar una pequeña caer sobre la superficie del lado plano de la férula. Después de insertarlo en la virola, garantizarque una pequeña longitud de fibra (&lt;0,5 mm) sobresale del lado plano de la férula. Deje que el pegamento epoxi se endurezca O / N para obtener resultados óptimos. </li><li> Pulir el extremo plano de los casquillos de los dos lados del cable por medio de un disco de pulido utilizando pinzas para aplicar una presión suave hacia abajo en la férula al hacer rotaciones en forma de 8 en hojas lapidado óxido de aluminio (de 3 micras a 1 micra y 0,3 micras de grano ). </li><li> Examine el extremo plano de la férula con un microscopio a un aumento de 100X. Asegúrese de que la superficie del extremo plano, incluida la propia superficie de la fibra óptica, está libre de cualquier pegamento epoxi; continuar pulido si pegamento epoxi permanece en la superficie. Asegúrese de que la superficie de la fibra óptica no se ha roto o astillado. PRECAUCIÓN: Asegurar que el personal toman clases de formación de seguridad láser adecuados y usar gafas de seguridad con láser antes de manipular los equipos láser. </li><li> Conectar el cable de conexión de fibra óptica a la fuente de luz láser a través del conector FC / PC y alinear la fIber punta hasta el punto focal del acoplador. Medir la potencia de transmisión de luz de la fibra con un medidor de potencia para asegurar la salida de luz adecuada. Nota: Los siguientes pasos son para la preparación de los casquillos cerámicos con fibra óptica para la implantación crónica en el cerebro; los casquillos cerámicos son huecos en el centro y llevar la fibra óptica que suministra la luz de un cable de conexión a una región de interés (ROI) dentro del cerebro. </li><li> Usando un cuchillo de fibra, terminar la fibra óptica para producir un extremo plano en el punto de terminación. Si la fibra se ha recubierto con una chaqueta, tira de la chaqueta con una herramienta de fibra-stripping de antemano. </li><li> Escindir el otro extremo de la fibra óptica para producir la longitud deseada para su implantación en el cerebro. Determinar la longitud de la fibra utilizando un atlas estereotáxico para orientar la ROI dentro del cerebro. <ol><li> Por ejemplo: para apuntar hipocampo dorsal en rata que es de 3,5 mm por debajo de bregma, asegurarse de que la longitud de la fibra que sobresale de la ferrule es de 3,5 mm + 0,25 mm, que representan el espesor del cráneo y permitiendo margen de error. Por lo tanto, comprobar que la longitud final de la fibra es de 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (longitud de la virola) = 14.25 mm. </li></ol></li><li> Mezclar una pequeña cantidad de pegamento epoxi en una proporción 1: 1 sobre una hoja de papel de aluminio poco antes de la siguiente etapa (la cola epoxi se vuelve demasiado viscosa para su uso 5 min después de la mezcla). </li><li> El uso de una paleta de madera, aplicar suavemente pegamento epoxi a la parte de la fibra que se coloca dentro del lado cóncavo de la férula de cerámica y luego aplicar una pequeña gota sobre la superficie de la parte plana de la férula. Después de insertar en el casquillo, asegúrese de que una pequeña longitud de fibra (&lt;0,5 mm) sobresale de la parte plana de la férula de cerámica. Deje que el pegamento epoxi se endurezca O / N para obtener resultados óptimos. </li><li> Pulir el extremo plano de la férula utilizando un disco de pulido mediante el uso de unas pinzas para aplicar una presión suave hacia abajo en el casquillo mientras que hace la figura 8-rotacións en las hojas de lapidado óxido de aluminio (de 3 micras a 1 micra y 0,3 micras de grano). </li><li> Examine el extremo plano de la férula con un microscopio a un aumento de 100X. Asegúrese de que la superficie del extremo plano, incluida la propia superficie de la fibra óptica, está libre de cualquier pegamento epoxi; continuar pulido si pegamento epoxi permanece en la superficie. Asegúrese de que la superficie de la fibra óptica no se ha roto o astillado. </li><li> Acoplar el casquillo pulido a un cable de conexión de fibra óptica con una manga casquillo y conectar el cable de conexión a una fuente de luz láser. Medir la potencia de transmisión de la luz en la punta de la fibra con un medidor de potencia para asegurar el adecuado. </li><li> Mantener un registro de la salida de potencia requerida de la virola del cable de conexión para cada implante férula para dar salida al nivel de potencia deseado en la punta de la fibra óptica (2,5 mW en este protocolo). Desechar casquillos con una tasa de atenuación de más de 50% y con el patrón de salida no circular. </li></ol> 2. estereotáxica ImpCirugía lantation y de inyección Virus <ol><li> Asegúrese de que todos los procedimientos experimentales sobre la utilización de animales son aprobados por el IACUC local. Mantener las condiciones asépticas durante cirugías de supervivencia siguiendo procedimientos asépticos, incluyendo el uso de guantes estériles, máscaras estériles, paños quirúrgicos estériles e instrumentos quirúrgicos esterilizados. PRECAUCIÓN: Asegúrese de que los cirujanos están usando equipo adecuado de protección personal (EPP) incluyendo gafas de seguridad antes de comenzar el procedimiento. Siga los procedimientos de bioseguridad estándar cuando se trabaja con vectores adeno-asociado (AAV), teniendo cuidado de evitar salpicaduras. Eliminar los residuos de AAV en un contenedor de residuos sanitarios. </li><li> Cargar una jeringa de microlitro suficiente AAV para la inyección en el animal y un poco más para tener en cuenta las pérdidas de volumen potencial (total de 4 l por animal), manteniendo la jeringa en hielo antes de su uso. En este protocolo, se utiliza AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP a un título de 4x10 12 vg / ml. Colocar el animal bajo isofluranoe anestesia con una cámara de inducción, conectado a un conjunto vaporizador de isoflurano precisión con un 3 - 4% con una fuente de gas oxígeno. </li><li> Afeitarse la cabeza con una maquinilla de afeitar eléctrica y realizar un lavado quirúrgico triple en la piel con betadine y un enjuague de etanol al 70%. </li><li> Una vez que el animal se encuentra en la anestesia profunda (marque reflejo dedo del pie y ritmo respiratorio), inmovilizar el cráneo del animal en un aparato estereotáxico con tacos de posicionamiento intra-aurales y portadientes. Nota: Todo el procedimiento se llevará a 1 - 2 horas, desde la inducción de anestesia para la recuperación. </li><li> Establecer la anestesia a un nivel apropiado (1 - 3% de isoflurano en el vaporizador) y monitorear continuamente los signos vitales de los animales, el ajuste de la anestesia según sea necesario para mantener una tasa de respiración de ~ 40 respiraciones / min. Administrar pomada oftálmica en los ojos de los animales para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. </li><li> Hacer un 15 - incisión en la línea media del cuero cabelludo 20 mm con un bisturí y retraer el cuero cabelludo usando pinzas hemostáticas quirúrgicas unattached al periostio. lambda referencia y bregma para posicionar la broca sobre las coordenadas para el retorno de la inversión. </li><li> Perforar un pequeño craneotomía (2-3 mm) sobre el retorno de la inversión con un taladro dental, teniendo cuidado de no perforar el cerebro. Introduzca lentamente aguja unida a la jeringa de microlitro a través de la craneotomía con el retorno de la inversión en el cerebro. </li><li> Con un controlador de bombas microjeringa, inyectar 2 l de la solución vector en la ROI. Utilice una velocidad de flujo de 150 nl / min para evitar daños en los tejidos. Después de la inyección se ha completado, espere 10 min antes de retirar la jeringa lentamente, a una velocidad de 0,5 mm / min. </li><li> Después de la inyección, se seca la superficie del cráneo. lambda referencia y bregma confirmar las coordenadas y luego insertar el implante férula a la profundidad de destino (por ejemplo: de 3,5 mm por debajo de bregma hipocampo dorsal) a una velocidad de aproximadamente 0,5 mm / min. Montar el implante férula en el cráneo con cemento dental. Después de que el cemento dental se ha solidificado, sellar la incisión con suturas (SIze 5-0 para ratas) alrededor del tapón de cemento dental. </li><li> Después de la cirugía, colocar el animal en su jaula individualmente alojados con un medio de la jaula en la parte superior de un calentador para la recuperación de la anestesia. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No coloque el animal en compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. </li><li> Para la gestión post-quirúrgico del dolor, administrar buprenorfina por vía subcutánea cada 12 horas a una dosis de 0,05 mg / kg durante 24 horas. Administrar polvo antibiótico diario sobre el sitio de la incisión durante 3 días. </li><li> Retire las suturas aproximadamente dos semanas después de la cirugía para prevenir la formación de costras. </li><li> Espere 4 - 6 semanas después de la inyección de virus para la expresión suficiente de genes optogenética antes de realizar los experimentos. </li></ol> 3. resonancia magnética funcional Optogenética PRECAUCIÓN: Tenga precaución alrededor del campo magnético permanente de un escáner de resonancia magnética. equipm seguroent, incluyendo el generador de funciones, fuente de luz, ventilador, tanques capnógrafo y gas, lo suficientemente lejos (al menos más allá del límite de 5 Gauss). <ol><li> Colocar el animal bajo anestesia de gas con una cámara de inducción, conectado a un conjunto vaporizador de isoflurano precisión a 5% con una fuente de gas oxígeno. </li><li> Una vez que el animal se encuentra en anestesia profunda (reflejo del dedo del pie de verificación y frecuencia respiratoria), intubar al animal de acuerdo con el protocolo detallado en Rivard et al. (2006) para permitir la monitorización de dióxido de carbono por la capnografía 26. Nota: la intubación es crítico para mantener los niveles adecuados de CO 2 espiratorio durante la exploración. </li><li> Asegurar el animal en la base del escáner. Nota: En este protocolo, la cuna se produce a medida pero tales cunas están también disponibles comercialmente. Las funciones de la cuna de la rata para asegurar el animal dentro del escáner para la entrega de la anestesia, el aire caliente y para la restricción de movimiento. </li><li> Entregar una mezcla de isoflurano (ranging 1,2-1,5%) en óxido nitroso aproximadamente 60% y 40% de oxígeno a través de la tubería a través de la cuna. Asegúrese de que la cabeza del animal se fija con seguridad a fin de evitar los artefactos de movimiento. </li><li> Proporcionar aire caliente a través de la tubería en la cuna e insertar un termómetro rectal con lubricante para controlar la temperatura del cuerpo. Administrar pomada oftálmica en los ojos de los animales para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. </li><li> Conectar el cable de conexión de fibra óptica a una fuente de luz láser y medir la salida en la punta del casquillo del cable de conexión con un medidor de potencia. </li><li> Ajuste al nivel de potencia apropiado (previamente determinada en el paso 1,15) para producir la salida deseada (2,5 mW en este protocolo) en la punta de la fibra óptica implantado dentro del cerebro. Desde potencia de salida excesiva de la fibra óptica puede potencialmente causar daño a los tejidos dentro del cerebro o provocar el calentamiento del tejido que va a producir artefactos de señal, no aumente significativamente la potencia de salida del lásermás allá de la salida prevista. </li><li> Prevenir las fugas de luz desde el implante con un cono de cinta aislante negro y cubrir los ojos del animal. Acoplar el cable de fibra óptica al implante virola sobre el animal con un manguito de casquillo. </li><li> Coloque la bobina sobre la cabeza del animal. Insertar la cuna con el animal en el orificio del escáner. Nota: En este protocolo, el de un solo lazo transmisión-recepción de la bobina se produce a medida y pre-sintonizado para recibir la frecuencia de radio óptima del tejido cerebral. </li><li> Controlar la frecuencia y la temperatura corporal para respirar durante todo este proceso, el ajuste del respirador artificial y calefacción según sea necesario para mantener los valores fisiológicos dentro de los límites (asegurarse de que la espiración de CO 2 es 3 - 4% girando las perillas en el ventilador para ajustar la longitud de carrera y el volumen y que la temperatura es de 37 ° C haciendo clic en las flechas para el ajuste de la temperatura). </li><li> Seleccionar una secuencia de posicionamiento de la imagen de la ubicación de cabeza de animal. Si la blluvia no está en el centro de iso-para ajustar la posición de cabeza de los animales y repetir la búsqueda del posicionamiento hasta que el cerebro está en el iso-central. Seleccione una secuencia lineal y cuñas de carga, haga clic en la ventana de selección de secuencia. A continuación, haga clic en inicio para reducir la falta de homogeneidad del campo magnético. Nota: Nivelación es un paso crítico que influirá directamente en la integridad de los datos de la fMRI. </li><li> Seleccione una secuencia ponderada en T2 y haga clic en la carga en la ventana de selección de secuencia. A continuación, haga clic en inicio para adquirir imágenes de alta resolución anatómicas coronales ponderadas en T2 antes de la fMRI para comprobar la integridad global del cerebro y para confirmar la ubicación del implante de fibra óptica. Nota: Estas imágenes se pueden utilizar como superposiciones de anatomía para la serie de exploración ofMRI. </li><li> Conectar los cables BNC de la activación de puertos del escáner de resonancia magnética para el generador de funciones de modo que la fuente de luz láser es accionado de acuerdo con un paradigma de estimulación experimental. Nota: En este protocolo, la estimulación pAradigm es de 30 seg de la línea de base, seguido de 20 segundos de encendido / apagado 40 segundos durante seis minutos. </li><li> Seleccionar un multicorte gradiente recordó secuencia de eco (GRE) y haga clic en la carga en la ventana de selección de secuencia. A continuación, haga clic en inicio para adquirir 35 mm x 35 mm (2D FOV) en el plano coronal rebanadas con 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm de resolución espacial. Nota: La secuencia GRE usada aquí tiene un tiempo de repetición (TR) y el tiempo de eco (TE) de TR / TE = 750/12 ms y un ángulo de 30 ° flip. </li><li> A la conclusión de la exploración, retire el animal desde el escáner y monitor hasta que se ha despertado de la anestesia y puede mantener decúbito esternal. </li></ol> 4. Análisis de los datos ofMRI Nota: Los siguientes pasos se realizan en MATLAB como se describe en una publicación de alto rendimiento ofMRI 27. <ol><li> Después de la exploración de datos en bruto se ha transferido a la computadora utilizada para el análisis, la reconstrucción de utilización del deslizamiento ventana para actualizar la imagen de todos los TR, conuna lectura espiral de cuatro intercalación, 750 TR ms y 12 ms tiempo de eco para adquirir 23 rebanadas por la serie de análisis. En lugar de la reconstrucción convencional donde las nuevas imágenes de resonancia magnética funcional se reconstruyen sólo después de que todas las hojas intercaladas se adquieren para cada sector, el método de reconstrucción de ventana deslizante reconstruye las imágenes después de la adquisición de cada 27 intercalada. </li><li> Procesar los datos en bruto para la reconstrucción de dos dimensiones grillado, corrección de movimiento, y el cálculo de series de tiempo como se ha descrito previamente 27. </li><li> Use un método para determinar la coherencia umbral voxels activados mediante el cálculo del porcentaje de modulación de la señal BOLD de cada voxel en relación con el período de referencia recogidos antes de la estimulación como se ha descrito previamente 27. Calcular los valores de coherencia como la magnitud de la transformada de Fourier en la frecuencia de los ciclos de estimulación repetida, dividido por los cuadrados de suma de todos los componentes de frecuencia de 8. </li><li> Utilizando los datos de series de tiempo para cada vOxel, las imágenes de movimiento promedio corregido que pertenecen a las exploraciones consecutivas del mismo paradigma de estimulación primeros. Entonces alinear las imágenes 4D promedio a un sistema de coordenadas común con una transformación cuerpo rígido de seis grados de libertad, más de escala isotrópica para la comparación dentro y entre los animales como se describió anteriormente 27. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El movimiento del sujeto cuando se toman imágenes es una fuente significativa de artefacto que puede conducir a la corrupción de datos. Apropiadamente asegurar el animal en la base de formación de imágenes puede minimizar tales artefactos como se mantenimiento de los niveles de anestesia apropiadas. En este caso, hemos utilizado isoflurano, pero anestésicos alternativos, tales como la medetomidina o ketamina y xilacina, también deben ser considerados. Sin embargo, los niveles y la elección del anestésico pueden influir en muchos parámetros en el cerebro, incluyendo la respuesta BOLD 28. El isoflurano puede causar cambios en la excitabilidad neuronal 29. Otros anestésicos también pueden afectar a la inhibición sináptica de GABA 30. Por lo tanto, la elección de la anestesia es importante cuando se realizan ofMRI dada su capacidad de afectar a la actividad neuronal. ofMRI en ausencia de anestesia es posible, pero puede ser difícil con el aumento de movimiento del animal, que puede ser reducido si el animal está habituado; anteriormente se han realizado estos estudios despierto ofMRI unand evitaría el efecto de confusión de la anestesia en el cerebro 9,10. Post-procesamiento de los algoritmos de corrección de movimiento se pueden utilizar para mitigar en gran medida los efectos del movimiento. Varios de estos métodos existen, incluyendo la inversa algoritmo de Gauss-Newton empleado en este protocolo, lo que minimiza la suma de los cuadrados función de coste de la imagen de referencia y la imagen en virtud de corrección. El algoritmo es útil, ya que permite la corrección de movimiento rápido y robusto, con un diseño de plataforma paralela de la GPU para reducir los tiempos de procesamiento 27. Para la reconstrucción de datos en este protocolo, software escrito en un entorno de MATLAB se utiliza para la reconstrucción de cuadriculado de dos dimensiones, donde las muestras de espiral se reconstruyen en el espacio k en imágenes reticulares 31-33. series temporales de datos se generaron mediante el cálculo del porcentaje de modulación de la señal BOLD de cada voxel en relación con el período de referencia recogidos antes de la estimulación. Voxels cuyas series de tiempo se synchronized a bloques de estimulación optogenética con un valor coherencia de 0,35 o superior se definieron como los voxels activados; este valor corresponde a una coherencia de menos de 10 -9 valor de p 8. Valores de coherencia se calcularon como la magnitud de la transformada de Fourier en la frecuencia de los ciclos de estimulación repetida, dividido por los cuadrados de suma de todos los componentes de frecuencia de 8,27. familywise de error puede ser controlado utilizando la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Los métodos alternativos de análisis pueden ser usados, incluyendo pruebas estadísticas paramétricas como los modelos lineales generales (GLM). El método de la coherencia requiere menos conocimiento previo de la HRF en comparación con el modelo lineal general convencional. Por lo tanto, es ventajoso cuando la exploración de datos utilizando ofMRI. Sin embargo, el método de la coherencia sólo se puede utilizar para los datos con los diseños de bloques o seleccionado diseños relacionados con eventos con un intervalo inter fijo y no se puede usar en los datos ofMRI con otro evento-relaTed diseños o diseños mixtos. Posteriormente, el modelado causal dinámica (DCM) se puede utilizar para analizar las interacciones entre las regiones del cerebro identificados a través de ofMRI. DCM es una técnica estadística bayesiana desarrollado para el análisis de la conectividad funcional a partir de las respuestas del sistema a las entradas experimentales durante fMRI 34. Aquí se discuten las preocupaciones técnicas adicionales para ofMRI. Los implantes pueden ser dañados o se caigan, lo que lleva a la eliminación del animal afectado del estudio. cirugías reimplantación no se recomiendan debido a la incertidumbre adicional de dirigir el mismo retorno de la inversión como en la cirugía de implantación original y debido a cuestiones de bienestar animal. Debido a la cantidad significativa de tiempo y recursos invertidos en cada sujeto animal, la consideración de la resistencia del material es una preocupación significativa cuando la elección de un cemento dental adecuado para su uso en estudios ofMRI. La cirugía de implantación es un factor crítico para maximizar la longevidad de la IMPlant y sujeto animal. Por ejemplo, asegurándose de que el cráneo esté seca antes de aplicar el cemento dental y la colocación de una cantidad adecuada de cemento alrededor del implante férula de cerámica puede garantizar la estabilidad de potencial de línea de tiempo de meses de duración del animal durante el estudio. Además, los diseños alternativos de la jaula pueden ser explorados y discutidos con la instalación de cuidado de animales local para evitar jaulas de alambre con las tapas que llevan a cabo la comida y el agua que a menudo sobresalen en la jaula y proporcionar oportunidades para que el animal dañar el implante. Es importante destacar que, el cemento dental deben ser elegidos cuidadosamente para reducir los artefactos que afectan de imágenes y cementos alternativos pueden ser probados por la aplicación sobre un fantasma y de formación de imágenes en un escáner antes de su uso en experimentos con animales. Ensayo y error con diferentes cementos dentales se ha demostrado que el cemento utilizado en este protocolo da relativamente pocos artefactos. Otro desafío técnico en la realización de ofMRI es la precisión de la colocación de la fibra óptica en el retorno de la inversión prevista, dado el extremely pequeñas distancias que pueden existir entre los núcleos en el cerebro 35. Después de completar las cirugías de implantación, las exploraciones anatómicas ponderadas en T2 se pueden utilizar para determinar la colocación correcta mediante la superposición sobre un atlas cerebral. La habilidad del cirujano y la práctica de realizar estas cirugías puede mejorar las tasas de colocación correctas. La especificidad y la expresión de la opsina en el retorno de la inversión prevista se pueden verificar en la conclusión del estudio de perfusión del animal y se fija el cerebro, mediante inmunohistoquímica o la fluorescencia endógena de una proteína indicadora etiquetados a la opsina para la visualización. Estas proteínas indicadoras también pueden ser colocalized con otras proteínas para asegurar que la opsina se expresa en los tipos de células neuronales deseadas 1,8,15,25. Como se mencionó anteriormente, los artefactos pueden surgir cuando se realiza ofMRI debido al calentamiento de los tejidos de suministro de luz 22. El calentamiento de los tejidos causa la modificación de los tiempos de relajación, lo que resulta en la señal BOLD falsa. Para asegurarse de que activación resultante de la estimulación de luz durante ofMRI no se debe a este artefacto, controles opsina-negativos se deben realizar en los que o bien solución salina inyectada animales o animales inyectados con vectores de control de fluoróforos (tales como AAV-CamKIIa-EYFP) experimentan ofMRI. Además, los implantes de fibra óptica solamente bien construido con una buena eficiencia de transmisión de la luz se deben utilizar para eliminar la necesidad de utilizar potencias de láser de alta. ofMRI estudios se han realizado en los que la activación falsa debido al calentamiento de los tejidos no ha sido un problema 1,6-8,10,11. En cuanto a la elección del vector para introducir los genes en las neuronas optogenética requeridas para la expresión, AAV no se sabe que causan enfermedades en los seres humanos y por lo tanto son una opción conveniente, teniendo en cuenta el nivel de bioseguridad más baja necesaria para utilizar estos agentes (BSL-1). Además, una multitud de núcleos de vectores AAV llevar envasados ​​con diferentes genes optogenética en stock y con múltiples serotipos. El serotipo de AAV debe ser elegido bobre la base de la población de células diana destinadas a garantizar los niveles de expresión óptimos 36,37. Los lentivirus también se pueden utilizar pero requieren un nivel de bioseguridad superior. El período de tiempo requerido para la expresión suficiente de los genes optogenética es variable dependiendo del modelo animal específico utilizado, en el AAV particular usado y en el paradigma experimental específico. En este protocolo, ratas Sprague Dawley de 11 semanas de edad se utilizan y los estudios comienzan optogenética cuatro a seis semanas después de la inyección de virus. Los ratones transgénicos se pueden utilizar también en estudios optogenética. Es necesario llevar a cabo experimentos piloto para determinar la cantidad específica de tiempo requerido para la expresión suficiente de las opsinas. paradigmas de estimulación pueden variar dependiendo de la opsina específico usado. En este protocolo, AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP se utiliza y el paradigma de estimulación es de 20 segundos de encendido / apagado 40 seg. Si se utiliza un SSFO, el paradigma de estimulación variará debido a que el SSFO requiere sólo un breve pulso de luz para ser activated y luego de un breve pulso de luz en otra longitud de onda para ser terminado. Una preocupación fundamental adicional al realizar ofMRI es la prevención de fugas de luz desde la interfaz implante casquillo con el cable de conexión de fibra óptica durante la estimulación optogenética para evitar una señal de confusión cerebral procedente de la estimulación visual, incluso cuando se anestesia el animal. Conos de cinta aislante negro se pueden utilizar para bloquear la luz de los casquillos y para cubrir los ojos del animal. Es importante destacar que los valores fisiológicos incluyendo espiratorio CO 2 y la temperatura corporal del sujeto deben mantenerse adecuadamente a lo largo de la duración de la formación de imágenes. CO espiratorio 2 debe mantenerse entre 3-4% y la temperatura corporal a 37 ° C. Además, las secuencias de compensación magnética para reducir lo más posible falta de homogeneidad como en el campo magnético antes de iniciar ofMRI escanea en gran medida determina la calidad de los datos BOLD resultantes. El control de estos factoreses crítico en la producción de datos fiables ofMRI. En este protocolo, el láser DPSS se utilizan como fuente de luz para la estimulación optogenética. Debido a que la luz láser es coherente, la potencia que se puede suministrar fácilmente a través de la fibra óptica. fuentes de luz LED junto a la fibra óptica están disponibles de proveedores comerciales, pero tienen la desventaja de potencia reducida de transmisión de la luz. La fuente de luz láser requiere la alineación de cada cable de conexión de fibra óptica particular, pero con la práctica, la alineación se puede lograr en cuestión de segundos a minutos. Las futuras aplicaciones de ofMRI incluyen el uso de opsinas de próxima generación, como opsinas desplazadas al rojo para permitir la estimulación no invasiva durante la exploración. Además, la implantación de MRI compatible-EEG o electrodos de registro similares a lo largo con el implante de fibra óptica podría permitir la adquisición de datos de alta resolución temporal, además de los datos de alta resolución espacial de MRI. ofMRI con Electrophysiologyogical grabación podría proporcionar amplia información sobre la conectividad funcional del cerebro. En resumen, el poder de ofMRI para controlar todo el cerebro en respuesta a la estimulación de las poblaciones de células específicas definidas por identidad genética o anatómica hace ofMRI una herramienta crítica para utilizar en el estudio de enfermedades neurológicas y de las conectómica del cerebro sano.

Optogenética imágenes de resonancia magnética (ofMRI) es una nueva técnica que combina la resolución espacial de alto campo fMRI con la precisión de la estimulación optogenética 1-11,38, lo que permite la cartografía específica del tipo celular de los circuitos neuronales funcionales y su dinámica en el conjunto cerebro. Optogenética permite para determinados tipos de células a ser objeto de estimulación mediante la introducción de canales de conductancia transmembrana, llamados opsinas sensibles a la luz. Los elementos específicos de los circuitos neuronales se modifican genéticamente para expresar estos canales, lo que permite la modulación de milisegundos-escala de tiempo de actividad en el cerebro intacto 1-15. fMRI proporciona un método no invasivo de determinar la respuesta dinámica global de cerebro a la estimulación optogenética de circuitos neuronales específicos a través de la medición de la señal de sangre-oxígeno-dependiente del nivel de (BOLD) 16 a 18, que proporciona una medida indirecta de la actividad neuronal. La combinación de estas dos técnicas, denominado optogenético imágenes de resonancia magnética (ofMRI), es ventajoso sobre otros métodos de grabación de la actividad del cerebro durante la estimulación como electrofisiología ya que puede proporcionar una vista de todo el cerebro a relativamente alta resolución espacial. Esto permite la detección de la actividad neuronal en respuesta a la estimulación dirigida a grandes distancias desde el sitio de estimulación sin la necesidad de implantación de electrodos de registro invasivos 1-11. ofMRI es ventajoso con respecto al método más tradicional de realizar la estimulación eléctrica durante fMRI, que puede reclutar diferentes tipos de células cerca del electrodo y por lo tanto confundir la influencia causal de cada población 19. Además, los electrodos utilizados para la estimulación eléctrica y la corriente generada puede producir artefactos durante la RM 20. De hecho, ofMRI permite la observación de la influencia en la actividad cerebral global desde el modulati específicaen de una amplia variedad de tipos de células a través del uso de técnicas avanzadas de modificación genética dirigida, como el sistema Cre-Lox en animales transgénicos o el uso de promotores. control óptico combinatoria con monitorización de todo el cerebro es posible con ofMRI mediante el uso de ambos NpHR para inhibir y ChR2 para excitar tipos de células específicos. El kit de herramientas optogenético disponibles para su uso en ofMRI también está mejorando rápidamente en el tiempo con la introducción de opsinas con una mayor sensibilidad a la luz o la mejora de la cinética, de opsinas función de paso estabilizados (SSFOs) o de opsinas desplazadas al rojo que puede negar la necesidad de fibra implantada la óptica, lo que permite la estimulación no invasiva durante la exploración 21. Estas posibilidades no están disponibles con la estimulación eléctrica. Sin embargo, los artefactos de señal resultantes de calentamiento del tejido, debido a la entrega de luz en el cerebro se han notificado 22, donde la modificación inducida por la temperatura de los tiempos de relajación se ha demostrado que producen pseuhacer activación. Por lo tanto, los investigadores que realizan ofMRI deben ser conscientes de este potencial factor de confusión. Con la configuración y el control adecuados, el problema puede ser abordado. Además, relativamente baja resolución temporal de la medición de la respuesta hemodinámica en fMRI puede ser un factor limitante para ciertas aplicaciones de esta técnica. Este protocolo describe primero la construcción de los implantes de fibra óptica que permiten la entrega de longitudes de onda específicas de la luz profundamente en el cerebro in vivo. El protocolo a continuación, describe la entrega del vector viral opsina que codifica para una región del cerebro precisa el uso de la cirugía estereotáctica. A continuación, el protocolo describe el proceso de resonancia magnética funcional de todo el cerebro durante la estimulación simultánea de luz. Finalmente, el protocolo describe el análisis de datos de base de los datos adquiridos. Es de destacar que la optogenética descrito aquí requiere un implante crónico para suministro de luz. Sin embargo, los implantes de fibra óptica son estables y biocompatible, lo que permite la exploración longitudinal y la investigación de los circuitos neuronales durante un período de meses 23,24. En resumen, la estimulación más precisa y la capacidad de vigilancia de todo el cerebro de ofMRI son factores cruciales en la toma de ofMRI una poderosa herramienta para el estudio de los conectómica del cerebro. Además, se puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de las enfermedades neurológicas 25 cuando junto con diferentes modelos animales. De hecho, ofMRI se ha utilizado para elucidar la actividad de red de subregiones del hipocampo distintos asociados con convulsiones 8. Por lo tanto, los laboratorios interesados ​​en responder a las preguntas de la neurociencia sistemas de nivel encontrarán esta técnica de importancia.

<table><tbody><tr><td>7 Escáner Tesla</td><td>Agilent</td><td>Technologies Discovery MR901 System</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley ratas</td><td>Charles River</td><td>Crl:SD</td><td>11 semanas de edad</td></tr><tr><td>cortadora de fibra</td><td>Fujikura</td><td>CT-05</td><td></td></tr><tr><td>fibra óptica multimodo</td><td>Thor Labs</td><td>AFS105/125Y</td><td></td></tr><tr><td>peladora de fibra&nbsp; &nbsp;</td><td>Thor Labs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>manguito dividido de cerámica</td><td>Productos</td><td>de fibra de precisión SM-CS1140S</td><td></td></tr><tr><td>pegamento epoxi</td><td>Thor Labs</td><td>G14250</td><td></td></tr><tr><td>aplicadores con punta de algodón</td><td>Stoelting Co.</td><td>50975</td><td></td></tr><tr><td>férulas de circonio cerámico multimodo</td> Productos de fibra <td>de precisión</td><td>MM-FER2002</td><td></td></tr><tr><td>Conector multimodo FC/PC Disco</td> de pulido de fibra óptica <td>Thor Labs</td><td>30128C3</td><td></td></tr><tr><td>Productos de fibra</td><td>óptica</td><td>M1-80754</td><td></td></tr><tr><td>hoja de lapeado de óxido de aluminio, 0.3 y micro; m</td><td>Lámina de lapeado de óxido de aluminio Thor Labs</td><td>LFG03P</td><td></td></tr><tr><td>, 1 y micro; m</td><td>Hoja de</td> lapeado de óxido de aluminio Thor Labs <td>LFG1P</td><td></td></tr><tr><td>, 3 y micro; m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG3P</td><td></td></tr><tr><td>microscopio biológico binocular 40X-1,000X</td> Gafas de seguridad láser <td>Amscope</td><td>B100</td><td></td></tr><tr><td>Kentek</td><td>KXL-62W01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>473 nm Láser DPSS</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0473</td><td></td></tr><tr><td>594 nm Láser DPSS</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0594</td><td></td>Juego</tr><tr><td></td><td></td> de llaves<td>hexagonales Allen</td><td>2,0 mm (5/64") para la alineación de la punta de la fibra al punto focal del acoplador en el</td></tr><tr><td>medidor de potencia láser, sensor de silicio, 400-1.100 nm</td><td>Thor Labs</td><td>PM121D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Isothesia)</td><td>Henry Schein&nbsp;</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>vaporizador de isoflurano con cámara de inducción</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil 100 &micro; l jeringa</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump con controlador SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>generador de funciones</td><td>A.M.P.I.&nbsp;</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>estereotasa de animales pequeños</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Modelo 683 ventilador para animales pequeños&nbsp;</td><td>Aparato Harvard</td><td>550000</td><td></td></tr><tr><td>Tipo 340 capnógrafo&nbsp;</td><td>Taladro dental Harvard Apparatus</td><td>733809</td><td></td></tr><tr><td>(kit de micromotor rotativo)</td><td>Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>ungüento oftálmico (lágrimas artificiales)</td><td>Rugby</td><td>00536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>esterilizador de instrumentos</td><td>CellPoint Scientific</td><td>Germinator 500</td><td>esterilizador de perlas de vidrio</td></tr><tr><td>antibiótico en polvo</td><td>Pfizer</td><td>NEO-PREDEF</td><td>sulfato de neomicina, acetato de isoflupredona y clorhidrato de tetracaína</td></tr><tr><td>analgésico de buprenorfina</td><td>Hospira</td><td>NDC:0409-2012</td><td>sustancia controlada de la lista III, 0,3 mg/ml de stock</td></tr></tbody></table>

rm funcional optogenética

Optogenetic Functional MRI

La investigación de la conectividad funcional de circuitos neuronales precisos en todo el cerebro intacto se puede lograr a través de imágenes de resonancia magnética funcional optogenética (ofMRI), que es una técnica novedosa que combina la resolución espacial relativamente alta de la fMRI de alto campo con la precisión de la estimulación optogenética. La fibra óptica que permite la entrega de longitudes de onda específicas de luz en las profundidades del cerebro in vivo se implanta en regiones de interés para estimular específicamente tipos de células específicas que han sido inducidas genéticamente para expresar canales de conductancia transmembrana sensibles a la luz, llamados opsinas. La resonancia magnética funcional se utiliza para proporcionar un método no invasivo para determinar la respuesta dinámica global del cerebro a la estimulación optogenética de circuitos neuronales específicos mediante la medición de la señal dependiente del nivel de oxígeno en sangre (BOLD), que proporciona una medición indirecta de la actividad neuronal. Este protocolo describe la construcción de implantes de fibra óptica, las cirugías de implantación, las imágenes con fotoestimulación y el análisis de datos necesarios para realizar con éxito la resonancia magnética. En resumen, la estimulación precisa y la capacidad de monitorización de todo el cerebro de la resonancia magnética son factores cruciales para hacer de la resonancia magnética una herramienta poderosa para el estudio de la conectómica del cerebro tanto en estados sanos como enfermos.

<html> La Figura 1 y la Figura 2 muestran datos representativos que resultan de 20 Hz (15 mseg de ancho de pulso, 473 nm, ciclo de trabajo 30%) estimulación optogenética de la corteza motora. Un paradigma de estimulación de 30 segundos de la línea de base seguido de 20 segundos de encendido / apagado para 40 seg se utilizó seis minutos. Estudios anteriores han demostrado que este paradigma produce señal BOLD robusto de 1,8 estimulación optogenética. La Figura 1 muestra voxels activados detectados tanto en el sitio local de la estimulación (corteza motora) y en el tálamo, como resultado de las conexiones sinápticas de largo alcance entre estas regiones. la Figura 2 muestra que la información temporal se puede extraer de HRF, como la respuesta del tálamo se retrasa (menor pendiente inicial) en comparación con la respuesta de la corteza motora después de la estimulación optogenética. p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Mapa de activación BOLD señal inducida por la estimulación de las células Optogenética CamKIIa expresan en la corteza del motor. Valores de coherencia de los voxels activos, identificadas como aquellas sincronizadas de manera significativa a las estimulaciones repetidas, se muestra superpuesta sobre una rebanada coronal anatómica en T2. Los datos recogidos durante un período de seis min, 30 seg período (de referencia inicial de 30 segundos y seis ciclos de estimulación de 20 segundos de encendido / apagado 40 segundos con 473 nm de luz, 20 Hz, 15 ms de ancho de pulso) se condensan en un solo mapa de activación. Rodajas secuenciales son de 0,5 mm de distancia y la ubicación del implante de fibra óptica se denota por el triángulo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53346/53346fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Función hemodinámica Response. (Izquierda) El porcentaje de modulación de la señal BOLD respecto al valor basal se muestra para voxels activos en la corteza motora y el tálamo durante la estimulación de la corteza optogenético motor (seis ciclos de estimulación de 20 segundos de encendido / apagado 40 sec con 473 nm de luz, 20 Hz, 15 ms de ancho de pulso). barras de error grises sombreadas indican el error estándar en todos los voxels activados dentro de ROI. (Derecha) respuestas promediada en el tiempo están dadas por las funciones de respuesta hemodinámica (HRF). El tálamo HRF muestra una respuesta retardada con respecto a la corteza motora estimulado. Las barras azules indican los períodos de 473 nm fotoestimulación. Barras de error grises sombreadas indican el error estándar a través de seis ciclos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53346/53346fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe los pasos y el análisis de datos necesarios para realizar con éxito la resonancia magnética funcional optogenética (ofMRI). ofMRI es una técnica novedosa que combina la lectura de fMRI de alto campo con la estimulación optogenética, lo que permite el mapeo específico del tipo de célula de los circuitos neuronales funcionales y su dinámica en todo el cerebro vivo.

RM funcional Optogenética

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

El objetivo general de este procedimiento de imagen es combinar la IRMf con estimulación optogenética para la cartografía específica por tipo celular de circuitos neuronales funcionales y sus dinámicas en todo el cerebro vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como determinar el papel de elementos específicos de los circuitos cerebrales en la generación de la actividad cerebral global. La principal ventaja de esta técnica es que permite la estimulación específica por tipo celular y una lectura de actividad cerebral global con resolución espacial relativamente alta.Este procedimiento será demostrado por Jia Liu y Zhongnan Fang, estudiantes de posgrado en mi laboratorio. Después de anestesiar al animal según se describe en el protocolo escrito, afeite la cabeza con una maquinilla eléctrica y realice un triple lavado quirúrgico sobre la piel utilizando Betadine y una enjuagada con etanol al 70 %. A continuación, inmovilice el cráneo del animal en un aparato estereotáxico.Use un escalpelo para realizar una incisión media en el cuero cabelludo de 15 a 20 milímetros. Retraiga el cuero cabelludo utilizando hemostatos quirúrgicos fijados al periostio. Identifique las localizaciones de Lambda y Bregma en el cráneo, luego posicione la broca sobre la región de interés, o ROI.Realice una pequeña craneotomía sobre la región de interés (ROI) con un taladro dental, teniendo cuidado de no perforar el cerebro. Inserte lentamente una aguja conectada a la jeringa de microlitros a través de la craneotomía hasta la región de interés en el cerebro. Luego, utilice un controlador de bomba de microjeringa para inyectar dos microlitros de la solución del vector en la región de interés.Una vez finalizada la inyección, espere 10 minutos y luego retire lentamente la jeringa a una velocidad de 0,5 milímetros por minuto. Tras la inyección, seque la superficie del cráneo. Confirme las coordenadas de la región de interés e inserte el implante de brida hasta la profundidad objetivo a una velocidad de 0,5 milímetros por minuto.Finalmente, fije el implante de la virola al cráneo utilizando cemento dental. Una vez que el cemento dental haya solidificado, cierre la incisión con puntos de sutura alrededor de la tapa de cemento dental. Comience conectando el cable de conexión fibroóptico a una fuente de luz láser y mida la salida en la punta del barril del cable de conexión mediante un medidor de potencia.Ajuste el nivel de potencia adecuado para producir la salida deseada en la punta del cable de fibra óptica, que está implantado dentro del cerebro. Evite la fuga de luz desde el implante cubriendo los ojos del animal. Luego, coloque la bobina sobre la cabeza del animal.Utilice un manguito de brida para sujetar el cable de fibra óptica al implante de brida. Inserte la camilla con el animal en el orificio del escáner. Monitoree la frecuencia respiratoria, el CO2 tidal y la temperatura corporal durante todo el experimento ajustando el ventilador artificial para mantener los valores fisiológicos dentro de los límites adecuados.Conecte los cables BNC desde el puerto de disparo del escáner de MRI al generador de funciones. Seleccione una secuencia de posicionamiento y haga clic en escanear en la ventana de operación. Haga clic en continuar para obtener la imagen de la ubicación de la cabeza del animal.Si el cerebro no está en el isocentro, ajuste la posición de la cabeza del animal y repita el escaneo de posicionamiento hasta que el cerebro esté en el isocentro. Adquiera una imagen anatómica de alta resolución para verificar la integridad general del cerebro y confirmar la ubicación del implante de fibra óptica. Luego, seleccione una secuencia ponderada en T2.Ajuste el número de cortes y luego haga clic en escanear para adquirir las imágenes anatómicas coronales de alta resolución ponderadas en T2. Finalmente, seleccione una secuencia eco de gradiente multinivel, luego haga clic en continuar para adquirir la imagen funcional. Este protocolo utiliza fMRI optogenética para estimular la corteza motora en un modelo animal.Este mapa de activación muestra vóxeles activados en la corteza motora y el tálamo, lo que indica conexiones sinápticas de largo alcance entre estas regiones. Aquí, la señal en negrita se muestra para los vóxeles activos en la corteza motora y el tálamo durante la estimulación optogenética de la corteza motora. La función de respuesta hemodinámica tálámica muestra una respuesta retardada en relación con la respuesta en la corteza motora tras la estimulación.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar cirugías de implante e imágenes por resonancia magnética funcional optogenética. Una vez dominado, este procedimiento de imágenes puede completarse en dos horas. Al intentar este procedimiento, es muy importante monitorear al animal y mantener su fisiología dentro de los límites normales.Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar métodos complementarios, como la electrofisiología para investigar la dinámica temporal de la actividad neuronal, o la inmunohistoquímica para validar la expresión y especificidad de la opsina. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para que los neurocientíficos investigaran la conectividad funcional en un cerebro intacto y vivo. No olvide que trabajar con un escáner de MRI puede ser extremadamente peligroso.Siempre se deben tomar precauciones, como mantener el equipo magnético suficientemente alejado del escáner, al seguir este procedimiento.

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Investigación

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