RM funcional Optogenética

El objetivo general de este procedimiento de imagen es combinar la resonancia magnética funcional con la estimulación optogenética para el mapeo específico del tipo de célula de los circuitos neuronales funcionales y su dinámica en todo el cerebro vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como determinar el papel de elementos específicos de los circuitos cerebrales en la conducción de la actividad cerebral global. La principal ventaja de esta técnica es que permite la estimulación específica del tipo de célula y la lectura de la resolución espacial relativamente alta de la actividad cerebral global.

Los que demuestren este procedimiento serán Jia Liu y Zhongnan Fang, estudiantes graduados de mi laboratorio. Después de anestesiar al animal como se describe en el protocolo de texto, afeitar la cabeza con una maquinilla de afeitar eléctrica y realizar un lavado quirúrgico triple en la piel con Betadine y un enjuague con etanol al 70%. A continuación, inmovilizar el cráneo del animal en un aparato estereotáxico.

Use un bisturí para hacer una incisión de 15 a 20 milímetros en la línea media del cuero cabelludo. Retraer el cuero cabelludo con hemostáticos quirúrgicos adheridos al periostio. Identifique las ubicaciones de Lambda y Bregma en el cráneo, luego coloque la broca sobre la región de interés o ROI.

Perfore una pequeña craneotomía sobre el ROI con un taladro dental, teniendo cuidado de no perforar el cerebro. Inserte lentamente una aguja conectada a la jeringa de microlitros a través de la craneotomía en el ROI en el cerebro. A continuación, utilice un controlador de bomba de microjeringa para inyectar dos microlitros de la solución vectorial en el ROI.

Una vez completada la inyección, espere 10 minutos, luego retire lentamente la jeringa a una velocidad de 0,5 milímetros por minuto. Después de la inyección, seque la superficie del cráneo. Confirme las coordenadas del retorno de la inversión e inserte el implante de férula a la profundidad objetivo a una velocidad de 0,5 milímetros por minuto.

Finalmente, monte el implante de férula en el cráneo con cemento dental. Después de que el cemento dental se haya solidificado, selle la incisión con suturas alrededor de la tapa del cemento dental. Comience conectando el cable de conexión de fibra óptica a una fuente de luz láser y mida la salida en la punta del barril del cable de conexión con un medidor de potencia.

Ajuste el nivel de potencia adecuado para producir la salida deseada en la punta del cable de fibra óptica, que se implanta dentro del cerebro. Evite la fuga de luz del implante cubriendo los ojos del animal. Luego, coloca la bobina sobre la cabeza del animal.

Utilice un manguito de férula para sujetar el cable de fibra óptica al implante de férula. Inserte la cuna con el animal en el orificio del escáner. Controle la frecuencia respiratoria y el CO2 corriente y la temperatura corporal durante todo el experimento ajustando el ventilador artificial para mantener los valores fisiológicos dentro de los límites adecuados.

Conecte los cables BNC desde el puerto de activación del escáner de resonancia magnética al generador de funciones. Seleccione una secuencia de posicionamiento y haga clic en escanear'en la ventana de operación. Haga clic en continuarpara obtener la imagen de la ubicación de la cabeza del animal.

Si el cerebro no está en el isocentro, ajuste la ubicación de la cabeza del animal y repita la exploración de posición hasta que el cerebro esté en el isocentro. Adquiera una imagen anatómica de alta resolución para verificar la integridad general del cerebro y confirmar la ubicación del implante de fibra óptica. A continuación, seleccione una secuencia ponderada T2.

Ajuste el número de cortes y, a continuación, haga clic en escanear para obtener las imágenes anatómicas coronales de alta resolución ponderadas en T2. Finalmente, seleccione una secuencia de eco recordada de gradiente de múltiples cortes, luego haga clic en continuar'para adquirir la imagen funcional. Este protocolo utiliza la resonancia magnética optogenética F para estimular la corteza motora en un modelo animal.

Este mapa de activación muestra vóxeles activados en la corteza motora y el tálamo, lo que indica conexiones sinápticas de largo alcance entre estas regiones. Aquí, la señal en negrita se muestra para vóxeles activos en la corteza motora y el tálamo durante la estimulación optogenética de la corteza motora. La función de respuesta hemodinámica talámica muestra una respuesta retardada en relación con la respuesta en la corteza motora después de la estimulación.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar cirugías de implantación y resonancia magnética funcional optogenética. Una vez dominado, este procedimiento de diagnóstico por imágenes se puede completar en dos horas. Al intentar este procedimiento, es muy importante monitorear al animal y mantener su fisiología dentro de los límites normales.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar métodos complementarios, como la electrofisiología para investigar la dinámica temporal de la neuroactividad, o la inmunohistoquímica para validar la expresión y especificidad de la opsina. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para que los neurocientíficos investigaran la conectividad funcional en un cerebro vivo e intacto. No olvide que trabajar con un escáner de resonancia magnética puede ser extremadamente peligroso.

Siempre se deben tomar precauciones como mantener el equipo magnético lo suficientemente lejos del escáner mientras se sigue este procedimiento.