Name: Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a medir el apego y la internalización del virus de la influenza A en células epiteliales pulmonares A549 mediante citometría de flujo. Este método semicuantitativo utiliza unión en frío y cambio de temperatura para distinguir entre virus adheridos e internalizados.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (31003A_135278) para SSt. MOP es el beneficiario de una beca de doctorado del Fondo de Investigación AXA. Agradecemos a Patricia Nigg en busca de ayuda con el diseño de la figura 1.

Nota antes del comienzo: la campana de flujo laminar y Uso biocontención adecuada cuando se trabaja con virus vivo. A continuación, describimos las condiciones de crecimiento adecuadas a la tensión virus de la influenza cultura A / WSN / 33. Multiplicidad de infección (MOI) de incubación y tiempos pueden variar dependiendo de la cepa de virus utilizada. 1. Preparación de biotinilado A / WSN / 33 Virus <ol><li> Las células en un matraz T175 cm 2 utilizando Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) Madin-Darby Seed kindey canino (MDCK). Células de cultivo a 37 ° C hasta aproximadamente el 70% de confluencia se alcanza. </li><li> Antes de la infección, retire medio y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH7.0-7.3) mediante la adición de un volumen lo suficientemente grande como para cubrir la monocapa de células. </li><li> Retire PBS e infectar las células con A / WSN / 33 con una MOI de 10 -4. Diluir virus en PBS suplementado con 0,02 mg de Mg 2 +, 0,01 mg de Ca2 + &lt;/ sup&gt;, 0,3% de albúmina de suero bovino (BSA), y 1% Pen / Strep (infección-PBS). Utilice un inóculo de 4 ml para un matraz T175 cm 2. </li><li> Se incuban las células 1 hora a 37 ° C. Retire inóculo por aspiración y pipeta 10 ml de DMEM suplementado con 0,3% de BSA, 20 mM HEPES, y el 1% penicilina / estreptomicina en el matraz. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante aproximadamente 3 días hasta que el efecto citopático (CPE) es visible, y después de la cosecha sobrenadante. CPE puede ser reconocido como el redondeo de las células seguido de desprendimiento y muerte de las células 14. </li><li> Girar sobrenadante a 450 xg durante 5 min para eliminar restos celulares. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Falcon y repita este paso una vez más. Deseche los pellets. </li><li> Sobrenadantes de transferencia en tubos de ultracentrífuga y sobrenadantes de capas de base con 5 ml de sacarosa al 30% diluido en tampón NTE (10 mM de Tris [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibre los tubos antes de la ultracentrifugación y se llenan con PBS para alcanzar un volumen final de 30 ml. Girar supernatantes en 112.398 xg (correspondiente a 25.000 rpm para un rotor SW28) durante 90 min en una ultracentrífuga. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con la pipeta y disfrutar sedimento de virus durante la noche a 4 ° C en 250 l de PBS. Resuspender pellet pipeteando arriba y abajo. Mida el contenido de proteínas del virus purificado por Bradford ensayo 15. </li><li> Utilice un kit de biotinilación para generar biotina A / WSN / 33. Siga las instrucciones del fabricante. </li><li> En resumen, añadir la cantidad apropiada de biotina para el virus purificado y se incuba durante 2 h en hielo. Transferencia de virus a un tubo de ultracentrífuga y llenar el tubo con PBS para alcanzar un volumen final de 30 ml. Haga girar virus a 112.389 xg durante 90 minutos en una ultracentrífuga. Aspirar el sobrenadante con la pipeta y añadir 250 l de PBS. Remoje pellet durante la noche a 4 ° C. Alícuota y almacenar el virus biotinilado se almacenó a -80 ° C donde va a ser estable durante al menos 24 meses. NOTA: Puede ser útil para determinar el título de la p biotiniladoreparación de IAV por ensayo de placa estándar. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el protocolo posterior sólo medir partículas de virus biotinilado. Restante partículas no biotinilados debido a biotinilación incompleta contribuirá a la título infeccioso mediante ensayo en placa pero no a la señal medida en el ensayo de unión / internalización. </li></ol> 2. Determinar la cantidad necesaria de Biotinylated Virus NOTA: Antes de realizar el ensayo de unión / internalización, es importante para determinar la cantidad de virus requerida para infectar biotinilado todas las células de una muestra. <ol><li> Cultura y células A549 trypsinize de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Contar las células por medio de una cámara de celular. Pipeta células 200.000 A549 en FACS Deepwell tubos. Spin 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 200 l de PBS. Hacia abajo en hielo durante 10 min Super células. </li><li> Preparar 5 veces diluciones seriadas del biotistock de virus en la infección por nylated-PBS. </li><li> Centrifugar los tubos que contienen las células a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100 l infección PBS que contiene el virus. Como el uso de control de la infección maqueta-PBS sin virus biotinilado. Incubar los tubos en hielo durante 1 hr. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. Repita este paso una vez más. </li><li> Para la fijación, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 100 l de 3,7% de paraformaldehído (PFA). Incubar durante 10 min a TA. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4). </li><li> Para permeabilización, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 l de PBS que contiene 0,5% de Triton X-100. Incubar durante 6 min a TA. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4). </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender pellet en 50 l 2% de BSA diluido en PBS que contenía STV-Cy3. (Tenga en cuenta que la concentración apropiada de STV-Cy3 debe determinarse antes de iniciar el experimento Comience con una concentración de 1:. 200 y la prueba 2 veces diluciones de hasta 1:. 2400 En nuestras manos, una dilución de 1: 1000 probado a ser óptimo.) </li><li> Incubar 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4, pero resuspender el precipitado en 200 l 2% de BSA diluido en PBS. </li><li> Analizar muestras por citometría de flujo 16. Puerta de la población Cy3-positivo. Elige la concentración más baja de virus biotinilado resultante en el número máximo de células Cy3-positivas en la población A549. </li></ol> 3. Determine la cantidad necesaria de estreptavidina NOTA: La eficiencia de bloquear la señal derivada de virus extracelular determina el rango de detección del ensayo. Por lo tanto, es importante que se suprime la señal de STV-Cy3 tanto como sea posible. The cantidad necesaria de STV necesario depende de la cantidad de stock de virus biotinilado utilizado (determinado en la sección 2). <ol><li> Siga los pasos 2.1-2.4, pero el uso de concentración del virus determina en el apartado 2. </li><li> Preparar diluciones seriadas de cinco veces de STV diluidos en PBS que contenía 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV dilución. Como el uso de control de simulacro de PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio y sin STV. Incubar los tubos durante 30 min en hielo. A continuación, repita paso de lavado descrito en 2.4. </li><li> Siga los pasos 2,5-2,9. Para el ensayo de internalización, elegir la concentración más baja de STV que resulta en un fuerte bloque de la señal de Cy3 (en comparación con la muestra en la que no estaba presente STV). Para ello, el porcentaje de células Cy3-positivo o la intensidad media de fluorescencia de la señal de Cy3 se puede utilizar. Idealmente, la señal de Cy3 de muestras tratadas con STV debe ser lo más cercano a la señal de infectados por el simulacrocélulas como sea posible. </li></ol> 4. Adjunto / Ensayo Internalización NOTA: Asegúrese de preparar todos los reactivos antes de comenzar el ensayo. Para los tres grupos de control que se presentan en la sección de resultados (células infectadas simuladas, las células pre-tratadas de la neuraminidasa y células azida sódica tratados) pequeñas alteraciones en el protocolo son obligatorios. <ol><li> Preparar 16 tubos para pozos profundos que contienen cada 200.000 células A549. Al lado del conjunto experimental que consta de 4 tubos, hay 3 condiciones de control, cada uno que requieren 4 tubos: las células infectadas, la neuraminidasa (NA) células -pretreated y células tratadas con azida de sodio. Cada grupo consta de 4 tubos etiquetados como &quot;0 min&quot;, &quot;0 min + STV &#39;, &#39;30 minutos&#39;, &#39;30 minutos + STV &#39;. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender pellet 200 en DMEM que contiene 0,3 l% de BSA, HEPES 20 mM y 1% (medio de incubación) penicilina-estreptomicina. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C. NOTA: Para el control de la neuraminidasa: Uso neuraminidasa bacteriana (por ejemplo, la sialidasa de Vibrio cholera) a una concentración de 200 mU / ml diluido en medio de incubación para resuspender las células. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. Repita este paso una vez más, a continuación, los tubos se enfríe en hielo durante 10 min. </li><li> Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 100 l virus biotinilado (utilizar la concentración de virus determina en el apartado 2 diluido en la infección-PBS). Incubar 1 hora en hielo. A continuación, repita paso de lavado descrito en 2.4. NOTA: Para el control de modelo de infectados: Uso infección PBS sin virus. Para el control de azida de sodio: Uso virus diluido en PBS-infección suplementado con 0,1% de azida de sodio. </li><li> Proprocesamiento de las muestras después de la infección en hielo: <ol><li> Para las muestras &#39;0 min&#39;, siga el paso 2.5 y almacenar las muestras a 4 ° C hasta que se fijan las otras muestras. </li><li> Para el &#39;0 min + STV&#39; muestras, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV (utilizar la concentración determinada en la sección 3) diluido en PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio (para evitar la internalización durante la manipulación de la muestra). Incubar 30 min en hielo. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C. </li><li> Para las muestras de &#39;30 minutos &#39;, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS que contienen 2% de BSA. Incubar 30 minutos a 37 ° C. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C. NOTA: Para el control de azida de sodio: Uso PBS suplementado con 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 ° C. </li><li> Para el &#39;30 min + muestras STV &#39;giran tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS que contienen 2% de BSA. Incubar 30 minutos a 37 ° C. Entonces, los tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV (utilizar la concentración determinada en la sección 3) diluido en PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio (para evitar la internalización durante la manipulación de la muestra). Incubar 30 min en hielo. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C. NOTA: Para el control de azida de sodio: Uso PBS suplementado con 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Siga los pasos 2.6-2.8 y analizar muestras por citometría de flujo. Determinar el porcentaje de células Cy3-positivos en cada muestra. </li><li> Calcular el porcentaje adjunta virus y la cantidad relativa de virus internalizado. <ol><li> Para calcular la cantidad de virus adjunto, utilice el porcentaje de Cy3-positive células cerradas o la intensidad de fluorescencia media de la señal de Cy3. Para la comparación, establezca las células no tratadas a 100% (Figura 4B). NOTA: El porcentaje de virus adjunto se describe por la muestra &quot;0 min&quot;. </li><li> Para calcular la cantidad de virus interiorizado, tomar la relación entre el &quot;30 min + STV&quot; muestra al &quot;30 minutos&quot; de la muestra (Figura 5B). NOTA: Como se mencionó anteriormente, el porcentaje de células cerradas positivos Cy3 o la intensidad media de fluorescencia de la señal de Cy3 se puede utilizar. </li></ol></li></ol>

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<li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li>
<li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu%3A+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemothe%22%5BJournal%5D)">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li>
<li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li>
<li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death%2C+and+disease%22%5BJournal%5D)">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
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<li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Viro%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro protocolo describe una manera fácil de medir la fijación del virus y la internalización por citometría de flujo. Se permite el uso de virus de tipo salvaje marcado que imita más estrechamente las infecciones de virus en comparación con el uso de partículas similares a virus (VLP). Mientras que nuestro protocolo se ha optimizado para medir unión e internalización de IAV puede ser fácilmente adaptado para otros virus. Además, como la citometría de flujo se utiliza para la lectura, los compañeros de tinciones puede...

La entrada de los virus de influenza A (IAV) es un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión del virus a los receptores en la membrana plasmática de las células diana 1. El receptor para IAV es el ácido siálico que está presente en una gran variedad de glicoproteínas y glicolípidos. La hemaglutinina (HA) de proteína de IAV que está presente en la envoltura viral se une al ácido siálico y por lo tanto media en la unión de las partículas virales a la membrana plasmática de las células diana 2. El virus entra en las células a través de endocitosis mediada por clatrina, sino también a las vías de entrada alternativos, como macropinocitosis, se han descrito 6.3. La interacción entre HA y ácido siálico parece ser suficiente para mediar tanto, el apego y desencadenar la internalización de las partículas virales 7. Sin embargo, se han propuesto los receptores de ingreso alternativas y sus roles en la entrada IAV están siendo investigados 1,8,9. Canallatualmente, se hacen esfuerzos para identificar los factores del huésped que están involucrados en el ciclo de vida viral con el objetivo de desarrollar urgentemente necesarias nuevas terapias antivirales 10-12. La entrada del virus sería un paso favorable para orientar el crecimiento IAV con el fin de bloquear la infección viral en su punto más temprano. Medición de las diferentes etapas de la entrada IAV experimentalmente es un reto ya que se requieren por lo general grandes cantidades de virus para detectar virus entrante. Además, el rango de detección de los cambios en la entrada del virus es solamente lineal debido a la falta de replicación viral. Esto pone de relieve la necesidad de ensayos con alta sensibilidad. El ensayo que aquí presentamos permite la detección de virus unido a la superficie celular, así como la detección de virus internalizado en relación con la cantidad total de virus asociado a células. El uso de virus de tipo salvaje biotina permite la medición conveniente a través de tinción con STV-Cy3 y lectura por citometría de flujo. Virus biotinilado es frío ligado a la células para permitir la unión, sino evitar la internalización de las partículas virales. Las células pueden ser fijos, permeabilizaron y se tiñeron con STV-Cy3 para medir virus adjunto. La señal procedente de viriones extracelulares, adjuntos puede ser derogada si se aplica una etapa de bloqueo antes de la fijación en la que las células se incuban con estreptavidina no marcada (STV). En un siguiente paso, después de la fijación de biotina IAV, la temperatura se desplaza a 37 ° C y la internalización de las partículas virales se dejó que tuviera lugar. Partículas internalizadas están protegidos de la unión de STV permitiendo así que la discriminación entre virus extra e intracelulares. Por condición experimental, se requieren cuatro muestras: &#39;0 min&#39;: La primera muestra, con la etiqueta &quot;0 min &#39;, es medir el virus frío con destino en la superficie celular. &#39;0 min + STV&#39;: La segunda muestra, con la etiqueta &quot;0 min + STV &#39;, da la intensidad de la señal de referencia del experimento. Virus adjunto se bloquea ingenioh STV y la señal después de la tinción con STV-Cy3 deberían ser mucho menor en comparación con la muestra &#39;0 min&#39;. &#39;30 Minutos &#39;: La tercera muestra, &#39;30 minutos&#39; contiene adjunta y el virus internalizado debido al cambio de temperatura a 37 ° C durante 30 minutos. &#39;30 Min + STV &#39;: La cuarta muestra, &#39;30 minutos + STV&#39; mide la fracción intracelular de virus. La etapa de bloqueo STV se aplica después del período de incubación 30 min. Como resultado, las partículas virales en la superficie celular están obligados por STV dejando solamente los virus internalizados disponible para la tinción con STV-Cy3. La cantidad relativa de virus internalizado se puede calcular como la relación de virus internalizado (medido en el &#39;30 min + STV &#39;muestra) dividido por la cantidad total de virus (descrito por el &#39;30 min&#39; muestra). Como controles se sugiere incluir las células infectadas. La señal después de la tinción STV-Cy3 de células infectadas da el fondoresultante de el protocolo de tinción. Un control para la fijación IAV es el pre-tratamiento de las células con neuraminidasa bacteriana (NA). Escinde NA fuera de ácido siálico de las glicoproteínas celulares, eliminando de este modo los receptores de unión de la superficie celular. La azida de sodio (SA) es un potente inhibidor metabólico y por lo tanto bloquea la endocitosis 13. Las células tratadas con azida de sodio deben ser positivos para la unión virus pero negativo para la internalización.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-sacarosa</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTINA kit</td><td>Fisher Scientific</td><td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>tubos de pocillos profundos (microtubos de 1,2 ml)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&nbsp; Lucerna chem&nbsp; Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>tubos de ultracentrífuga</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>azida de sodio</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>neuraminidasa bacteriana/ sialidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de apego y internalización del virus de la influenza en células a549 por citometría de flujo

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

La unión a las células diana seguida de la internalización son los primeros pasos del ciclo de vida del virus de la gripe A (IAV). Proporcionamos aquí un protocolo detallado para medir los cambios relativos en la cantidad de partículas virales que se adhieren a las células A549, una línea celular epitelial del pulmón humano, así como en la cantidad de partículas que se internalizan en la célula. Utilizamos virus biotinilados, que se pueden detectar fácilmente después de la tinción con estreptavidina marcada con Cy3 (STV-Cy3). Describimos el crecimiento, purificación y biotinilación de A/WSN/33, una cepa de laboratorio de IAV ampliamente utilizada. Las partículas IAV biotiniladas unidas en frío en células A549 se tiñen con STV-Cy3 y se miden mediante citometría de flujo. Para investigar la absorción de partículas virales, se permite que el virus unido al frío se internalice a 37 °C. Para diferenciar entre partículas virales externas e internalizadas, se aplica un paso de bloqueo: los puntos de unión libres en la biotina del virus adherido a la superficie celular se unen a la estreptavidina (STV) no marcada. La posterior permeabilización celular y la tinción con STV-Cy3 permiten la detección de partículas virales internalizadas. Presentamos un cálculo para determinar la cantidad relativa de virus internalizado. Este ensayo es adecuado para medir los efectos de los tratamientos farmacológicos u otras manipulaciones sobre la fijación o internalización de la IAV.

Un dibujo animado que describe las cuatro condiciones experimentales diferentes se muestra en la Figura 1 Los resultados de un experimento representativo se presentan en las Figuras 2 -. 5. En la muestra &quot;0 min&quot;, virus biotinilado es frío unida a células que pueden ser visualizadas por tinción STV-Cy3 objetivo (Figuras 1 y 2). Cuando se aplica una etapa de bloqueo (en el &quot;0 min + STV&quot; muestra), el vi...

Presentamos un protocolo que describe un método semicuantitativo para medir tanto la unión del virus de la influenza A a las células A549, como la internalización de partículas virales en las células objetivo mediante citometría de flujo.

Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la adhesión y la internalización del virus de la influenza en células epiteliales pulmonares A549. Esto se logra mediante una unión en frío del virus de la influenza a las células A549, lo que permite la adhesión pero evita la captación de las partículas virales.A continuación, se permite la internalización del virus elevando la temperatura a 37 grados Celsius. Luego se realiza un paso de bloqueo en el que el strp Aden no marcado se une a la superficie celular. Se lleva a cabo la unión de virus para discriminar entre partículas virales unidas e internalizadas.Finalmente, el virus biotinilado asociado a la célula se incuba con estreptavidina marcada con CY tres y se utiliza citometría de flujo para detectar los virus teñidos. En última instancia, se calcula la cantidad relativa de virus adheridos e internalizados. Aunque este método puede proporcionar información sobre la cantidad relativa de influenza, un virus que se adhiere e internaliza en células 5 0 9.También puede aplicarse a otros sistemas que utilicen líneas celulares diferentes u otros virus. Después de generar el virus biotinilado y determinar las cantidades necesarias del virus marcado, strep din y SI tres strep din marcado según el protocolo descrito en el texto, prepare cuatro tubos de pozo profundo, cada uno conteniendo 200,000 células A549. Etiquete los tubos como cero minutos, cero minutos más STV, 30 minutos y 30 minutos más STV. A continuación, centrifugue los tubos.Elimine el sobrenadante y use 200 microlitros de PBS para resuspender los pellet. Luego, después de centrifugar los tubos nuevamente, use 200 microlitros de un medio de crecimiento estándar 5 49 para resuspender las células, incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos; tras la incubación, centrifugue las muestras y resuspenda los pellet en 200 microlitros de PBS. Después de repetir el lavado una vez más, enfríe los tubos en hielo durante 10 minutos. Cuando los tubos se hayan enfriado, centrifugue nuevamente y use 100 microlitros de virus biotinilado diluido en PBS de infección para resuspender los pellet; tras incubar en hielo durante una hora, repita la centrifugación y lave con PBS dos veces, procesando las muestras siguientes en paralelo tanto como sea posible para las muestras de cero minutos.Después de centrifugar, use 100 microlitros de paraformaldehído al 3,7 % o PFA para resuspender el sedimento celular. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de centrifugar y usar PBS para lavar las células dos veces tras la fijación. Almacene a cuatro grados Celsius hasta que todas las muestras hayan sido procesadas.Para tratar las muestras del minuto cero más STV, centrifugar los tubos, eliminar el sobrenadante y usar 15 microlitros de STV con 2 %BSA y 0,1 %azida sódica en PBS para resuspender el sedimento celular; incubar en hielo durante 30 minutos. Luego, centrifugar y usar PBS para lavar las células dos veces tras la fijación con PFA como se acaba de demostrar. Almacenar las muestras a cuatro grados Celsius para las muestras de 30 minutos. Después de centrifugar y eliminar el sobrenadante, usar PBS con 2 %BSA para disolver las muestras.Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos antes de lavar con PBS y fijar con PFA. Luego almacenar las muestras a cuatro grados Celsius durante 30 minutos más las muestras STV. Después de la centrifugación, suspendemos las muestras en 200 microlitros de PBS con 2 %BSA, tras un periodo de incubación a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Centrifugar y resuspender las células en 50 microlitros de STV con 2 % de BSA y 0,1 % de azida sódica en PBS, incubar en hielo durante 30 minutos antes de lavar y fijar. Luego, después de permeabilizar y teñir todas las muestras con STV SI tres, siguiendo los detalles del protocolo descrito en el texto, almacenar las muestras a cuatro grados Celsius. Finalmente, analizar las muestras mediante citometría de flujo.Determine el porcentaje de células positivas para CY tres en cada muestra. Calcule el porcentaje de virus adherido y la cantidad relativa de virus internalizado. De acuerdo con el protocolo descrito en el texto, como se muestra aquí en la muestra de cero minutos, el virus adherido está unido en frío a las células diana, tal como se visualiza mediante la tinción con St.V.SI tres.Cuando se aplica STV como un paso de bloqueo, el virus en la superficie celular ya no puede ser detectado mediante tinción con S St.V.SI, reduciendo fuertemente la señal. Cuando la temperatura se eleva a 37 grados Celsius, el virus adherido es internalizado por las células. El virus internalizado no es sensible al bloqueo con STV no marcado, lo que resulta en una disminución menos pronunciada de la intensidad de la señal en las muestras incubadas durante 30 minutos más STV que se muestran.Aquí se muestran los porcentajes de células positivas para SI tres en todas las condiciones experimentales descritas en este video. Las células mock infectadas proporcionan la intensidad de señal de fondo para el experimento y actúan como control negativo para la unión del virus. Otra neuraminidasa de control abroga fuertemente la unión del VAI en un 90 % en comparación con las células no tratadas.El azida sódica, que agota el ATP, inhibiendo así la endocitosis, inhibió la internalización de partículas virales tanto durante como después de la infección, como se muestra aquí: tras el tratamiento con azida sódica, las células incubadas durante 30 minutos a 37 grados Celsius mostraron una disminución drástica en la internalización en comparación con las células no tratadas incubadas en las mismas condiciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la unión y la internalización del virus de la influenza en células MDCK. Este protocolo permite una lectura conveniente mediante citometría de flujo y puede adaptarse fácilmente a otros entornos experimentales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Se describe el aislamiento rápido de células primarias de murino de tipo II alveolares epiteliales (AECII) por citometría de flujo negativo de selección. Estos AECII mostrar una alta viabilidad y pureza, y son adecuados para una amplia gama de estudios funcionales y molecular respecto a su función en condiciones respiratorias tales como enfermedades autoinmunes o infecciosas.

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

En este video, discutimos la correlación entre el CIT50 y la multiplicidad de infecciones virales. Las células infectadas por el virus muestran efectos citopáticos, causando su muerte y desprendimiento del microelectrodo de oro, lo que a su vez, reduce la impedancia.

Ensayo celular basado en impedancia para medir la multiplicidad de la infección por el virus de la influenza

Este video muestra el ensayo de adherencia bacteriana para evaluar la adherencia bacteriana marcada con GFP al cultivo de células epiteliales para estudiar la dinámica de las interacciones huésped-patógeno utilizando imágenes basadas en microscopía de fluorescencia.

Detección de la adherencia bacteriana a las células huésped mediante imágenes de fluorescencia

Este video muestra un ensayo que mide la activación mediada por anticuerpos de las funciones efectoras de las células T. La adición de un anticuerpo monoclonal específico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza a las células de mamíferos transfectadas que expresan HA da como resultado la formación de complejos inmunes con HA. Al introducir células T modificadas que expresan receptores Fc y un indicador de luciferasa, las células T son activadas por los complejos anticuerpo-HA, y esta...

Medición de la activación de las funciones efectoras mediadas por Fc por anticuerpos HA

El primer paso en el ciclo de vida del arenavirus es la unión de las partículas virales a las células huésped. Presentamos un ensayo cuantitativo basado en (q)RT-PCR para la detección y cuantificación ultrasensibles de eventos de adhesión de arenavirus.

Ensayo muy sensible para la medición del Adjunto de células arenavirus

Describimos el ensayo de lectina ligado a enzimas (ELLA) para medir los títulos de anticuerpos inhibidores de la neuraminidasa (NA) de la influenza en sueros. El ensayo utiliza aglutinina de cacahuete para cuantificar los residuos de galactosa que se vuelven accesibles cuando la NA elimina el ácido siálico de las placas de 96 pocillos recubiertas de fetuina.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Se describe un método para medir la activación de funciones efectoras Fc-mediada por anticuerpos dirigidos la hemaglutinina del virus de la gripe. Este análisis también pueden ser adaptado para evaluar la capacidad de inducir Inmunidad mediada por Fc de anticuerpos monoclonales o sueros policlonales dirigidos a otras glicoproteínas virales de superficie.

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

Aquí se informa un protocolo para la cuantificación de partículas virales infecciosas utilizando el monitoreo en tiempo real de la impedancia eléctrica de las células infectadas. Una aplicación práctica de este método se presenta mediante la cuantificación de la descomposición del virus de la influenza A bajo diferentes parámetros fisicoquímicos que imitan las condiciones ambientales.

Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real

Aprende a medir el apego y la internalización del virus de la influenza A en células epiteliales pulmonares A549 mediante citometría de flujo. Este método semicuantitativo utiliza unión en frío y cambio de temperatura para distinguir entre virus adheridos e internalizados.

Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo

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