Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo

El objetivo general de este procedimiento es medir la adhesión y la internalización de la influenza. Partículas de un virus en 5 49 células epiteliales pulmonares. Esto se logra mediante la unión en frío de un virus a 5 49 células, lo que permite la adhesión pero evita la absorción de partículas virales.

A continuación, se permite que el virus se interiorice cambiando la temperatura a 37 grados centígrados. A continuación, un paso de bloqueo en el que la tira Aden sin etiquetar se une a la superficie de la celda. Los virus adheridos se realizan con el fin de discriminar entre partículas virales adheridas e internalizadas.

Finalmente, el virus biotinilado asociado a la célula se incuba con estreptavidina marcada con CY tres y se utiliza citometría de flujo para detectar los virus teñidos. En última instancia, se calcula la cantidad relativa de virus adheridos e internalizados. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la cantidad relativa de influenza, un virus que se adhiere e internaliza en una 5 0 9 células.

También se puede aplicar a otros sistemas que utilizan diferentes líneas celulares u otros virus Después de generar el virus biotinilado y determinar las cantidades requeridas del virus marcado strep din y SI tres estreptococos marcados din de acuerdo con el protocolo de texto, prepare cuatro tubos de pozos profundos que contengan cada uno 200, 000, A 5 49 células etiquetadas como cero minutos. Cero minutos, más STV, 30 minutos y 30 minutos más STV. A continuación, gira los tubos.

Retire el sobrenadante y use 200 microlitros de PBS para resuspender los pellets. Luego, después de volver a girar los tubos, use 200 microlitros de un medio de crecimiento estándar 5 49 para resuspender las células incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos después de la incubación, centrifugar las muestras y resuspender los gránulos en 200 microlitros de PBS Después de repetir el lavado una vez más, enfríe los tubos en hielo durante 10 minutos. Cuando los tubos se hayan enfriado, gire nuevamente y use 100 microlitros de virus biotinilado diluido en PBS de infección para volver a suspender los gránulos después de incubar en hielo durante una hora, repita el centrifugado y lave con PBS dos veces, procesando las siguientes muestras en paralelo tanto como sea posible para las muestras de minuto cero.

Después de centrifugar, use 100 microlitros de aldehído paraformado o PFA al 3,7% para resuspender la célula de pellet. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de centrifugar y usar PBS para lavar las células dos veces después de la fijación. Almacene a cuatro grados centígrados hasta que se hayan procesado todas las muestras.

Para tratar las muestras de STV de más de cero minutos, gire los tubos, retire el sobrenadante y use 15 microlitros de STV 2% BSA y 0.1% de sodio azi en PBS para resuspender la incubación de gránulos celulares en hielo durante 30 minutos. A continuación, centrifugar y utilizar PBS para lavar las células dos veces después de la fijación con PFA, como se acaba de demostrar, deje las muestras a cuatro grados centígrados para las muestras de 30 minutos. Después de girar y quitar el supernat, use PBS 2%BSA para disolver las muestras.

Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos antes de lavar con PBS y fijar con PFA. A continuación, almacene las muestras a cuatro grados centígrados durante los 30 minutos más las muestras STV. Después de la granulación, suspendemos las muestras en 200 microlitros de PBS 2%BSA, después de una incubación a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Girar y resuspender las células en 50 microlitros de STV 2%BSA 0.1%Azi de sodio en PBS incubar en ICE durante 30 minutos antes de lavar y fijar. Luego, después de permeable y teñir todas las muestras con STV SI tres, siguiendo los detalles del protocolo de texto, almacenó las muestras a cuatro grados centígrados. Por último, analizar las muestras mediante citometría de flujo.

Determine el porcentaje de CY tres células positivas en cada muestra. Calcule el porcentaje de virus adherido y la cantidad relativa de virus internalizado. De acuerdo con el protocolo de texto que se muestra aquí en la muestra de cero minutos, el virus se une en frío a las células objetivo, tal como se visualiza en St.V.SI tinción de tres.

Cuando se aplica el STV como paso de bloqueo, el virus en la superficie de la célula ya no puede ser detectado por S St.V.SI tres, lo que reduce fuertemente la señal. Cuando la temperatura se eleva a 37 grados centígrados, el virus adherido es absorbido por las células. El virus internalizado no es sensible al bloqueo con STV no marcado, lo que resulta en una caída menos drástica en la intensidad de la señal en las muestras de STV más de 30 minutos mostradas.

Estos son los porcentajes de células SI tres positivas para todas las condiciones experimentales descritas en este video. Las células infectadas simuladas dan la intensidad de la señal de fondo para el experimento y actúan como un control negativo para la adhesión del virus. Otro control de la neuraminidasa anula fuertemente la unión de IAV en un 90% en comparación con las células no tratadas.

El azi de sodio, que agota un TP, inhibiendo así la endocitosis, inhibió la internalización de las partículas del virus tanto durante como después de la infección, como se muestra aquí después de que las células de tratamiento con azi de sodio incubadas durante 30 minutos a 37 grados centígrados mostraron una caída dramática en la internalización en comparación con las células no tratadas incubadas en las mismas condiciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el apego y la internalización de la influenza, un virus en 5 0 9 células. Este protocolo permite una lectura conveniente por citometría de flujo y se puede adaptar fácilmente a otros entornos experimentales.