Membrana de transporte de procesos analizados por un sistema de nanoporos viruta altamente paralela a la Resolución de la proteína individual

El objetivo general de esta plataforma basada en chips de nanoestructura es analizar la función de las proteínas de membrana a nivel molecular único de una manera muy paralela. A través de su capacidad para resolver proteínas individuales, se logran nuevos conocimientos sobre el transporte y el flujo de membrana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las proteínas de membrana, como la conductividad o el comportamiento de transporte de canales individuales o transportadores, especialmente con carga no electrogénica.

La principal ventaja de esta técnica es su alto paralelismo derivado del diseño de chips de nanoestructuras, con cientos de miles de nanoporos y la lectura fluorescente de los eventos de transporte. Las implicaciones de esta técnica se extienden a lo que está creando los mejores ensayos de bibliotecas efectivas para proteínas de membrana. Porque la plataforma basada en chip permite un registro de transporte altamente paralelo y automático.

Por lo general, las personas nuevas en este método aprenderán rápidamente cómo manejar la técnica presentada. El objetivo siempre fue crear un ensayo fácil de usar para que todos los interesados pudieran adoptarlo. Este ensayo de transporte de membrana utiliza un silicio en una oblea aislada, diseñada mediante grabado de iones de reacción.

A partir de cada oblea se fabrican alrededor de 1.000 chips de ensayo. Cada chip contiene 250.000 microcavidades. Estas cavidades se sellan mediante bicapas lipídicas que contienen las proteínas transportadoras de interés.

La membrana constituye la interfaz del sensor. Inicialmente, los materiales fluorescentes están contenidos en un lado de la bicapa lipídica, correspondiente al interior de los liposomas de los que están compuestos. Cada cavidad se puede direccionar a través de una lectura de fluorescencia multiespectral.

Una capa superior opaca bloquea las señales fluorescentes del depósito tampón, lo que hace que el biochip sea compatible con los microscopios de fluorescencia invertida. Utilizando microscopía de fuerza atómica, las aberturas de los poros dispuestas uniformemente y la rugosidad de la superficie de la capa de dióxido de silicio se midieron a 3,6 nanómetros, lo que es óptimo para la fusión de vesículas. La microscopía electrónica de barrido muestra una sección transversal a través de un nanoporo, que accede a las cavidades de femtolímetro dentro del chip de silicio.

Este video muestra la preparación de los proteolisomas, la preparación de los chips para el ensayo y la ejecución básica del ensayo. Conecte un matraz de fondo redondo lavado con etanol a un evaporador rotativo. Seque la película lipídica durante 40 minutos a 300 milibares, a 30 grados centígrados de temperatura del baño de agua y a la velocidad máxima de rotación para formar una película lipídica homogénea en la pared de vidrio del matraz.

A continuación, con una bomba de alto vacío, seque la película lipídica durante 30 minutos más a temperatura ambiente. A continuación, agregue cinco mililitros de tampón y ocho perlas de vidrio lavadas con etanol al matraz para hacer las vesículas multilaminares. Conecte el matraz al evaporador rotativo y gírelo sin vacío a 50 grados centígrados a máxima velocidad.

Después de 45 minutos, la solución aparecerá lechosa, sin película lipídica residual en las paredes. Transfiera el matraz bajo un gas inerte a un baño ultrasónico y soniquelo durante cuatro minutos a temperatura ambiente. La sonicación altera los liposomas haciéndolos unilaminares.

Ahora, divida la solución LUV en alícuotas de un mililitro y realice cinco ciclos de congelación y descongelación con nitrógeno líquido y un baño de agua a 40 grados centígrados. Esto conduce a la ruptura, reordenamiento y crecimiento de los liposomas. En el último paso de congelación, almacene todas las muestras a menos 80 grados centígrados.

Antes de reconstituir una alícuota LUV, extruya los liposomas pasando la alícuota a través de una membrana de filtro de policarbonato de 400 nanómetros 17 veces, utilizando un miniextrusor. Luego, desestabilice los LUV agregando 4%Triton X-100 para 0.25%en solución. Incuba la mezcla durante cinco minutos a 50 grados centígrados.

Ahora, mezcle una parte de MscL purificada y modificada en 20 partes de los liposomas saturados de detergente y continúe la incubación durante 30 minutos. Después de la incubación, tome una alícuota de 100 microlitros y agregue un volumen de calcina de 30 milimolares. Incuba esta mezcla durante cinco minutos a 50 grados centígrados.

Ahora, retire el detergente de la muestra tratada con calcinadora y sin tratar. Agregue bio-perlas húmedas en tampón Tris a cada uno e incube durante la noche a cuatro grados centígrados en un plato giratorio. Antes del experimento, pruebe una preparación mediante un ensayo de actividad.

Para comenzar, mezcle la base de elastómero en el agente de curado y seque completamente la mezcla para que quede horrorizada. El adhesivo debe usarse dentro de los 30 minutos cuando esté listo. Mientras tanto, tomando precauciones, limpie un portaobjetos de vidrio con cinco mililitros de cloroformo, aplicado con una jeringa de vidrio, y deje que el portaobjetos se seque.

Ahora, con una pipeta de 10 microlitros, deposite el adhesivo preparado sobre el cubreobjetos. Luego, retire con cuidado una viruta de la tabla de obleas con pinzas finas. Con el lado recubierto de la viruta hacia arriba, deposítelo sobre el adhesivo y frótelo suavemente en el portaobjetos para distribuir uniformemente el adhesivo.

No permita que las burbujas de aire queden atrapadas por debajo, ni que ningún adhesivo llegue por encima del chip. Además, haga el ensamblaje de manera que encaje en el soporte deslizante de ocho cámaras. Ahora desece los ensamblajes durante dos horas a 65 grados centígrados en una secadora de gabinete.

Más tarde, retire la capa protectora de las virutas con unos lavados con disolvente a 54 grados centígrados. Primero coloque las virutas montadas en un soporte deslizante. Luego, incubarlos en tres baños de solvente durante 10 minutos cada uno.

Isopropanol, acetona e isopropanol. A continuación, lave cuidadosa y minuciosamente las patatas fritas con agua ultrapura. Complete el proceso secando las virutas bajo un suave chorro de gas nitrógeno.

Ahora, prepara un portaobjetos pegajoso de ocho pocillos y colócalo al revés en el banco. Luego, levante y presione con cuidado los portaobjetos de la tapa sobre el portaobjetos pegajoso con las virutas hacia los pocillos. Deje reposar el montaje durante unos minutos antes de continuar.

Antes de continuar con el ensayo de translocación, lave a fondo el ensamblaje del chip, como se describe en el protocolo de texto, terminando con un baño tampón Tris. A continuación, cambie la solución de baño por el tampón DOPEd Tris, que contiene cinco milimolares de cloruro de calcio y un colorante micromolar Oy647. A continuación, agregue proteoliposomas a la cámara de chips para obtener una concentración final de un miligramo por mililitro y espere una hora.

Después de una hora, enjuague las papas fritas cuatro veces con 400 microlitros de tampón Tris sin calcio. Ahora, agregue el tinte controlado a cada pocillo hasta cinco micromolares y proceda con el ensayo. A continuación, monte el soporte del chip en el microscopio de epifluorescencia y concéntrese en el borde del chip de nanoporos para encontrar las microcavidades.

Una vez que las microcavidades estén enfocadas, escanee la matriz de nanoporos en busca de una región que muestre la relación de techo más alta. Los detalles se proporcionan en el protocolo de texto. Los liposomas se prepararon y se comprobó su distribución de tamaño y dispersión.

Los liposomas preparados eran más grandes que el diámetro de poro para el ensayo, lo cual es esencial. Los liposomas monodispersos también son deseables. Antes del experimento, se comprobó la proteína MscL modificada en la preparación del liposoma mediante un ensayo de extinción de fluorescencia.

La proporción de liposomas que albergan MscL modificada activa fue adecuada para proceder con el experimento de translocación. En el biochip, se observó la translocación de soluto de un objetivo fluorescente a través del canal MscL modificado. El modulador químico, MTSET, se utilizó para abrir los canales de MscL diseñados mediante repulsión electrostática.

Se monitorizó la posterior disminución de la fluorescencia en el interior del espacio de la cavidad. Este proceso demostró ser altamente reproducible, con eventos de eflujo muy consistentes. Las curvas de flujo resultantes se agrupan en dos poblaciones distintas, correspondientes a eventos de translocación de un solo canal o de varios canales.

El sistema fue capaz de hacer un seguimiento de hasta tres tintes fluorescentes únicos con análisis en tiempo real. Esto facilita la discriminación precisa de resultados positivos, eventos de eflujo monoexponencial, cinética compleja, intrusiones lipídicas y rupturas de membranas. Una vez dominada, esta técnica se puede ejecutar en pasos consecutivos, a saber, preparación de chips, preparación de muestras, imágenes y análisis, lo que hace que todo el protocolo sea modular.