Membrana de transporte de procesos analizados por un sistema de nanoporos viruta altamente paralela a la Resolución de la proteína individual

El objetivo general de esta plataforma basada en un chip de nanoestructuras es analizar la función de proteínas de membrana a nivel molecular individual de manera altamente paralela. Gracias a su capacidad para resolver proteínas individuales, se obtienen nuevos conocimientos sobre el transporte y el flujo a través de membranas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las proteínas de membrana, como la conductividad o el comportamiento de transporte de canales o transportadores individuales, especialmente aquellos con cargas no electrogenicas.

La principal ventaja de esta técnica es su alto grado de paralelismo derivado del diseño del chip con nanoestructuras, que presenta cientos de miles de nanoporos y la lectura fluorescente de los eventos de transporte. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la creación de los mejores ensayos para bibliotecas eficaces de proteínas de membrana. Debido a que la plataforma basada en chips permite un registro altamente paralelo y automático del transporte.

Por lo general, las personas nuevas en este método aprenderán rápidamente cómo manejar la técnica presentada. El objetivo siempre fue crear un ensayo fácil de usar para que cualquier persona interesada pueda adoptarlo. Este ensayo de transporte de membrana utiliza una oblea de silicio sobre aislante, diseñada mediante grabado iónico reactivo.

Aproximadamente 1.000 chips de ensayo se fabrican a partir de cada oblea. Cada chip contiene 250.000 microcavidades. Estas cavidades quedan selladas por bicapas lipídicas que contienen las proteínas de transporte de interés.

La membrana constituye la interfaz del sensor. Inicialmente, los materiales fluorescentes se encuentran confinados a un lado de la bicapa lipídica, correspondiente al interior de los liposomas de los cuales están compuestos. Cada cavidad es localizable mediante una lectura de fluorescencia multiespectral.

Una capa superior opaca bloquea las señales fluorescentes del depósito de tampón, lo que hace que el biochip sea compatible con microscopios de fluorescencia invertidos. Mediante microscopía de fuerza atómica, se midieron las aberturas de los poros uniformemente dispuestas y la rugosidad superficial de la capa de dióxido de silicio en 3,6 nanómetros, un valor óptimo para la fusión de vesículas. La microscopía electrónica de barrido muestra una sección transversal a través de un nanoporo, que accede a las cavidades de femtolitros dentro del chip de silicio.

Este video muestra la preparación de los proteoliposomas, la preparación de las placas para el ensayo y la ejecución básica del ensayo. Conecte un matraz de fondo redondo lavado con etanol a un evaporador rotatorio. Seque la película lipídica durante 40 minutos a 300 milibares, temperatura del baño de agua de 30 grados Celsius y velocidad máxima de rotación para formar una película lipídica homogénea en la pared de vidrio del matraz.

Luego, utilizando una bomba de alto vacío, seque la película lipídica durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. A continuación, agregue cinco mililitros de tampón y ocho perlas de vidrio lavadas con etanol al matraz para formar vesículas multilamelares. Conecte el matraz al evaporador rotatorio y gire sin vacío a 50 grados Celsius a velocidad máxima.

Después de 45 minutos, la solución parecerá lechosa, sin película lipídica residual en las paredes. Transfiera el matraz bajo una atmósfera de gas inerte a un baño ultrasónico y sométalo a sonicación durante cuatro minutos a temperatura ambiente. La sonicación interrumpe los liposomas, convirtiéndolos en unilamelares.

Ahora, divida la solución de LUV en alícuotas de un mililitro y realice cinco ciclos de congelación y descongelación utilizando nitrógeno líquido y un baño de agua a 40 grados Celsius. Esto provoca la ruptura, reorganización y crecimiento de los liposomas. En el último paso de congelación, almacene todas las muestras a menos 80 grados Celsius.

Antes de reconstituir una alícuota de LUV, extruya los liposomas pasando la alícuota a través de una membrana de filtro de policarbonato de 400 nanómetros 17 veces, utilizando un mini-extrusor. Luego, desestabilice los LUV añadiendo 4% Triton X-100 hasta alcanzar una concentración de 0,25% en solución. Incube la mezcla durante cinco minutos a 50 grados Celsius.

Ahora, mezcle una parte de MscL purificada y modificada en 20 partes de liposomas saturados con detergente, y continúe la incubación durante 30 minutos. Después de la incubación, tome una alícuota de 100 microlitros y agregue un volumen de 30 milimolar de calcine. Incube esta mezcla durante cinco minutos a 50 grados Celsius.

Ahora, elimine el detergente de las muestras tratadas y no tratadas con calcina. Añada bioesferas húmedas en tampón Tris a cada una e incube durante la noche a cuatro grados centígrados en una placa rotatoria. Antes del experimento, pruebe una preparación utilizando un ensayo de actividad.

Para comenzar, mezcle la base de elastómero con el agente de curado y deseca completamente la mezcla para que quede seca. El adhesivo debe usarse dentro de los 30 minutos posteriores a su preparación. Mientras tanto, tomando precauciones, limpie un portaobjetos con cinco mililitros de cloroformo, aplicados mediante una jeringa de vidrio, y deje secar el portaobjetos.

Ahora, utilizando una pipeta de 10 microlitros, coloque el adhesivo preparado sobre el cubreobjetos. Luego, retire cuidadosamente un chip de la placa de oblea usando pinzas finas. Con el lado recubierto del chip hacia arriba, colóquelo sobre el adhesivo y frótelo suavemente sobre el portaobjetos para distribuir uniformemente el adhesivo.

No permita que queden burbujas de aire atrapadas debajo, ni que el adhesivo suba hacia arriba y llegue al chip. Además, realice el ensamblaje de manera que encaje en el portaobjetos con ocho cámaras. Ahora seque los ensamblajes durante dos horas a 65 grados Celsius en un horno de secado.

Posteriormente, elimine la capa protectora de los chips con varios lavados con disolvente a 54 grados Celsius. Primero, coloque los chips montados en un portador de portaobjetos. Luego, incúbelos en tres baños de disolvente durante 10 minutos cada uno.

Isopropanol, acetona e isopropanol. A continuación, lave cuidadosa y completamente las obleas con agua ultrapura. Finalice el proceso secando las obleas bajo una corriente suave de gas nitrógeno.

Ahora, prepare un portaobjetos adhesivo de ocho pocillos y colóquelo al revés sobre la bancada. Luego, levante con cuidado y presione los cubreobjetos sobre el portaobjetos adhesivo, con los chips orientados hacia los pocillos. Deje reposar el ensamblaje durante unos minutos antes de continuar.

Antes de continuar con el ensayo de translocación, lave minuciosamente el ensamblaje del chip, como se describe en el protocolo escrito, finalizando con un baño de tampón Tris. A continuación, sustituya la solución del baño por tampón Tris DOPEado, que contenga cloruro de calcio cinco milimolar y el colorante Oy647 uno micromolar. Luego, añada proteoliposomas a la cámara del chip para obtener una concentración final de un miligramo por mililitro, y espere una hora.

Después de una hora, enjuague las obleas cuatro veces con 400 microlitros de tampón Tris sin calcio. A continuación, añada el colorante controlado a cada pocillo hasta alcanzar cinco micromoles, y continúe con el ensayo. A continuación, coloque el portador de obleas en el microscopio de epifluorescencia y enfoque el borde de la oblea de nanoporos para localizar las microcavidades.

Una vez que las microcavidades estén enfocadas, examine la matriz de nanoporos en busca de una región que muestre la relación de techo más alta. Se proporcionan detalles en el protocolo escrito. Se prepararon liposomas y se verificó su distribución de tamaño y dispersión.

Los liposomas preparados eran más grandes que el diámetro de los poros para el ensayo, lo cual es esencial. También es deseable que los liposomas sean monodispersos. Antes del experimento, se verificó la proteína MscL modificada en la preparación de los liposomas mediante un ensayo de desencadenamiento de fluorescencia.

La proporción de liposomas que albergaban MscL modificado activo fue adecuada para proceder con el experimento de translocación. En el biochip, se observó la translocación de un sustrato fluorescente a través del canal MscL modificado. El modulador químico MTSET se utilizó para abrir los canales MscL modificados mediante repulsión electrostática.

Se monitoreó la subsiguiente disminución de la fluorescencia dentro del espacio de la cavidad. Este proceso resultó ser altamente reproducible, con eventos de ef flujo muy consistentes. Las curvas de ef flujo resultantes se agruparon en dos poblaciones distintas, correspondientes a eventos de translocación por un solo canal o por múltiples canales.

El sistema fue capaz de rastrear hasta tres colorantes con fluorescencia única mediante análisis en tiempo real. Esto facilita la discriminación precisa de resultados positivos, eventos de eflujo monoexponenciales, cinéticas complejas, intrusiones lipídicas y rupturas de la membrana. Una vez dominada, esta técnica puede ejecutarse en pasos consecutivos, a saber: preparación del chip, preparación de la muestra, adquisición de imágenes y análisis, lo que hace que todo el protocolo sea modular.