Name: Protocolo Aislamiento eficiente para B y linfocitos T a partir Humanos Palatine amígdalas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a aislar linfocitos B y T viables de amígdalas palatinas humanas mediante este protocolo rápido. Este método facilita estudios sobre patogénesis viral y respuesta inmunitaria en tonsilitis.

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Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Sueca del Cáncer (11 0253, 13 0469), el Consejo Sueco de Investigación (K2012-99X-21959-01-3), la Fundación Marcus Borgströms y el Consejo Sueco de Investigación a través de una subvención al Centro de Investigación de ARN de Uppsala (2006-5038-36531-16). Estamos en deuda con las instalaciones centrales de BioVis en la Universidad de Uppsala por su gran ayuda con el análisis FACS.

El protocolo describe el aislamiento de células linfoides de material de paciente humano y por lo tanto requiere una aprobación ética. El trabajo realizado en el presente estudio fue concedida por el Comité de Revisión Ética de Uppsala (. Dnr 2013/387). 1. Aislamiento de células mononucleares (CMN) desde Humanos Palatine amígdalas PRECAUCIÓN: Todo el material no apantallado de origen humano como la sangre, tejidos o fluidos corporales debe considerarse como material potencialmente infectado. Por lo tanto, se deben seguir las prácticas de bioseguridad recomendadas para el manejo de los tejidos humanos. Nota: Para evitar la contaminación, todas las soluciones y equipos de cultivo de células deben ser estériles. Todos los tampones y soluciones deben ser pre-enfriados y se mantuvieron en hielo. Tejidos de amígdalas y células aisladas se deben mantener y manipulados en hielo. <ol><li> Obtener amígdalas frescos de los pacientes sometidos a amigdalectomía o amigdalotomía (Figura 2). Sumérgete la Clum tejidops en un tubo de centrífuga de 50 ml lleno de solución salina enfriada con hielo estéril Hanks equilibrada (HBSS) suplementado con suero bovino fetal 5% (FBS), mM glutamina 10, 0,05 mg / ml de gentamicina y 1% mezcla de antibiótico-antimicótico (penicilina, La estreptomicina y anfotericina B). </li><li> Mantenga los tubos con las muestras de tejido de las amígdalas sumergidas en todo momento en el hielo. Trate de procesar las amígdalas tan pronto como sea posible, y no más tarde de 3 horas después de la extirpación quirúrgica. </li><li> Coloque la amígdala en una placa de cultivo celular de plástico de 60 mm en el hielo y mantener el tejido humedecido con HBSS. Retire los coágulos sanguíneos visibles, grasa y tejido conectivo con un limpio fórceps de la superficie de las amígdalas. </li><li> Utilice una nueva placa de cultivo celular de 60 mm que contiene 5 ml de HBSS. Cortar el grupo tejido de las amígdalas en fragmentos 3-10 mm utilizando un par de tijeras estériles y / o un escalpelo. </li><li> Prepare una nueva placa de cultivo celular de 60 mm que contiene 10 ml de HBSS y colocar un filtro de células de plástico de 100 micras en la solución de HBSS. </li><li> Transfiera los dissfragmentos de amígdalas ejadas en el filtro de células con unas pinzas esterilizadas. Usando el extremo del émbolo de una jeringa de plástico, sin problemas exprimir los fragmentos de tejido a través del filtro de células. Asegúrese de que los fragmentos de amígdalas están totalmente inmersos en la HBSS. </li><li> Desechar el filtro de células con los restos de tejido y transferir la suspensión de células resultante de la placa de cultivo celular 60 mm en un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml. Deje el tubo en hielo mientras se procede con los pasos 1,8 y 1,9. </li><li> En el caso de grandes amígdalas, de más de 2 cm de tamaño (Figura 2), apretar los fragmentos de la amígdala en dos coladores celulares para evitar la obstrucción de la malla en el colador. </li><li> Obtener el volumen final de 35 ml de la suspensión celular. Nota: En este paso es posible preparar la suspensión de células para la crioconservación (ver sección 2). </li><li> Añadir 10 ml de solución de gradiente de densidad de Ficoll como en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Superponer suavemente los suspens celularesion (paso 1.9) en la parte superior de la solución de gradiente de densidad. Evitar la mezcla de la suspensión de células y la solución por gradiente de densidad. Nota: La solución de gradiente de densidad tiene que ser calentado a la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar la suspensión de células en un rotor oscilante a cabo a 700 xg durante 20 min a TA. No active la función de freno de la centrífuga como el frenado rápido puede perturbar el gradiente. Asimismo, el uso de la función de aceleración más bajo disponible en la centrífuga. Nota: Después de este paso de centrifugación, observe MNCs como una capa esponjoso blanco en la interfase, y los glóbulos rojos (GR), los fibroblastos y los restos celulares como el sedimento en el fondo del tubo. </li><li> Recoger cuidadosamente la capa multinacionales utilizando una pipeta de 10 ml. Coloque la suspensión de células en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Añadir 25 ml de helado de PBS a la suspensión celular y hacer girar el tubo a 300 xg durante 5 min en un rotor basculante a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante usando una pipeta de 25 mly repetir sedimento celular lavado paso dos veces más. Finalmente resuspender el botón celular en 15 ml de PBS. Nota: Después de la etapa de lavado final, es posible criopreservar la suspensión de células (véase la sección 2). </li><li> Aplicar 10 l de suspensión celular en la celda hemocitómetro cámara de recuento y contar el número de células bajo un microscopio. Dispensar la cantidad apropiada de células (por ejemplo, 2-3 de 7 x 10) en un tubo de centrífuga de 15 ml para la posterior separación de perlas magnéticas. Mantenga esta alícuota en hielo hasta el paso 3.2. </li></ol> 2. La criopreservación de células amigdalares <ol><li> Preparar medio de congelación (90% de SFB y 10% DMSO) y mantenerlo en hielo. Para el almacenamiento a largo plazo mantener a los medios de congelación a -20 ° C. </li><li> Determinar el número total de células utilizando una cámara de recuento celular hemocitómetro (paso 1,15). Calcular la cantidad necesaria de medio de congelación de acuerdo con la densidad celular congelado deseado (por ejemplo, 10 7 célulass / ml de medio de congelación). </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min. Decantar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y resuspender el sedimento celular en medio de congelación enfriado con hielo (del paso 2.1). </li><li> Dispensar alícuotas de 1 ml de la suspensión celular en viales estériles diseñados para almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido. Congele los viales en una cámara de isopropanol y almacenar a -80 ° CO / N. Para la conservación a largo plazo la transferencia de los viales en un nitrógeno líquido que contiene el tanque de almacenamiento o una C congelador celular -140 °. </li><li> Para descongelar viales con células congeladas, calentarlas rápidamente en un 37 ° C baño de agua. Inmediatamente cuando se descongela, dispersar la suspensión celular en 10 ml de HBSS precalentado (con suplementos, paso 1,1) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Girar el tubo a 300 xg durante 5 min, eliminar HBSS y resuspender el sedimento celular en la densidad celular deseada en HBSS (con suplementos, paso 1.1). Nota: La viabilidad del af multinacionalesdescongelación ter es de importancia, ya que la presencia de células muertas disminuirá el rendimiento final de B y los linfocitos T purificados. Nota: De acuerdo a nuestra experiencia, la viabilidad celular a menos de 80% reducirá la eficiencia de aislamiento de células. </li></ol> 3. Selección positiva de linfocitos T Población de amigdalares multinacionales Nota 1: Este protocolo se basa en la selección positiva de linfocitos humanos T CD3 + de MNCs amígdalas usando perlas magnéticas acopladas al anticuerpo CD3. Es posible iniciar esta sección de frescos (Sección 1) o los (Sección 2) las multinacionales congelados. Nota 2: Comience con 3 x 10 7 multinacionales. No exceda este número de células, ya que las columnas de separación pueden obstruir y esto reducirá la eficiencia de aislamiento. Utilice columnas más grandes si se manejarán más células. Los volúmenes utilizados en este protocolo han sido experimentalmente optimizado para el número de células con nosotrosed en nuestra configuración experimental. <ol><li> Preparar el tampón de separación [PBS (pH 7,2), 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y EDTA 2 mM]. Filtrar el tampón de separación a través de un filtro de 0,45 micras y almacenar a 4 ° C. </li><li> Haga girar la suspensión multinacionales (paso 1,14) a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el sedimento resultante de células en 240 l (80 l por cada 10 7 células) de tampón de separación enfriado con hielo. Transferir la suspensión celular en un tubo de 2 ml estéril. </li><li> Añadir 20 l de anticuerpo CD3 magnético a la solución de células. Incubar los tubos durante 1 hora a 4 ° C con mezclado suave continua para mantener las células en suspensión. </li><li> Transferir todo de la suspensión celular en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de tampón de separación enfriado con hielo para lavar las células. </li><li> Centrifugar el tubo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C en un rotor basculante. </li><li> Mientras tanto configurar el separador y la columna magnética. Coloque el separador magnético para el soporte y colocar la columna en la SEPARator. Lavar la columna mediante la aplicación de 500 l de tampón de separación enfriado con hielo. Deseche el flujo a través. </li><li> Coloque un nuevo tubo de extracción de 15 ml por debajo de la columna. Mantenga el tubo de recogida en el hielo. </li><li> Descartar el sobrenadante (paso 3.5) mediante la pipeta y resuspender suavemente el sedimento celular en tampón de separación l 500. Aplicar la suspensión de células en la parte superior de la columna de pre-lavado y se deja correr a través. Nota: grupos de células pueden obstruir la columna y por lo tanto reducir la tasa de flujo. Para evitar este problema, coloque un filtro de células de plástico 40 micras en la parte superior de la columna. Pasando a través de las células esta malla será altamente mejorar la eficiencia de este método. </li><li> Lavar la columna 4 veces con 1,5 ml de tampón de separación (500 l para 10 7 células). Esperar a que el depósito de la columna a estar vacía (sin líquido debe ser observado en la columna) antes de aplicar la siguiente etapa de lavado. Nota: Obtener las células no marcadas CD3, considerados como fracción de linfocitos B, ya que soneluyó en el tubo de recogida. </li><li> Retire la columna del separador y el lugar en un nuevo tubo de extracción de 15 ml. Pipetear 2 ml de tampón de separación en la columna. Utilizando el émbolo suministrado con la columna eluir los linfocitos T seleccionados positivamente, que se consideran como la fracción de linfocitos T. </li><li> Determinar el número de células purificadas (paso 1,15) si es necesario. Las suspensiones celulares están ahora listos para experimentos posteriores. </li></ol> 4. Análisis de citometría de flujo aislada amigdalar linfocitos B y T PRECAUCIÓN: solución de paraformaldehído es irritante y carcinógeno. Use ropa protectora adecuada, guantes y protección para los ojos / la cara. Nota 1: Este protocolo describe el método para la tinción directa de las células T y B aislado por fluorescencia análisis de clasificación de células activadas (FACS). El propósito principal de este paso es evaluar la pureza de la célula aislada poblaciones after CD3 anticuerpo separación magnética. Para este propósito B establecido y marcadores de células T, los anticuerpos monoclonales CD20 conjugado con fluoróforo-FITC y CD2-APC, se utilizan. También la inclusión de anticuerpos de control de isotipo es muy recomendable para distinguir el &quot;fondo&quot; la unión no específica de los anticuerpos CD2 y CD20 (véase el paso 4.8). Nota 2: Es posible para mantener las fracciones de células purificadas en una solución de paraformaldehído al 1% (PFA) en la oscuridad a 4 ° C hasta el momento de tinción (por ejemplo, día siguiente,.). También el mismo procedimiento es aplicable si hay un intervalo de tiempo entre la tinción y análisis FACS. Recuerde que en ambos casos las células deben lavarse adecuadamente con PBSA (PBS que contenía 0,2% de BSA) tampón, antes de la tinción o análisis FACS. <ol><li> Saque 6 x 10 6 células de las multinacionales del paso 1,15 (antes de aplicar a la columna), fracción de linfocitos B desde el paso 3.9 y fracción de linfocitos T a partir del paso 3.10. </li><li> Haga girar la célulasuspensiones a 300 xg durante 5 min a 4 ° C utilizando un rotor basculante. </li><li> Eliminar el sobrenadante con pipeta y se lava el sedimento celular una vez con 1 ml de helado PBSA. Haga girar las suspensiones de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante con pipeta y resuspender el células en 600 l de tampón PBSA helada. </li><li> Añadir 100 l de la suspensión celular a la parte inferior de un tubo de FACS. </li><li> Añadir 100 l de PBS que contiene 10% inactivado por calor suero humano a cada tubo, mezclar bien e incubar durante ~ 1 min a RT o 20 min en hielo. Nota: los linfocitos B llevan receptores Fc. Con el fin de bloquear la Fc de receptores de células purificadas las fracciones se incuban con 10% inactivado por calor suero humano. El suero humano es inactivado por calor mediante incubación a 56 ° C durante 1 hr. Divida el suero inactivado por calor en pequeñas alícuotas y almacenar congelados a -20 ° C. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C en un swing de salida del rotor. </li><li> Eliminar el sobrenadante con pipeta y se lava el sedimento celular con 1 ml PBSA. Repetir la centrifugación (300 xg durante 5 min a 4 ° C). </li><li> Añadir 100 l PBSA en cada tubo en hielo. Añadir la cantidad apropiada de anticuerpo monoclonal conjugado con fluoróforo, de acuerdo con la recomendación del fabricante (por ejemplo, 20 l de anti-CD20 y / o 5 l de anticuerpos anti-CD2 en 100 l de PBSA). Nota: No se olvide de asignar tubos de control suficientes para el análisis FACS. En este protocolo los siguientes controles deben incluir: 1) células teñidas con los anticuerpos anti-CD2 y anti-CD20 de forma individual, 2) células teñidas con los anticuerpos anti-CD2 y anti-CD20 de control de isotipo de forma individual y, 3) células sin adición de anticuerpos. </li><li> Brevemente vórtice del tubo y se incuba durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar 2 veces con PBSA. Añadir 2 ml de solución de PFA al 1% a las muestras. Deje que las células permanecen en la solución de PFA al 476; C en la oscuridad hasta el momento del análisis FACS. </li><li> Inmediatamente antes de ejecutar las muestras en la máquina de FACS, se lavan las células 2 veces con PBSA (300 xg durante 5 min a 4 ° C). Resuspender las muestras en 1 ml de PBS y mantienen a 4 ° C (o en hielo), protegido de la luz, antes de la separación en el citómetro de flujo. </li><li> Hacer la clasificación FACS siguiendo el protocolo del citómetro de flujo fabricante. </li></ol> 5. La detección por PCR de ADN Adenovirus en aislada amigdalar linfocitos B y T Nota 1: Los hexón de adenovirus cebadores de genes son AdRJC1 (5&#39;-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 &#39;) y AdRJC2 (5&#39;-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3&#39;) 11. Estos cebadores generan un amplicón de 139 pb. El gen 18S rRNA anfitrión puede ser detectada con los cebadores tp206 (5&#39;-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 &#39;) y tp207 (5&#39;-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3&#39;). El tamaño de amplificación esperado es 300 pb. Nota 2: Cada PCRplazo incluye un control negativo (destilada H 2 O) y un control positivo de ADN obtenido a partir de la línea de células B humanas (BJAB) infectados con adenovirus humano tipo 5 12. <ol><li> Extraer ADN (de al menos 1 x 10 6 células, paso 3.11), utilizando el método de purificación de columna basada membrana de sílice. Extracto de ARN usando fenol y solución de isotiocianato de guanidina 13. </li><li> Añadir 100 ng de ADN de linfocitos B y T a una mezcla de reacción que contenía tampón 1x HF, 0,2 mM de mezcla de desoxinucleótido trifosfato (dNTP), 0,25 M de cada cebador y 1 U de alta fidelidad de ADN polimerasa en un volumen total de 20 l. </li><li> Realizar la amplificación por PCR bajo las siguientes condiciones de ciclo: 30 seg de desnaturalización a 98 ° C, seguido por 30 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 67 ° C (hexon) o 58 ° C (18S rRNA) durante 30 seg y 72 ° C durante 30 s. La reacción de PCR se terminó con una etapa de extensión final de 7 min a 72 ° C. </li><li> Separar el amplif PCR resultanteicación productos en un gel de agarosa al 1,5% en 1x tampón TBE y visualizar las bandas esperadas por tinción con colorante de ácidos nucleicos. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Uno de los factores más importantes que afectan a los resultados de este protocolo es el uso de material amigdalar fresco como el material de partida. Por lo tanto, las muestras de amígdalas deben procesarse dentro de 3 horas después de la cirugía. Las amígdalas pueden ser obtenidas de adultos y niños. El material amigdalar de los hijos es generalmente más pequeño debido a la extirpación quirúrgica parcial de las amígdalas (amigdalotomía). Por lo tanto, el número de MNCs obtiene a partir de muestras de amigdalotomía (1 ...

Las amígdalas son colecciones de tejidos linfoides incompletamente encapsulados que se encuentran debajo y en contacto con el epitelio en el tracto aerodigestivo superior. Por lo general, el término "amígdalas" se refiere a las amígdalas palatinas situadas en las paredes laterales de la parte oral de la faringe. Las amígdalas palatinas pareadas junto con la amígdala nasofaríngea (adenoides), las amígdalas tubáricas pareadas y las amígdalas linguales constituyen el llamado "anillo de Waldeyer". Este último es responsable del contacto inicial entre los patógenos inhalados o ingeridos y los tejidos linfoides del tracto aerodigestivo1,2. De hecho, numerosos informes han demostrado que tanto los antígenos bacterianos como los virales pueden detectarse en muestras de tejido de amígdalas palatinas2-6.
Las amígdalas palatinas están compuestas por un denso tejido linfoide cubierto por un epitelio escamoso estratificado que no queratiniza. Las amígdalas tienen numerosas criptas, invaginaciones epiteliales, que penetran en el parénquima aumentando la superficie. Desde el punto de vista histológico, las amígdalas palatinas contienen numerosos folículos linfoides con centros germinales, que son los sitios de maduración y diferenciación de las células B (áreas de células B). Asimismo, las amígdalas palatinas engloban a las células T, que se localizan principalmente en las regiones extrafoliculares (áreas de células T). Además de las células B y T, también se pueden detectar varias células dendríticas foliculares en las amígdalas palatinas1,2. 
Debido a su ubicación anatómica, las amígdalas palatinas son fácilmente accesibles mediante intervenciones quirúrgicas. Por ejemplo, la extirpación quirúrgica de las amígdalas, conocida como amigdalectomía, se lleva a cabo de forma rutinaria en todo el mundo7. En los niños con hiperplasia amigdalar, a veces se utiliza una extirpación quirúrgica parcial de las amígdalas (amigdalomamía), lo que causa menos dolor postoperatorio a los pacientes. Teniendo en cuenta la acumulación de diversos patógenos en las amígdalas, las amígdalas extirpadas quirúrgicamente brindan una oportunidad única para estudiar la influencia de los agentes virales y bacterianos en las funciones de los linfocitos amigdalinos2,8. Además, es posible estudiar si algunos patógenos prefieren residir en subpoblaciones celulares específicas9. Además, dado que las amígdalas son una fuente rica en linfocitos B, los linfocitos B amigdalinos aislados pueden utilizarse eficazmente para estudiar la actividad de diferentes subpoblaciones de células B10. Sin embargo, como las amígdalas palatinas contienen una mezcla de tipos de células, se necesita un método eficiente para separar las diferentes subpoblaciones celulares. 
Aquí, describimos un método simple para el aislamiento eficiente y rápido de poblaciones de células amigdalares B y T de amígdalas palatinas humanas mediante el uso de una técnica de separación de células activadas magnéticamente (Figura 1). El método descrito aquí es útil para los científicos que desean evaluar el papel de diferentes agentes infecciosos en los órganos linfoides humanos, como las amígdalas palatinas.

<table><tbody><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>Contiene 5% de suero fetal bovino (FBS), 10 mM de glutamina,&nbsp; &nbsp; 0,05 mg/ml Gentamicina y 1% Mezcla de antibióticos y antimicóticos</td></tr><tr><td>Medio de congelación</td><td></td><td></td><td>90% FBS y 10% DMSO</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> MACS <td>PBS (pH 7,2), 0,5% BSA y 2mM EDTA</td></tr><tr><td>PBSA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS que contiene 0,2% BSA</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td>PBS que contiene 1% de paraformaldehído (PFA). Hacer fresco. Se sospecha que el PFA es cancerígeno. Use guantes y gafas.</td></tr><tr><td>Mezcla antibiótica-antimicótica</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petridish</td><td>Nunc</td><td>150326</td><td></td></tr><tr><td>Disección de preceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381241</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris rectas&nbsp;</td><td></td> Bisturíes desechables <td>Fisher Scientific</td> 12912055 <td></td></tr><tr><td></td><td>Swann-Morton</td><td>REF 0501</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtro de celdas de plástico</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m coladores de celdas de plástico&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de plástico de 2 ml</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>300185</tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml</td><td>SARSTEDT 62554502</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de baja velocidad con rotor de ángulo fijo o de cubeta oscilante</td><td>Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&ndash; Hypaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415-50ML</td><td>Ficoll solución</td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros</td><td>Industrias biológicas</td><td>040071A</td><td></td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo (DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MACS MS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS humano CD3 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-881</td><td></td></tr><tr><td>Separador MACS (Octo MACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1120180100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AnalaR NORMAPUR</td><td>20302.293</td><td></td></tr><tr><td>CD2 conjugado con aloficocianina ( CD2-APC)&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td></td><td></td>560642</tr><tr><td>CD20 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (CD20-FITC)&nbsp;</td><td>BD Biociencias&nbsp;</td><td></td><td></td>556632</tr><tr><td>Suero humano&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D119-0100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>BD Falcon</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>SARSTEDT</td><td>72379</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRII caudalímetro</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 4.1 software</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sangre de nucleospina&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740951.50</td><td>kit de aislamiento de ADN</td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15596</td><td>Reactivo de aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 0610030</td><td></td><td>dispositivo de contador de células</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Tinción de gel de ácido nucleico&nbsp;</td></tr></tbody></table>

protocolo aislamiento eficiente para b y linfocitos t a partir humanos palatine amígdalas

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Las amígdalas forman parte del sistema inmunológico proporcionando la primera línea de defensa contra los patógenos inhalados. Por lo general, el término "amígdalas" se refiere a las amígdalas palatinas situadas en las paredes laterales de la parte oral de la faringe. Las amígdalas palatinas extirpadas quirúrgicamente proporcionan una fuente conveniente y accesible de linfocitos B y T para estudiar la interacción entre patógenos extraños y el sistema inmunitario del huésped. Este protocolo de video describe la disección y el procesamiento de las amígdalas palatinas humanas extirpadas quirúrgicamente, seguidas del aislamiento de las poblaciones individuales de células B y T de la misma muestra de tejido. Presentamos un método que separa eficientemente los linfocitos amigdalinos B y T utilizando un protocolo de afinidad dependiente de anticuerpos. Además, utilizamos el método para demostrar que el adenovirus humano infecta específicamente la fracción de células T amigdalinas. El protocolo establecido es generalmente aplicable para aislar de manera eficiente y rápida las poblaciones de células B y T de las amígdalas para estudiar el papel de diferentes tipos de patógenos en las respuestas inmunitarias amigdalinas.

Una separación eficiente de las multinacionales tonsilares resultados en subpoblaciones altamente purificadas de los linfocitos B y T. Esto fue confirmado por análisis de FACS usando anticuerpos anti-CD2 anti-CD20 y para detectar linfocitos B y T poblaciones, respectivamente (Figura 3A). Por el contrario, una separación ineficiente de MNCs resultados en las fracciones celulares que son una mezcla de células de ambas subpoblaciones de linfocitos B y T (Figura 3B). <p...

Las amígdalas palatinas son una rica fuente de linfocitos B y T. Aquí proporcionamos un protocolo fácil, eficaz y rápido para aislar linfocitos B y T de amígdalas palatinas humanas. El método descrito ha sido adaptado específicamente para los estudios de la etiología viral de la inflamación de las amígdalas conocida como amigdalitis.

Protocolo Aislamiento eficiente para B y linfocitos T a partir Humanos Palatine amígdalas

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener fracciones de linfocitos BNT a partir de muestras humanas de tejido amigdalino. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología, como cuáles son los roles de las fracciones de linfocitos BT en la patogénesis de las enfermedades virales. Dentro de las tres horas posteriores a su extracción quirúrgica, transporte el tejido amigdalar al laboratorio en un tubo cónico de 50 mililitros lleno con HBSS estéril, frío con hielo, que contenga suplementos.Luego, utilizando los procedimientos de bioseguridad adecuados recomendados para el manejo de tejido humano. Humedezca el tejido con HBSS fresco que contenga suplementos y transfiera las amígdalas a una placa de cultivo celular plástica de 60 milímetros sobre hielo. Con pinzas, retire cualquier coágulo sanguíneo visible, así como tejidos adiposos y conectivos, y luego transfiera las amígdalas a una nueva placa de 60 milímetros que contenga cinco mililitros de HBSS con suplementos.A continuación, corte el agregado de tejido amigdalino en fragmentos de tres a diez milímetros y transfiéralos a un filtro celular de plástico de 100 micrómetros colocado en una nueva placa de cultivo celular de 60 milímetros que contenga 10 mililitros de HBSS fresco con suplementos, utilizando suavemente el extremo del émbolo de una jeringa de plástico. Presione los fragmentos de tejido a través del filtro celular, asegurándose de que los fragmentos amigdalinos permanezcan completamente sumergidos en el HBSS. Una vez que todo el tejido haya sido macerado, deseche el filtro y transfiera la suspensión celular resultante a un tubo cónico de centrífuga de plástico de 50 mililitros sobre hielo.Lleve la solución celular a un volumen final de 35 mililitros con HBSS fresco que contenga suplementos, y luego agregue 10 mililitros de solución de gradiente de densidad a temperatura ambiente en varios tubos cónicos de 50 mililitros. Superponga suavemente las suspensiones celulares sobre los gradientes de densidad, teniendo cuidado de no mezclar las soluciones, y luego separe las células mediante centrifugación. Las células mononucleares se separarán formando una capa blanca esponjosa en la interfase, mientras que los glóbulos rojos, los fibroblastos y los restos celulares quedarán en el sedimento en el fondo del tubo.Utilizando una pipeta de 10 mililitros, recolecte cuidadosamente la capa de células mononucleares y transfiera las células mononucleares a un nuevo tubo de 50 mililitros. Luego, lave las células tres veces con 25 mililitros de PBS frío con hielo en cada lavado y re suspenda el pellet final en 15 mililitros de PBS. Después de contar el número de células viables, coloque las células en hielo para aislar las células T tonsilares mediante separación con microesferas magnéticas.Centrifugar la suspensión de células mononucleares y resuspender el sedimento en 80 microlitros de tampón de separación frío por hielo por cada 1 × 10⁷ células. A continuación, transferir la suspensión celular a un tubo estéril de dos mililitros e incubar con 20 microlitros de anticuerpo magnético CD3 durante una hora a cuatro grados Celsius con agitación suave continua para mantener las células en suspensión. Al final de la incubación, transferir las células a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de tampón de separación frío por hielo y lavarlas durante el lavado. Colocar el separador magnético en el soporte y colocar una columna sobre el imán.Lave la columna con 500 microlitros de tampón de separación frío con hielo y luego coloque un filtro de 40 micrómetros encima de la columna. Ahora, re suspenda el botón celular en 500 microlitros de tampón de separación fresco y cargue las células a través del filtro sobre la columna, recolectando el EIT que contiene linfocitos B en un tubo cónico de 15 mililitros. Coloque en hielo cuando todas las células hayan pasado al tubo de recolección.Lave la columna cuatro veces con 500 microlitros de tampón de separación por cada uno por diez a la siete células, esperando a que el depósito de la columna quede vacío antes de aplicar el siguiente lavado. Después del último lavado, transfiera la columna a un nuevo tubo colector de 15 mililitros. A continuación, utilice el émbolo de la columna para presionar dos mililitros de tampón de separación a través de la columna hacia el tubo, con el fin de recoger la fracción de linfocitos T CD3 positivos.Para analizar las fracciones celulares de linfocitos B y T aisladas, centrifugar las fracciones celulares positivas para CD3 y negativas para CD3 y lavar ambos conjuntos de células con un mililitro de PBS suplementado con 0,2 % de BSA o PBSA tras la segunda centrifugación. Distribuir alícuotas de 100 microlitros de las células y PBSA en el número adecuado de tubos para marcado por citometría de flujo, y añadir la cantidad apropiada de anticuerpo monoclonal o de control conjugado con Fluoro 4 a cada tubo. A continuación, vortexar brevemente los tubos e incubarlos durante 30 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Al final de la incubación.Lave los tubos dos veces con PBSA fresco y luego fije la tinción celular con paraformaldehído al 1 % para detectar la presencia de ADN de adenovirus en las células mediante PCR. Realice la amplificación por PCR bajo las condiciones de ciclado adecuadas, separando los productos resultantes de la amplificación por PCR en un gel de agarosa al 1,5 % y tampón EDTA. Finalmente, visualice las bandas resultantes con el colorante adecuado para ácidos nucleicos.Seg&uacute;n protocolos est&aacute;ndar, una separaci&oacute;n exitosa de las c&eacute;lulas mononucleares tonsilares da como resultado subpoblaciones altamente purificadas de linfocitos BNT, tal como se confirma mediante an&aacute;lisis citom&eacute;trico de flujo utilizando anticuerpos anti-CD20 y anti-CD2 para detectar las poblaciones de linfocitos B y T, respectivamente. En contraste, una separaci&oacute;n ineficiente de las c&eacute;lulas mononucleares produce fracciones celulares que son una mezcla de c&eacute;lulas de ambos linfocitos B y T. Las subpoblaciones, as&iacute; como el ADN y el ARN, pueden extraerse de los linfocitos B y T separados mediante perlas magn&eacute;ticas para su an&aacute;lisis posterior, tal como se acaba de demostrar.Por ejemplo, aquí se muestra la detección específica de ADN de adenovirus en linfocitos T TONSOR mediante PCR, con calidad citoplasmática. El ARN también puede extraerse de linfocitos B NT de TONSOR aislados. Una vez que se obtienen dos muestras de amígdala, pueden procesarse dentro de seis horas si la técnica se realiza adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante procesar las muestras de amígdalas lo más rápido posible. El número de pasos de lavado y el volumen del tampón de lavado también son parámetros críticos para obtener un buen resultado. Tras seguir este procedimiento, se podrían realizar otros métodos como QPCR y R-T-Q-P-C-R para responder preguntas adicionales sobre la presencia cuantitativa de ADN viral y ARNm tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la virología exploraran la patogénesis y la latencia de diferentes especies virales en los tejidos linfoides humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar fracciones de linfocitos BT a partir de muestras humanas de amígdalas. No olvide que trabajar con materiales humanos no tamizados, como la sangre y los tejidos, podría ser extremadamente peligroso.Por lo tanto, se deben seguir prácticas adecuadas de seguridad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aislamiento de linfocitos utilizando el kit de Miltenyi MAC es una manera confiable para purificar las células de todo homogeneizados de tejido linfoide. Células purificadas utilizando el sistema de Miltenyi suelen ser ≥ 96% de pureza. Este sentido, demuestran las medidas adoptadas para aislar las células CD4 + T, uno de los kits que se ofrecen por Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

En este reporte se describe un protocolo para el aislamiento de las poblaciones altamente purificadas de leucocitos que se infiltran en los tumores. Este protocolo es una adaptación del protocolo de Miltenyi Biotech para mejorar el rendimiento y la pureza para el aislamiento de las células del tejido tumoral compleja.

El aislamiento de las células inmunes de tumores primarios

En este video, demostramos el aislamiento de células B de sangre periférica humana utilizando anticuerpos biotinilados específicos para células no B y microperlas magnéticas conjugadas con estreptavidina.

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Con funciones efectoras diferenciadas de otros subconjuntos de células T, las células Th17 se han implicado en el centro de la autoinmunidad inflamatoria. Este protocolo de diferenciación in vitro de Th17 en proporciona un medio para determinar si ingenuas linfocitos T CD4 + pueden diferenciarse en células Th17, y para examinar aún más su papel en la autoinmunidad y la respuesta del huésped.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Este protocolo detalla un método para aislar células presentadoras de antígeno de timo humano a través de diferentes etapas de la digestión enzimática del tejido seguido por centrifugación de densidad de la suspensión de células individuales y la clasificación finalmente magnético y / o FACS de las poblaciones de células de interés.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

Aquí, proporcionamos un protocolo optimizado para el aislamiento y clonación de la escasa entidad de células T periféricas Vδ1+CD4+ que es, como demostramos recientemente, un progenitor de células T αβ extratímicas. Esta técnica permite aislar, clonar y expandir eficientemente estas células en cultivo ex vivo.

Aislamiento y<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

La sangre periférica humana se utiliza habitualmente para la evaluación de la respuesta inmunitaria humoral. En este trabajo, se describen los métodos para aislar las células B humanas de la sangre periférica, diferenciar las células B humanas en células B secretoras de anticuerpos (Ab) en cultivo y enumerar el total de IgM- e IgG-ASC mediante un ensayo ELISpot.

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

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Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

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En este estudio, presentamos un novedoso y eficaz protocolo para el aislamiento de los linfocitos de las placas de Peyer (PP), que pueden utilizarse posteriormente para ensayos funcionales en vivo y en vitro como en estudios de citometría de flujo folicular t helper y células del centro germinal B.

Desentrañando los jugadores claves de inmunidad Humoral: avanzada y Protocolo de aislamiento de linfocitos de parches Murine placas de Peyer

En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amídricas de seres humanos sanos sometidos a amigdalectomía quirúrgica parcial para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa.

Aislamiento de células mononucleares tonitarias para estudiar las respuestas inmunitarias innatas ex vivo en un tejido linfático mucoso humano

Aprende a aislar linfocitos B y T viables de amígdalas palatinas humanas mediante este protocolo rápido. Este método facilita estudios sobre patogénesis viral y respuesta inmunitaria en tonsilitis.

Protocolo Aislamiento eficiente para B y linfocitos T a partir Humanos Palatine amígdalas

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