Protocolo Aislamiento eficiente para B y linfocitos T a partir Humanos Palatine amígdalas

El objetivo general de este procedimiento es obtener fracciones de linfocitos BNT a partir de muestras de amígdalas humanas. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la virología, como cuáles son las funciones de las fracciones de linfocitos BT en la patogénesis de las enfermedades virales dentro de las tres horas posteriores a su extirpación quirúrgica. Transporta el tejido de las amígdalas al laboratorio en un tubo centrífugo de 50 mililitros lleno de suplementos estériles y helados que contienen HBSS.

A continuación, utilizar los procedimientos de bioseguridad adecuados recomendados para la manipulación de tejidos humanos. Humedece el tejido con un suplemento fresco que contenga HBSS y transfiere las amígdalas a una placa de cultivo celular de plástico de 60 milímetros sobre hielo. Con fórceps, extraiga cualquier coágulo de sangre visible o tejidos grasos y conectivos, y luego transfiera las amígdalas a una nueva placa de 60 milímetros que contiene cinco mililitros de HBSS con suplementos.

A continuación, corta. El tejido de las amígdalas se agrupa en fragmentos de tres a 10 milímetros, seguidos de la transferencia de los fragmentos a un colador de células de plástico de 100 micrómetros en una nueva placa de cultivo celular de 60 milímetros que contiene 10 mililitros de HBSS fresco con suplementos utilizando el extremo del émbolo de una jeringa de plástico sin problemas. Exprima los fragmentos de tejido a través del filtro de células, asegurándose de que los fragmentos de amígdalas permanezcan totalmente sumergidos en el HBSS cuando todo el tejido se haya macerado, deseche el filtro y transfiera la suspensión celular resultante a un tubo de centrífuga de plástico de 50 mililitros sobre hielo.

Lleve la solución celular a un volumen final de 35 mililitros con suplementos frescos que contengan HBSS, y luego agregue 10 mililitros de solución de gradiente de densidad a temperatura ambiente en unos tubos cónicos de 50 mililitros. Superponga suavemente las suspensiones celulares sobre los gradientes de densidad, teniendo cuidado de no mezclar las soluciones y luego separe las células por centrifugación. Las células mononucleares se separarán en una capa blanca esponjosa en la interfaz con los glóbulos rojos, los fibroblastos y los restos celulares ubicados en el sedimento en el fondo del tubo.

Con una pipeta de 10 mililitros, recoja cuidadosamente la capa de células mononucleares y extraiga las células mononucleares en un nuevo tubo de 50 mililitros. A continuación, lavar las células tres veces en 25 mililitros de PBS helado por cada lavado y volver a suspender el pellet final en 15 mililitros de PBS. Después de contar el número de células viables, coloque las células en hielo para aislar las células T tonsoras mediante la separación magnética de perlas.

Gire la suspensión de la celda mononuclear y vuelva a suspender el pellet en 80 microlitros de tampón de separación helado por uno por 10 a las siete celdas. Luego transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de dos mililitros e incube en 20 microlitros de anticuerpo magnético CD tres durante una hora a cuatro grados centígrados con una mezcla suave continua para mantener las células y la suspensión al final de la incubación, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de tampón de separación helado y lávelas durante el lavado. Coloque el separador magnético en el soporte y cargue una columna en el imán.

Lave la columna con 500 microlitros de tampón de separación helado y luego coloque un colador de 40 micrómetros encima de la columna. Ahora vuelva a suspender el pellet de celda en 500 microlitros de tampón de separación fresco y cargue las celdas a través del filtro en la columna que recoge la celda B que contiene EIT en una cónica de 15 mililitros. Dos bon ice cuando todas las células han pasado al tubo de recolección.

Lave la columna cuatro veces con 500 microlitros de tampón de separación por uno multiplicado por 10 hasta las siete celdas, esperando a que el depósito de la columna esté vacío antes de aplicar el siguiente lavado. Después del último lavado, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 15 mililitros. Luego, usando el émbolo de columna para presionar dos mililitros de tampón de separación a través de la columna hacia el tubo para recolectar la fracción de células T CD tres positivas.

Para analizar las fracciones de células B y t aisladas, granule las tres fracciones celulares positivas y CD tres negativas y lave ambos conjuntos de células en un mililitro de PBS suplementado con 0.2% BSA o PBSA después del segundo centrifugado. Distribuya 100 alícuotas de microlitros de las células y PBSA en el número apropiado de tubos para el etiquetado por fax, y agregue la cantidad adecuada de anticuerpo monoclonal o de control conjugado con fluoro cuatro a cada tubo. A continuación, agite brevemente los tubos e incubelos durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad al final de la incubación.

Lave los tubos dos veces con PBSA fresco y luego fije la tinción celular con aldehído paraformado al 1% para detectar la presencia de ADN de adenovirus en las células mediante PCR. Realice la amplificación por PCR en las condiciones de ciclo adecuadas, separando los productos de amplificación por PCR resultantes en un gel AGROS al 1,5% y un tampón de EDTA interestatal. Por último, visualice las bandas resultantes con la tinción de ácido nucleico adecuada.

De acuerdo con los protocolos estándar, una separación exitosa de las células mononucleares tonsor da como resultado subpoblaciones altamente purificadas de linfocitos BNT, como lo confirma el análisis de citometría de flujo utilizando anticuerpos anti CD 20 y anti CD dos para detectar las poblaciones de linfocitos b y t respectivamente. Por el contrario, una separación ineficiente de las células mononucleares da como resultado fracciones celulares que son una mezcla de células de los linfocitos b y t. Las subpoblaciones, el ADN y el ARN se pueden extraer de los linfocitos b y t separados por perlas magnéticas para su análisis posterior, como se acaba de demostrar.

Por ejemplo, aquí, la detección específica de ADN de adenovirus en linfocitos TONSOR T detectados por PCR se muestra citoplasmática de calidad. El ARN también se puede extraer de linfocitos NT aislados de tonsor B. Una vez que se obtienen muestras de dos amígdalas, se pueden procesar en seis horas si la técnica se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante procesar las muestras de amígdalas lo más rápido posible. El número de pasos de lavado y el volumen del tampón de lavado también son parámetros críticos para un buen resultado. Siguiendo este procedimiento, se podrían realizar otros métodos como QPCR y R-T-Q-P-C-R para responder preguntas adicionales sobre la presencia cuantitativa de ADN viral y ARNm después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la virología exploraran la patogénesis y la latencia de diferentes especies virales en los tejidos linfoides humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar fracciones de linfocitos BT de muestras de amígdalas humanas. No olvide que trabajar con materiales no examinados de origen humano, como sangre y tejidos, puede ser extremadamente peligroso.

Por lo tanto, se deben seguir las prácticas de seguridad adecuadas.