Síntesis de nanofibras a base de Queratina de Ingeniería Biomédica

El objetivo general de este experimento es sintetizar y caracterizar nanofibras a base de queratina para aplicaciones biomédicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería biomédica, como la cicatrización de heridas, la administración de fármacos y el tejido modificado, como el hígado, el hueso y el músculo. La principal ventaja de esta técnica es que es barata, eficiente y se puede actualizar a la producción a gran escala.

Las implicaciones de esta técnica se extienden al tratamiento de heridas y a la administración de fármacos para la regeneración de tejidos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la ventaja de utilizar nanofibras electrohiladas, también se puede aplicar a otros sistemas, como la regeneración de tejidos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es difícil hacer una sustancia polimérica que pueda generar nanofibras.

Procure aproximadamente 20 gramos de recortes de cabello humano que no hayan sido tratados ni alterados químicamente. El cabello puede ser de cualquier longitud. Lave el cabello a fondo a mano con agua tibia y jabón.

Use agua desionizada para el enjuague final. Coloque el cabello en dos vasos de precipitados de 600 mililitros y colóquelos en un horno a 80 grados centígrados durante una hora. Una vez seco, divida el cabello seco en partes iguales entre los vasos de 600 mililitros, colocando 10 gramos de cabello en cada vaso de precipitados.

No permita que el cabello llene más de 500 mililitros. A continuación, vierta 500 mililitros de solución de ácido peracético, o PAS, en cada vaso de precipitados, asegurándose de cubrir todo el cabello. Cubra los vasos de precipitados con Parafilm y guarde durante 12 horas.

Separe el cabello del PAS con un tamiz de 500 micras, recogiendo los residuos de PAS en un contenedor separado. Enjuague bien el cabello con agua desionizada para eliminar los restos de PAS. Después de colocar el cabello enjuagado en un matraz de 500 mililitros, vierta 400 mililitros de solución Tris Base de 100 milimolares, o TBS, en el matraz, asegurándose de que el cabello esté cubierto.

Luego, coloque el matraz en un baño de agitación a 38 grados Celsius, 65 RPM, durante una hora. Después de una hora, retire el matraz del baño de agitación. Vierta el líquido, que es aproximadamente 400 mililitros de solución de extracción de queratina, o KES, en un vaso de precipitados de 1000 mililitros.

Vierta 400 mililitros de agua desionizada en el matraz que contiene el cabello, asegurándose de que el cabello esté cubierto antes de volver a colocar el matraz en el baño de agitación durante una hora. Retire el matraz del baño agitador y vierta los 400 mililitros restantes del KES en el vaso de precipitados de 1000 mililitros con el KES recogido anteriormente. El cabello ya no es necesario y se puede desechar en el contenedor de basura más cercano.

Después de neutralizar el KES recolectado como se describe en el protocolo de texto, vierta la solución en el matraz de fondo redondo de 500 mililitros hasta aproximadamente un cuarto de su capacidad. Haga funcionar el destilador de acuerdo con el protocolo del fabricante durante 1,25 horas, asegurándose de que el matraz esté bien conectado. Repita este proceso hasta que se haya destilado todo el KES.

Vierta la solución destilada de KES en partes iguales en 12 tubos cónicos separados de 14 mililitros. Centrifugar los tubos a 1.050 veces G durante 10 minutos. Vierta el KES centrifugado en un vaso de precipitados limpio, asegurándose de verter lejos de los residuos acumulados.

Repita hasta que todo el KES haya sido centrifugado. A continuación, corte la membrana de celulosa del tubo de diálisis a 24 pulgadas y sujete un extremo del tubo para mantenerlo cerrado. Abra el extremo no recortado de la membrana de celulosa del tubo de diálisis y vierta lentamente 60 mililitros de solución KES centrifugada en el tubo.

Use otro clip para cerrar este extremo del tubo. Coloque el tubo de diálisis en un cilindro de 2.000 mililitros de agua desionizada y déjelo reposar durante 24 horas, cambiando el agua desionizada en el cilindro cada tres o cuatro horas. Luego, vacíe la solución de KES dializada en frascos tapados, asegurándose de dejar espacio en la parte superior.

Coloque los frascos tapados en un congelador a menos 20 grados centígrados durante 24 horas. Después del período de congelación de 24 horas, retire las tapas de los frascos y colóquelos en las ampollas del liofilizador. Coloque los sellos en las ampollas y gire la perilla para crear una presión de vacío de 0,133 milibares.

Liofiliza las muestras durante aproximadamente 48 horas hasta que desaparezca toda la humedad. Prepare una solución de queratina PCL agregando una solución de queratina de 10 pesos en una solución de PCL de 10 pesos gota a gota para crear soluciones de 10 mililitros con proporciones de PCL a queratina de 90 a 10, 80 a 20, 70 a 30 y 60 a 40. Coloque aproximadamente ocho mililitros de la solución de PCL/queratina en vórtice en una jeringa desechable de 10 mililitros, provista de un tubo de plástico de 0,5 milímetros de diámetro.

Coloque la jeringa en una bomba de jeringa donde el caudal esté configurado para ser de 2,5 mililitros por hora. Aplique voltaje a la punta de la aguja conectada al tubo. Aplique un voltaje de 19 a 22 kilovoltios al tubo y gire el tambor colector a alrededor de 200 RPM.

Corta las fibras en muestras de 16 milímetros cuadrados. Utilice un pegamento biocompatible a base de silicona para fijar cada muestra y cubrir los deslizamientos de 12 milímetros de diámetro. Pegue un extremo de la muestra de fibra a la parte posterior del cubreobjetos y envuelva la muestra alrededor del cubreobjetos.

Luego, pega el extremo libre de la muestra a la parte posterior del cubreobjetos también, dejando la parte superior del engobe cubierta solo con la muestra de fibra. Coloque las muestras de fibra en una placa de 24 pocillos. Esterilizar las muestras sumergiéndolas en etanol al 80% durante una hora.

Enjuague el etanol de las muestras con agua desionizada. A continuación, pipetee 2 mililitros de medio basal sobre las muestras, asegurándose de cubrir toda la muestra durante cinco minutos. Utilice células de fibroblastos 3T3 para sembrar las muestras de fibra.

Suspender las células en DMEM, suplementadas con antibióticos y 10% de suero fetal bovino para que haya aproximadamente 62.000 células por centímetro cuadrado por mililitro de DMEM. Deje caer un mililitro de la celda 3T3 que contiene la solución DMEM en cada placa de pocillos, asegurándose de que cada muestra de fibra esté cubierta con aproximadamente 62.000 células por centímetro cuadrado. Incubar las placas de pocillos durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de cortar las membranas secas de PCL/nanofibra de queratina, esterilice las muestras de 900 milímetros cuadrados con alcohol al 80% durante un período de incubación de 10 minutos. Luego, lave bien las membranas con agua desionizada. A continuación, incubar las muestras en 15 mililitros de PBS, pH 7,5, a 37 grados centígrados, reemplazando el tampón cada tres días.

Saque las membranas de la solución a intervalos especificados de una semana y siete semanas. Enjuague con agua desionizada. Coloque las muestras de membrana en ampollas de liofilizador.

Coloque los sellos en las ampollas y cree un vacío para liofolizar las muestras durante 24 horas hasta que estén completamente secas. A continuación, fije la muestra seca a una platina de microscopio electrónico de barrido, o SEM, con cinta de cobre. Coloque la etapa dentro del recubridor de pulverización catódica y cúbrala con dorados a 15 miliamperios durante un minuto y 30 segundos.

Cargue la muestra en la cámara del SEM. Observe las muestras de fibra a un voltaje acelerado de 1,5 kilovoltios y cinco microamperios de corriente. Aquí se muestran imágenes representativas de nanofibras basadas en PCL/queratina electrohiladas con éxito a partir de soluciones con proporciones de PCL/kertain de 70 a 30, 80 a 20 y 90 a 10.

Se encontró que las fibras electrohiladas tenían módulos de Young cercanos a los del tejido nativo. Los módulos de Young disminuyeron con el aumento de la relación de queratina. La figura muestra una tendencia gráfica de variación del módulo de Young frente a la relación PCL/queratina.

Los espectros de espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier que se muestran aquí confirman la unión de PCL a la queratina. El pico principal, medido a 1.722 centímetros inversos, concuerda con las mediciones básicas estándar de la banda de absorción de PCL y es visible en todos los espectros. La adhesión celular y la proliferación de las fibras de queratina PCL confirman que las fibras no son tóxicas y proporcionan apoyo para el crecimiento celular.

El crecimiento de los filopodios a lo largo de las nanofibras indica una interacción favorable entre los fibroblastos y las fibras PCL/queratina. Una vez dominada, esta técnica de síntesis de nanofibras se puede realizar en 24 horas si se realiza correctamente. Al intentar el procedimiento de electrohilado, es importante recordar la viscosidad de la solución de polímero, el caudal de la solución, el voltaje aplicado, la velocidad del tambor giratorio y los pasos para el cultivo de células de fibroblastos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanofibras basadas en PCL / kertain y su importancia en el campo de la ingeniería biomédica. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la viabilidad celular y las pruebas de degradación in vivo, para responder preguntas adicionales sobre la respuesta de toxicidad al tejido, el crecimiento del tejido y la degradación de las fibras. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería regenerativa exploraran campos como la regeneración de la piel, la cicatrización de heridas y la administración de fármacos.

No olvide que trabajar con solventes orgánicos, como TFE, y altos voltajes puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas de seguridad, batas de laboratorio y guantes, y la eliminación adecuada de solventes mientras se realiza este procedimiento.