Name: Enriquecimiento de la membrana de Bruch de Ojos donante humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprende a enriquecer la membrana de Bruch de ojos humanos post mortem mediante disección de tejidos. Este método permite analizar proteínas y carbohidratos sin contaminación, facilitando el estudio de la degeneración macular asociada a la edad.

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Los autores desean reconocer el Dr. Isaac Zambrano y el personal en el Manchester Ojo Hospital de Banco de Ojos para el suministro de tejido ocular donante humano, y el Sr. Pete Walker, de la Facultad de Ciencias de la Vida Histología instalaciones para las imágenes de H &amp; E manchadas. Especial agradecimiento al Sr. Roger Meadows por su ayuda con la microscopía. SJC es un receptor de un Consejo de Investigación Médica (MRC) Carrera Desarrollo de la Confraternidad (MR / K024418 / 1) y los autores también reconocen otra financiación de la investigación reciente del MRC (G0900538 y K004441), Lucha for Sight (1866) y La Sociedad macular.

Tejido del ojo humano dado su consentimiento para fines de investigación se obtuvo de la Manchester Royal Hospital Oftalmológico Banco de Ojos después de la eliminación de la córnea para el trasplante. La utilización de tejidos humanos para la investigación estaba en conformidad con la Ley de Tejidos Humanos (2004) Directrices, y con la aprobación del Comité de Ética en Investigación de la Universidad (Referencia 11305). 1. Enriquecimiento de la membrana de Bruch entero <ol><li> Limpiar el espacio de trabajo alrededor y debajo del microscopio de disección con 1% desinfectante (v / v) y luego limpie con 70% (v / v) de etanol. </li><li> Asegúrese de lo siguiente están a mano: un nuevo bisturí desechable, dos raspadores estériles celulares (comúnmente utilizados en el cultivo de tejidos) y tres pares de pinzas (enumerados aquí como A, B, y C, consulte la lista de materiales). </li><li> Coloque el globo ocular en una placa petri desechable, reteniendo la tapa para su uso posterior. Usando una nueva bisturí desechable, eliminar cualquier nervio óptico residual, lo que puede interferir con la creación de un mo planaunt del tejido. A continuación, hacer cuatro incisiones igualmente espaciados para crear cuatro cuadrantes, en caso de proceder a la parte 3 (enriquecimiento de la membrana de Bruch macular) no corte a través de la región de la mácula. <ol><li> Asegúrese de que las incisiones se extienden a través de toda la profundidad del tejido ocular - a partir de la retina neurosensorial más interna (NSR), a través de la coroides y la esclerótica (blanco del ojo). Continuar la incisión todo el camino alrededor del ojo desde el margen de la ojera al nervio óptico. Esto permitirá que el ocular que se aplana (ver Figura 1B). </li></ol></li><li> La celebración de un cuadrante de ojera aplanada usando pinzas A (para evitar el desprendimiento coroideo), utilice el mayor pinza B para agarrar la NSR vítreo y subyacente y tire de este tejido lejos del epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de la periferia, se mueve hacia el centro de la ojera abierto y luego hacia el lado opuesto. Por lo general, pero no siempre tanto vítreo y despegar todo lo NSR una. Utilice la scalpel para extirpar cualquier NSR residual anclado en el disco óptico. </li><li> Una vez más, mientras que la celebración de un cuadrante de tejido en su lugar usando pinzas A, utilizar el raspador de células estéril para desalojar suavemente la monocapa RPE de toda la superficie interior de la copa ocular. Estas células se desprenden con facilidad y se puede ver grumos de color marrón-pigmentadas oscuras. Enjuague con PBS para lavar suavemente las células RPE distancia desalojados de la ojera. </li><li> A continuación, utilice las pinzas de A a pelar suavemente el tejido de color rojo oscuro que recubre (que comprende tanto la membrana de Bruch y la coroides) a partir de los 4 cuadrantes del ojo. Coloque el tejido extirpado en un plato limpio. </li><li> Con el borde aplanado de un solo rascador de células para mantener el tejido extirpado en su lugar, utilice el segundo raspador para raspar suavemente el tejido. Gire el tejido y repita, eliminando tanto el exceso de material posible. Eventualmente, una membrana traslúcida se mantendrán: esta es la membrana de Bruch crudamente enriquecido. El uso del microscopio de disección en un mínimo de magnificación 20X esesencial en la ayuda a la eliminación de la coroides y el enriquecimiento de la membrana de Bruch. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur, enjuagar brevemente la membrana de Bruch con agua ultrapura para eliminar coroides residual y la sangre antes de colocar la membrana en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Suspender la membrana de Bruch enriquecida en aproximadamente 1 ml de agua ultrapura y agitar brevemente (aproximadamente 15 segundos) para ayudar a lisar cualquier materia celular contaminante (ver Figura 2). Centrifugar la muestra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar la membrana y aspirar el sobrenadante. Nota: La membrana de Bruch enriquecido restante ya está listo para la solubilización (como se describe en la sección 2 abajo) o el almacenamiento a -80 ° C para su uso posterior. </li></ol> 2. La solubilización de Análisis de membrana y Western Blot de Whole Enriquecido Bruch <ol><li> Extracto de proteínas de la membrana de Bruch enriquecido por inmersión del tejido en 500 l 8 M urea durante 6 horas a temperatura ambiente en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (Figura 3A). </li><li> Centrifugar las muestras solubilizadas a 10.000 xg durante 10 min para sedimentar cualquier asunto extracelular restante. Eliminar el sobrenadante y transferirlo a 3500 Da MWCO membrana de diálisis, a continuación, colocar la muestra en 1 l de PBS para dializar durante 16 horas a 4 ° C. </li><li> Para cada muestra, añadir 40 l de perlas de aislamiento de proteínas, y rotar la muestra / mezcla de perlas (20 rpm en un mezclador rotatorio) a TA durante 30 min. </li><li> Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar las perlas. Eliminar el sobrenadante y solubilizar proteína unida a las perlas en 30 l 2x tampón de carga de muestra (Tris-HCl 65,8, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (w / v) de glicerol, 0,01% azul de bromofenol, 3% β-mercaptoetanol). </li><li> Incubar las muestras a 100 ° C durante 10 min, y luego centrifugar a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar las perlas restantes. </li><li> Cargue el sobrenadante que contiene las proteínas liberadas en un prefabricado SDS-gel de gradiente de la página (véase la lista de materiales) para la separación de proteínas. </li><li> Visualizar bandas de proteínas separadas mediante un protocolo de tinción común, por ejemplo, azul de Coomassie. <ol><li> En resumen, añadir 20 ml de la mancha azul brillante (0,1% azul brillante (w / v), 50% de metanol, ácido acético glacial 10%, 40% de agua) al gel, y se incuba durante 30 min a TA con agitación suave . </li><li> Deseche la solución de tinción y lavar el gel teñido con agua desionizada hasta que la tinción de fondo es suficientemente reducida para permitir la visualización banda de proteína de colores. </li><li> Alternativamente, la transferencia separa bandas de proteínas a nitrocelulosa para el análisis Western, como se describe a continuación. </li></ol></li><li> Transferencia separa bandas de proteínas a una membrana de nitrocelulosa a 80 mA durante 2,5 horas usando aparato de transferencia semiseco en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 10% [v / v] metanol). </li><li> Bloquear la membrana en 10 ml de PBS, 10% (w / v) de leche, y 0.02% (w / v) de BSA durante 16 horas a 4 ° C antes de THe adición de los anticuerpos primarios deseados para la detección de proteínas. Nota: Como un ejemplo aquí, la Figura 3C muestra un inmunoblot representativo de la membrana de Bruch solubilizado a partir de tres donantes distintos probaron para un regulador de la cascada del complemento, el factor de proteína-H como 1 (FHL-1). </li></ol> 3. Enriquecimiento de la membrana de Bruch Macular <ol><li> Siga los pasos 1,1 a 1,3 como se describió anteriormente. </li><li> Mientras que la NSR es todavía en su lugar, busque la coloración foveal amarillo que representa la región macular central (ver Figura 4). El uso de un 6 mm punzón de biopsia estéril, colóquela encima de la región foveal y firmemente cortar en la mácula. <ol><li> Mantener el punzón de biopsia en su lugar, hacer una incisión separada con un bisturí desde el borde de la copa ocular hasta el borde de la hoja punzón de biopsia, y luego usando pinzas B, pelar lejos el material que rodea los ojos para lograr una biopsia limpia. </li></ol></li><li> Usando pinzas C, retireel disco de 6 mm de tejido del punzón y el lugar en la tapa placa de Petri limpia. Coloque la tapa placa de Petri y el punzón macular bajo el microscopio de disección. </li><li> Extraiga el disco NSR delgada (marque para la tinción foveal amarilla para inferir la precisión de la biopsia). Use un raspador celular estéril para eliminar suavemente las células del EPR. </li><li> Asegure el disco macular a través de la esclerótica utilizando las puntas de las pinzas A, y lentamente retire la coroides y complejo de la membrana de Bruch usando pinzas C. Una vez más, utilice el rascador de células para eliminar coroides no deseado y la materia de sangre de la membrana de Bruch. </li><li> Coloque la membrana de Bruch macular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y suspender en 1 ml de agua ultrapura. Vortex brevemente (aproximadamente 15 segundos) para ayudar a lisar cualquier materia celular contaminante. Centrifugar la muestra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar la membrana y aspirar el sobrenadante. Nota: La membrana de Bruch enriquecida aislada de la mácula ahora se puede utilizar para una proteómicoálisis utilizando protocolos de digestión preferidas del usuario. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Aquí se describe el enriquecimiento de la membrana de Bruch para su posterior análisis permitiendo que los análisis posteriores, incluyendo el Western Blot 11, espectrometría de masas y las propiedades de difusión de la membrana de Bruch utilizando cámaras Ussing modificada 11,14. Los pasos críticos incluyen a) el raspado a fondo y el lavado de la superficie interna del ojo para eliminar todas las células del EPR b) el raspado repetido y cuidadoso de la coroides subyacente sin causar del Bruch a desintegrarse y c) lavado de la Bruch extirpado de en agua ultrapura para asegurar la lisis de las células residuales. Además, si la membrana de Bruch enriquecido se va a utilizar para el análisis proteómico, la extracción de proteínas por el tratamiento urea es el más eficaz en la descomposición de este tejido elástico en comparación con otros métodos tales como la homogeneización mecánica. Histología de la membrana de Bruch enriquecido indica el ECM del coriocapilar no se elimina. Esto es ser exesperadas como la capa exterior de la membrana de Bruch la pentilaminar está formado por coriocapilares membranas basales de células endoteliales. De hecho, puede ser ventajoso que el ECM del coriocapilar permanece cuando se producen cambios en este en AMD incluido el depósito de complemento terminal complejo complejo de ataque / membrana (MAC) 15. Cabe señalar que para el análisis histológico detallado de la membrana de Bruch, su estructura se conserva mejor si seccionada en presencia de la esclerótica, la coroides, y la membrana de Bruch. De hecho, la histología presentado en la Figura 2 está destinado exclusivamente para demostrar el grado de enriquecimiento resultante de la técnica descrita en este manuscrito. El enriquecimiento de macular Bruch de requiere una cuidadosa disección de la ojera, asegurando que la NSR y en particular la fóvea no están dañados; de otro modo la identificación y por lo tanto el aislamiento de la mácula no son posibles. La integridad de la tissuE también es importante en este proceso y por lo tanto se recomienda el uso de muestras en 48 horas el tiempo post-mortem. El grado de enriquecimiento requerido varía entre los donantes y puede verse afectada por la edad del donante, el tiempo post-mortem, y la presencia de cualquier patología ocular. El uso del término enriquecido es deliberada en el reconocimiento de una limitación de la técnica, esto siendo que &quot;purificación&quot; o &quot;aislamiento&quot; de la membrana de Bruch con este método, simplemente no es posible. De hecho, dado que el ECM del coriocapilar se funde en la membrana de Bruch hay separación completa no es factible. La comprensión de los cambios bioquímicos de los tejidos oculares respectivos es esencial para comprender la progresión de la enfermedad ocular. Este enriquecimiento única de la membrana de Bruch facilita esta comprensión; estudios en curso están investigando el proteoma de la mácula enriquecido la membrana de Bruch mediante espectrometría de masas en diferentes etapas de AMDy en muestras procedentes de sujetos con diferentes genotipos para mejorar la comprensión de la patología molecular de AMD. Ya la técnica descrita aquí se ha utilizado para identificar con éxito FHL-1 como regulador del complemento predominante en la membrana 11 y más estudios de Bruch en la membrana de Bruch enriquecido es probable que resulte en más nuevos conocimientos sobre la patología molecular de AMD.

El uso de post mortem del tejido del ojo humano en la investigación oftálmica es un recurso inestimable para la comprensión de la patogénesis de la enfermedad de los ojos. Análisis de los ojos de donantes humanos ha hecho importantes contribuciones a discernir los mecanismos que sustentan la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), que es la principal causa de ceguera en el mundo occidental 1. A nivel mundial, AMD representa aproximadamente el 8,7% de los casos de ceguera y con una población que envejece cada vez más, se prevé que afectará a 196 millones de personas por los resultados de 2020 2. AMD en la pérdida de la visión central y tiene un profundo impacto en la independencia y la calidad de vida del paciente 3. Temprano AMD se caracteriza por la formación de drusas y puede progresar a la atrofia geográfica (a veces conocido como AMD &quot;seca&quot;), o la neovascularización coroidea (también conocida como neovascular o &quot;húmeda&quot; AMD). Mientras anti-VEGF inyecciones pueden estabilizar o mejorar la visión en DMAE neovascular que iNo es curativa, y en la actualidad, no existe un tratamiento para la atrofia geográfica. Aunque se han mostrado ciertas variantes genéticas de modificar AMD riesgo 4-8, se sabe menos acerca de cómo estas variantes afectan a la mácula en un nivel bioquímico. Un sitio importante en la patogénesis de AMD es la membrana de Bruch. Forma drusas dentro de esta estructura y varios estudios han proporcionado pruebas de la activación del complemento en y alrededor de la membrana de Bruch en AMD 9. La membrana de Bruch es una lámina de matriz extracelular que separa las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) de la coroides, y es de aproximadamente 4 m de espesor. La membrana de Bruch se funde en los coriocapilar, una capa de la coroides que contiene capilares fenestrados y externa a esto son capas que contienen vasos sanguíneos más grandes 10 (Figura 1A). La membrana de Bruch es una hoja de pentilaminar adicionalmatriz celular (ECM), y esta metodología se detalla cómo aislar la membrana de Bruch, junto con el ECM de los coriocapilar subyacentes (en adelante enriquecido la membrana de Bruch), que es en gran parte descelularizado y libre de células rojas de la sangre. A continuación, la membrana de Bruch enriquecido se utilizó para la transferencia y la histología experimentos occidentales. Además, la metodología para enriquecer la membrana de Bruch únicamente a partir de la región mácula del ojo se describe, que será de particular interés para los que investigan los aspectos bioquímicos de la AMD.

<table><tbody><tr><td>Objetivo auxiliar 0.5X</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>3638</td><td>Útil (pero no esencial) para la obtención de imágenes de menor aumento de todo el ojo de montaje plano</td></tr><tr><td>Punzón de biopsia de 6 mm</td><td>Suministros médicos de guardia</td><td>SCH-33-36</td><td>6mm Punzones de biopsia</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma - Célula Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td> rascadores</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td>Para el enriquecimiento de membranas</td></tr><tr><td>CyroPure Cyrovials</td><td>Sarstedt</td><td>72.38</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>12387999</td><td>Bisturíes Swann-Morton estériles envueltos individualmente.</td></tr><tr><td>Focos LED de doble cuello de cisne en brazos de 30 cm</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>0153</td><td>Fuente de luz flexible esencial para la disección y la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8537</td><td>Se utiliza para prevenir la desecación de la mácula y durante el enriquecimiento de la membrana.</td></tr><tr><td>(A) Pinzas</td><td>Suministros de Laboratorio Científico</td><td>INS4280</td><td>(A) Finas (100 mm) y rectas</td></tr> <tr><td>(B) Pinzas</td><td>Suministros de Laboratorio Científico</td><td>INS4272</td><td>(B) Anchas y romas (150 mm). Útil para levantar grandes porciones de muestra</td></tr> <tr><td>(C) Pinzas</td><td>Suministros de laboratorio científico</td><td>INS4323</td><td>(C) Puntas finas rectas</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>GXCAM 5 cámara digital a color & Software GT-Vision</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>1122</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Sterilin</td><td></td><td>101VR20</td><td>90 mm, utilizada como placa para muestras</td></tr><tr><td>Perlas de aislamiento de proteínas (resina Strataclean)</td><td>Agilent</td><td>400714-61</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereozoom GXMXTL3T (rango de aumento 7X - 45X)</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>5595</td><td>Microscopio estereoscópico con zoom acoplado al soporte de brazo para facilitar su uso durante la disección</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

enriquecimiento de la membrana de bruch de ojos donante humano

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Degeneración macular (AMD) relacionada con la edad es la principal causa de discapacidad visual en el mundo desarrollado. La enfermedad se manifiesta por la destrucción del centro de la retina, llamada mácula, dando como resultado la pérdida de la visión central. Temprano AMD se caracteriza por la presencia de lesiones pequeñas, amarillentas llamados drusas blandas que pueden progresar hacia finales de AMD como atrofia geográfica (AMD seca) o neovascularización (DMAE húmeda). Aunque los cambios clínicos están bien descritos, y la comprensión de las influencias genéticas en conferir riesgo de AMD son cada vez más detallada, una zona que carece de un gran avance es la comprensión de las consecuencias bioquímicas de riesgo genético. Esto es debido en parte a las dificultades en la comprensión de la bioquímica de la membrana de Bruch, una matriz extracelular muy delgada que actúa como un filtro biológico de material desde el suministro de sangre y un andamio en el que reside el epitelio pigmentario de la retina (RPE) monocapa de células. Las drusas fORM dentro de la membrana de Bruch y su presencia altera el flujo de nutrientes a las células del EPR. Sólo mediante la investigación de la composición de proteínas de la membrana de Bruch, y de hecho cómo otras proteínas interactúan con él, pueden investigadores esperan para desentrañar los mecanismos bioquímicos que sustentan la formación de drusas, el desarrollo de la AMD y la pérdida de visión posterior. Este documento detalla metodologías para enriquecer ya sea membrana de Bruch entera, o simplemente de la región mácula, de modo que se puede utilizar para el análisis bioquímico aguas abajo, y proporcionan ejemplos de cómo esto ya está cambiando la comprensión de la bioquímica membrana de Bruch.

El protocolo descrito anteriormente para producir resultados enriquece la membrana de Bruch en el aislamiento de la membrana de Bruch, el ECM del coriocapilar y elimina la mayor parte de las células / residuos celulares, incluyendo la totalidad de la RPE (Figura 2). El lavado de membrana, el enriquecido de Bruch en el agua es un paso clave en la lisis de las células de la coroides restantes. La presión ejercida durante el desguace de la coroides aparece para compactar algunos de los pocos núcleos de las células restantes en la región definida como la membrana de Bruch (Figura 2B). La solubilización de la membrana de Bruch enriquecido permite el análisis aguas abajo de su contenido de proteínas. La separación de bandas de proteína solubilizada enriquecido de la membrana de Bruch usando un 4 - gel de gradiente de SDS-PAGE 12%, mientras que no es útil en su propio derecho para identificar el contenido de proteína, hace demostrar la capacidad de esta técnica para reducir al mínimo las proteínas sanguíneas contaminantes que la ARcorreo no específicamente unido (Figura 3B). En este sentido, una ausencia notable de la carrera de gel de proteína es una banda considerable de albúmina de suero humano (~ 66 kDa) que de otro modo pueden hacer posteriores Western Blot más difíciles de interpretar: el análisis histológico de membrana enriquecida de Bruch muestra en la Figura 2 también soporta esta. De hecho, como parte del trabajo se ha descrito previamente 11, la membrana de Bruch solubilizado a partir de una serie de donantes individuales se probaron para un número de proteínas usando anticuerpos específicos a través de Western Blot (Figura 3C). En el caso mostrado aquí, un anticuerpo (denominada OX23) 12 dirigido contra un kDa regulador de la inmunidad innata 155, llamada factor H del complemento (FH) se utilizó, y demostró la presencia de una banda de menor peso molecular en las muestras de la membrana de Bruch entre tres separada donantes (Figura 3C). Esto posteriormente resultó ser factor de la proteína-H como 1 (FHL-1), Una proteína de 49 kDa relacionada con FH y derivado de una variación de empalme del mismo gen 13. FHL-1 parece ser el principal regulador de complemento presente en la membrana de Bruch 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Figura 1. Disección del ojo humano y el enriquecimiento de la membrana de Bruch. (A) de la membrana de Bruch es una barrera matriz extracelular. La coroides contiene una capa de capilares fenestrados que se fusionan de forma continua en la membrana de Bruch (llamado el coriocapilar) y estos separar el resto de la coroides (que contiene vasos sanguíneos grandes) a partir del epitelio pigmentario de la retina (RPE) monocapa de células, que fisiológicamente compatible con las células fotorreceptoras de la retina neurosensorial (NSR). (B) Cuatro incisiones en el ocular humanos están hechos lo que le permite ser abierto para crear un montaje plana. losvítreo se puede quitar con el uso de pinzas. La NSR se podría salir junto con el humor vítreo, pero también puede ser eliminado con pinzas. Un rascador de células se utiliza para eliminar la capa de células RPE de la membrana de Bruch, mientras que todavía está anclada a la coroides y la esclerótica. Complejo de membrana / coroides del Bruch se puede despegar de la esclerótica y el uso de un nuevo raspador de células, la coroides exterior se puede quitar. Un lavado final en agua ultrapura lisa cualquier materia celular restante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Figura 2. Histología de la membrana de Bruch y las secciones coroideo. H &amp; E manchadas antes (A) y después (B) raspar las estructuras coroides exteriores de la membrana y el lavado de Bruch en wa ultrapurater para generar enriquece la membrana de Bruch. Las barras de escala representan 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Figura 3. La solubilización de la membrana de Bruch Enriched para el análisis de proteínas de contenido. (A) Protein puede ser extraído de la membrana de Bruch enriquecido mediante la incubación en urea 8 M durante 6 h a TA, antes de ser dializada contra PBS. Para el análisis Western, las proteínas de todo el dializado de la membrana de Bruch se pueden aislar usando perlas de aislamiento de proteínas y se eluyeron por ebullición con Laemmli tampón de muestra reductor de carga. Azul de Coomassie (B) Un representante gel teñido con SDS-PAGE, mostrando tanto ordenada y se diluyó solubilizaron la membrana de Bruch (BM) usando el método d. escribed en (A) (C) Un western blot representativo de la membrana de Bruch solubilizado a partir de 3 donantes individuales (carriles 1-3). sondeado para el factor de la proteína H como 1 (FHL-1) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Figura 4. Aislamiento de la membrana de Bruch Enriched de la mácula. La región mácula de la retina es un área de 5 mm que se puede identificar fácilmente por la coloración amarilla de la fóvea suprayacente, y su proximidad a la papila óptica adyacente. El uso de la fóvea como guía, coloque un punzón de biopsia de 6 mm en el ojo humano montada plana para extirpar un bloque de tejido mácula 6 mm. Retire la NSR suprayacente y raspar células del EPR de la mácula extirpado. Complejo de membrana / coroides del Bruch restante puede eln pelar lejos de la esclerótica y completamente raspado para eliminar coroides, permaneciendo lisis material celular por inmersión en agua ultrapura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La identificación de proteínas específicamente asociadas con la membrana de Bruch en ojos humanos es un paso importante en la comprensión de los mecanismos bioquímicos detrás de las enfermedades oculares, como la degeneración macular relacionada con la edad. Este protocolo describe cómo enriquecer esta lámina de matriz extracelular para el análisis bioquímico posterior.

Enriquecimiento de la membrana de Bruch de Ojos donante humano

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

El objetivo general de esta técnica de disección de tejidos es enriquecer la membrana de Brooks a partir de un ojo humano postmortem y proporcionar a los científicos el material específico necesario para analizar su contenido proteico y de carbohidratos. Este método puede ayudarnos a comprender mecanismos como la inmunorregulación en la membrana de Brooks que subyacen a una variedad de enfermedades oculares, incluyendo la forma más prevalente de ceguera en el mundo occidental, la degeneración macular relacionada con la edad. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis exclusivo de la membrana acelular de Brooks sin la contaminación de componentes sanguíneos o de células del epitelio pigmentario retiniano, que de otro modo podrían llevar a resultados aparentes.La demostración visual de este método es fundamental porque el manejo del tejido humano es difícil y el aislamiento de una membrana de Brooks rica es difícil de imaginar mentalmente únicamente a partir de una metodología escrita. Quien demostrará el procedimiento será la Dra. Selena Mcca, una posdoctoranda de nuestro laboratorio. Para comenzar, limpie el área de trabajo alrededor y debajo del microscopio con desinfectante y luego pase un paño humedecido con etanol al 70 %. A continuación, reúna las herramientas necesarias para el procedimiento; cuando esté listo, coloque el globo ocular en una placa de Petri desechable, conservando la tapa para uso posterior.Utilice un escalpelo desechable nuevo para eliminar cualquier nervio óptico residual que pueda interferir con la creación de una preparación en montaje plano del tejido. A continuación, realice cuatro incisiones espaciadas uniformemente para crear cuatro cuadrantes. Evite cortar a través de la región macular solo cuando se esté enriqueciendo la membrana de Brooks macular, penetrando a través de toda la profundidad del ojo.Continúe la incisión alrededor completo desde el margen de la copa ocular hasta el nervio óptico. Esto permitirá aplanar la copa ocular. A continuación, sostenga un cuadrante de la copa ocular aplanada con una pinza mientras utiliza un juego más grande para agarrar el vítreo y el tejido subyacente.Extraiga este tejido desde el epitelio pigmentario de la retina o EPR, comenzando en la periferia y avanzando hacia el centro hasta el lado opuesto. Si el vítreo y la retina neurosensorial no se desprenden como una sola unidad, utilice un escalpelo para extirpar cualquier tejido residual anclado en el disco óptico mientras sostiene un cuadrante del tejido en su lugar. Utilice un raspador estéril para células para desalojar suavemente la monocapa de EPR de toda la superficie interna de la copa ocular.Estas células se desprenden fácilmente y pueden observarse como agregados pigmentados de color pardo oscuro. Enjuague con PBS para lavar suavemente las células de epitelio pigmentario de la retina (RPE) desprendidas. A continuación, retire con cuidado el tejido rojo oscuro sobreyacente de los cuatro cuadrantes del ojo.Coloque el tejido extirpado en un recipiente limpio. Añada unas gotas de PBS y aplane el tejido usando una célula y pinzas si es necesario. Utilizando el borde aplanado de un raspador celular para sostener el tejido extirpado en su lugar, use el segundo raspador para raspar suavemente el tejido, déle la vuelta y repita el procedimiento, eliminando la mayor cantidad posible de material excedente.Coloque el tejido en una placa de Petri limpia. Una vez que se ha eliminado el material, la membrana translúcida que queda es la membrana de Brooks enriquecida de forma aproximada. Trabaje bajo un microscopio estereoscópico para eliminar el coroides y enriquecer aún más la membrana.Lave brevemente la membrana de Brooks con agua ultrapura para eliminar restos de coroides y sangre antes de colocar la membrana en un tubo de microcentrífuga. Después de suspender la membrana en aproximadamente un mililitro de agua ultrapura, vortexee brevemente para ayudar a desprender cualquier materia celular contaminante. Centrifugue la muestra hasta formar un pellet y aspire el sobrenadante.La membrana de brooks enriquecida que queda ahora está lista para la solubilización o puede guardarse en almacenamiento a menos 80 grados Celsius. Para su uso posterior en la extracción de proteína a partir de la membrana de brooks enriquecida, sumerja el tejido en 500 microlitros de urea ocho molar durante seis horas.A temperatura ambiente, centrifugue las muestras solubilizadas para formar un precipitado con cualquier material extracelular restante. Retire el sobrenadante y transfiéralo a una membrana de diálisis. Coloque la muestra en un litro de PBS para realizar la diálisis durante 16 horas a cuatro grados Celsius.Para cada muestra, agregue 40 microlitros de perlas de aislamiento de proteínas y gire la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Pelice las perlas mediante centrifugación y elimine el sobrenadante. Solubilice la proteína unida a las perlas en 30 microlitros de tampón de carga de muestra 2x.Después de una incubación de 10 minutos, centrifugar las perlas y recoger el sobrenadante. Cargar las proteínas liberadas en un gel SDS-PAGE precolado con gradiente para la separación de proteínas.Siga procedimientos estándar para visualizar las bandas de proteínas separadas, si se desea. Realice una transferencia western siguiendo procedimientos de laboratorio estándar para enriquecer la membrana macular de Brooks. Siga los mismos procedimientos que se demostraron anteriormente, excepto que, mientras la retina neurosensorial aún esté en su lugar, localice la coloración amarilla de la fóvea que representa la región macular central.Coloque un punzón de biopsia estéril de seis milímetros por encima de la región foveal y corte firmemente hacia la mácula, manteniendo el punzón de biopsia en su lugar. Realice una incisión separada con un escalpelo desde el borde de la copa ocular hasta el borde de la hoja del punzón de biopsia. Separe el tejido ocular circundante para obtener una biopsia limpia.Retire el disco de tejido de seis milímetros del punch y colóquelo sobre la tapa de la placa de Petri limpia reservada anteriormente. Coloque la tapa de la placa de Petri y el punch macular bajo el microscopio de disección. Verifique la presencia de tinción amarilla en la fóvea para inferir la precisión de la biopsia.A continuación, utilice un raspador celular estéril para retirar suavemente las células del EPR. Sujete el disco macular a través de la esclerótica utilizando las puntas de una pinza y desprenda lentamente el complejo de membrana de Bruch y coroides. Si es necesario, utilice una hoja de bisturí para separar la membrana de Bruch de la esclerótica.Una vez más, utilice el raspador celular para eliminar la coroides y los restos sanguíneos no deseados de la membrana de Brooks. Coloque la membrana de Brooks macular en un tubo y suspéndala en un mililitro de agua ultrapura. Agite brevemente en vórtex para ayudar a desprender cualquier material celular contaminante. Centrifugue la muestra para formar un pellet de la membrana y aspire el sobrenadante.La membrana de Brooks enriquecida aislada de la mácula ya puede utilizarse para análisis proteómico mediante los protocolos de digestión deseados. Estas secciones de tejido teñidas con h y d de tejido macular humano antes y después de eliminar mecánicamente las estructuras coroidales externas demuestran el enriquecimiento de la membrana de Brooks y los capilares coroideos acelulares respecto al estroma coroidal. Este gel SDS-PAGE demuestra la ausencia de contaminación por albúmina procedente de sangre en las muestras de membrana de Brooks tanto puras como diluidas.Este inmunotransferencia representativo se realizó para detectar la proteína similar al factor H regulador inmune, proveniente de uno de tres donantes individuales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo enriquecer la membrana de Bruch a partir de un ojo humano de manera que proporcione un recurso valioso para el posterior análisis bioquímico y biofísico de esta estructura acelular única. No olvide que trabajar con tejido humano y con instrumentos afilados puede ser extremadamente peligroso, y que son necesarias precauciones como el uso de equipo de protección personal completo y la vacunación contra la hepatitis B.Antes de manipular el tejido humano, siempre se debe tomar.

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