Name: Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a generar células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC) a partir de sangre periférica humana. Este protocolo permite estudiar la disfunción endotelial en enfermedades cardiovasculares con una muestra pequeña.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones financiadas por la Fundación Británica del Corazón (BHF), Dinosaur Trust, Fundación McAlpine, Fondation Leducq, Fight for Sight, el Centro de Investigación Biomédica de Cambridge, el Instituto Nacional de Investigación en Salud, incluyendo (i) el Centro de Medicina Regenerativa BHF Oxbridge [RM/13/3/30159], (ii) el Centro de Excelencia en Investigación de BHF Cambridge, (iii) el Hospital de Addenbrooke, el Fideicomiso de la Fundación NHS de los Hospitales de la Universidad de Cambridge y (iv) el Hospital Papworth NHS Foundation Trust, y apoyó el Centro de Fenotipado Celular BRC de Cambridge NIHR. MLO está financiado por una beca intermedia de BHF. FNK está financiado por una beca de doctorado de BHF.

A esquemática del protocolo de generación BOEC se muestra en la Figura 1. 1. Extracción de Sangre y gradiente de densidad de centrifugación <ol><li> Para cada donante, añadir 3 ml de citrato de sodio a cada uno de dos tubos de centrífuga de 50 ml cónicos. Recoger 60 ml de sangre por punción venosa y añadir 30 ml a cada tubo. Invierta suavemente 2-3 veces para mezclar. Utilice tan sólo 40 ml de sangre en el protocolo, con volúmenes de citrato ajustados en consecuencia. NOTA: Es esencial que las muestras de sangre se procesan dentro de 2 horas de la recolección. Retraso en el procesamiento de los resultados de sangre en una marcada reducción en el rendimiento colonia consecuencia. </li><li> Preparar nuevos tubos cónicos que contienen medio de centrifugación en gradiente de densidad por primera invirtiendo el frasco varias veces para mezclar. En una campana estéril, añadir 15 ml de medio de centrifugación en gradiente de densidad por cada 50 ml tubo cónico (1 tubo por cada 10 ml de sangre, 6 tubos por donante). </li><li> Diluir la sangre 1: 1 con fosfato de DulbeccoSaline -Buffered (DPBS). Incline el tubo que contiene el medio de centrifugación en gradiente de densidad a un ángulo de 20 ° con la superficie de trabajo. El uso de una ayuda de la pipeta y una pipeta serológica de 25 ml, la capa lentamente 21 ml de sangre diluida en la parte superior del medio mediante la adición gradual de sangre por la pared del tubo inclinado. NOTA: Si lo hace, minimizar la mezcla de la sangre con la capa de gradiente de densidad y producirá una capa leucocitaria más apretado, así como un rendimiento mejorado. </li><li> Centrifugar las muestras a 400 xg durante 35 min a TA con el acelerador y el freno. </li><li> Durante este período de centrifugación, comenzará el recubrimiento de colágeno se detalla en los pasos 2.1 - 2.4. Asegúrese de que estos pasos se han completado antes de proceder al paso 3.1. </li></ol> 2. El colágeno Recubrimiento de T-75 Frasco y Preparación del medio de cultivo NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana de cultivo celular. <ol><li> Preparar una solución de colágeno / ml 50 mg diluyendo Stock TyPE I colágeno en 10 ml de ácido acético 0,02 M Ejemplo:. para el colágeno de stock a una concentración de 4,05 mg / ml, añadir 123,5 l de colágeno a 10 ml de ácido acético 0,02 M. Filtro estéril suspensión de colágeno antes de su uso. </li><li> Utilizando una pipeta serológica, añadir 7,5 ml de solución de colágeno a un matraz de cultivo de células T-75. Este volumen da 5 mg de colágeno / cm2 (o 375 mg / frasco). Escudo matraz durante 1 hora a RT. </li><li> Preparar el medio de crecimiento endotelial utilizado para la generación BOEC completándolo medio basal endotelial con los suplementos de factores de crecimiento proporcionadas por el fabricante. Añadir todos los suplementos, pero no agregue suero. Para preparar 15 ml de medio de generación BOEC, añadir 2,5 ml de suero bovino fetal definido (FBS) a 12,5 ml de medio de crecimiento endotelial que contiene los suplementos de factores de crecimiento. </li><li> Continúe con los pasos descritos en la sección 3. Después del período de recubrimiento 1 hr, aspirar la solución de colágeno y lava el ácido acético residual mediante pipeteoen 10 ml de DPBS. Aspirar el DPBS y repita este paso de lavado una vez más. Si la suspensión celular obtenida durante el paso 3.3 no está listo para el recubrimiento en este momento, añadir 5 ml de medio de generación BOEC al matraz para mantener el revestimiento de colágeno a partir de secado-out. </li></ol> 3. Recogida y Chapado de PBMNCs <ol><li> Después de la centrifugación en gradiente de densidad se indica en el paso 1.4, recoger cuidadosamente la capa leucocitaria usando una pipeta de transferencia de plástico estéril. Colección de la capa leucocitaria debe producir aproximadamente 20 ml de suspensión de células y plasma de cada tubo. Evitar la transferencia de el medio de gradiente de densidad. </li><li> Diluir la suspensión de células mononucleares 1: 1 en DPBS e invierta para mezclar. Centrifugar a TA durante 20 min a 300 xg con freno y acelerador al máximo. </li><li> Después de la centrifugación, aspirar las células sobrenadante y resuspender mediante la adición de 1 ml de medio de generación BOEC a cada pellet y pipeteando arriba y abajo varias veces. Celular piscina suspensiones und reponer volumen total de 10 ml con el medio restante. </li><li> Para obtener una estimación del número total de células, muestra de 10 l de suspensión celular y se diluye 50x con 490 l de solución de Turk, que se lisar células rojas de la sangre. Contar una muestra de 10 l de la suspensión celular diluida usando un hemocitómetro. NOTA: 60 ml de sangre debe producir aproximadamente 100 a 150 x 10 6 células blancas de la sangre para la siembra. </li><li> Placa suspensión celular entera en una sola, T-75 frasco de colágeno recubierto, top-up volumen medio a 15 ml / frasco y la cultura a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2. Las células chapados en este momento representan el paso 0. NOTA: Es posible congelar las PBMNCs aislados antes del aislamiento BOEC con el fin de derivar las BOECs en un momento posterior o con el fin de transportar los PBMNCs a un laboratorio diferente, donde los BOECs se pueden generar. Sin embargo, es importante señalar que PBMNCs congelación podrían reducir la eficiencia de aislamiento BOEC. See sección 8 a continuación para el método. </li></ol> Cultivo Celular 4. A largo plazo <ol><li> Cambio de medio cada 2 días mediante la adición de 15 ml de medio de generación BOEC fresco (5: 1 mezcla de medio de crecimiento de células endoteliales y definido FBS). Para fines de semana, cambios de medio pueden retrasarse a cada 3 días. NOTA: colonias consecuencia deben aparecer entre los 7 y 14 días de cultivo. </li><li> Supervisar el frasco de cultivo BOEC en los días 7-14 de la aparición de colonias excrecencia. Identificar las colonias como grupos circulares de células que presentan un clásico morfología de adoquines endotelial. </li><li> Una vez que una colonia o múltiples colonias se identifican en el matraz, continúe con cambios de medio y permitir que las colonias crezcan hasta aproximadamente 1.000 a 2.000 células por colonia antes de pases. Determinar el número de células por colonia a través de una estimación visual aproximada. NOTA: Como guía, se acostumbra a paso colonias excrecencia iniciales Una semana después de la identificación de la primera colonia consecuencia. </li> &lt;li&gt; células paso por aclarado matraces dos veces con 10 ml de DPBS. Añadir 5 ml de 1X tripsina-EDTA y se incuban en una incubadora a 37 ° C durante 5 min. Después de 5 min, neutralizar la tripsina con 10 ml de medio (que contiene FBS) y llevar las células en suspensión con pipeteo repetido. </li><li> Suspensión Centrifugar a 300 xg durante 5 min, se resuspende en 15 ml de medio fresco y generación BOEC placa entera suspensión celular a un nuevo matraz T-75 (que representa el paso 1, P1). No se requiere ningún recubrimiento de colágeno. </li><li> Continuar cambios de medio como se describe más arriba hasta que las células son confluentes (aproximadamente 3-5 x 10 6 células por frasco). Una vez confluentes, las células de paso como se ha descrito en el paso 4.3. NOTA: Desde el paso 2 en adelante, las células ya no requieren la generación de medio BOEC y puede ser cultivado en un medio de crecimiento de células endoteliales y 10% estándar FBS inactivado por calor. Revestimiento de colágeno puede ser utilizado como un paso opcional en el futuro, ya que no hay evidencia que sugiere que la presencia de colágeno puede mejorar prolifer BOEClas tasas de inflación. </li><li> Para pases continuación, la placa no menos de 750.000 células por matraz T-75 como bajas densidades celulares pueden causar los BOECs para detener la proliferación. </li></ol> 5. La congelación y descongelación Culturas BOEC <ol><li> Trypsinize células como se describe en la sección 4.3 y se centrifuga a 300 g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de medio. Esto no requiere un medio de crecimiento de células endoteliales; DMEM con 10% FBS estándar será suficiente. Recoger una muestra de 10 l de la suspensión de células para llevar a cabo un recuento de células manual utilizando un hemocitómetro. </li><li> Centrifugar de nuevo y resuspender en 2x10 6 células / ml en medio de criopreservación enfriado con hielo (40% de DMEM con 50% de FBS y 10% de DMSO). Añadir 0,5 ml (10 6 células) a cada vial, lugar viales en un hielo isopropanol frío recipiente de crioconservación y colocar en un congelador a -80ºC durante al menos 2 horas antes de transferir a nitrógeno líquido. No deje las células a -80 ° C durante más de 24 horas. </li&gt; <li> Para descongelar las células, añadir 10 ml de medio precalentado a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml. NOTA: Al descongelar a cabo el paso 1 células, descongelar en un medio de crecimiento de células endoteliales suplementado con 20% FBS definido por los primeros 2 días después de la descongelación. Esto conduce a un aislamiento de células más estable en el futuro. </li><li> Extraer células del nitrógeno líquido y descongelación en un 37 ° C baño de agua con agitación suave hasta que sólo un pequeño cristal de hielo se deja en el vial. Añadir el contenido del vial gota a gota al tubo de centrífuga cónico y centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de EGM-2MV + 10% de FBS. Añadir a T-75 frasco y medio superior hasta 15 ml. </li></ol> 6. Caracterización de BOECs por Citometría de Flujo <ol><li> Una vez que las colonias BOEC descritos en la sección 4 se les ha permitido ampliar, trypsinize células como se describe en la sección 4.4 y resuspender en una concentración de 10 6 células por ml en tampón de tinción (DPBS ingenioh 2% de FBS y EDTA 2 mM). </li><li> Combine 10 5 células con anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra CD45, CD14, CD34, CD31 (uso todos a la dilución 1:20) o VEGFR2 (diluir 1:10) (ver Tabla 1 para más detalles). Incubar durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con 1 ml de tampón de tinción y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Sobrenadante Aspirar y resuspender en 400 l de tampón de tinción para el análisis. Mantenga las células a 4 ° C y protegido de la luz antes del análisis. </li><li> Realizar análisis de citometría de un citómetro equipada en detectar los anticuerpos conjugados con fluorescencia utilizados en el ensayo. </li><li> Utilice una muestra BOEC sin teñir para identificar la población de células en el citómetro mediante el ajuste hacia delante y voltajes de dispersión lateral, así como los voltajes para los canales de FITC y APC. </li><li> Determinar gating umbrales utilizando células isotipo manchado para cada fluorocromo. Evaluar positividad para cada marcador de superficie celular basado en la presencestá analizando e de un cambio máximo en la intensidad de fluorescencia frente al control de isotipo para el fluorocromo. </li></ol> 7. Caracterización de BOECs por Microscopía de inmunofluorescencia <ol><li> BOECs placa en una pocillos 24, placa de cultivo tisular de fondo plano sin cubreobjetos a una densidad de 5 x 10 4 células en 500 l de medio de crecimiento de células endoteliales + 10% de FBS por pocillo y se dejó a adherirse y crecer a 37 inactivado por calor ° C, 5% de CO 2 hasta que las células cubrir al menos el 70-80% de la superficie de cada pocillo (estimación de confluencia mediante inspección visual bajo un Microscopio de luz). </li><li> Lavar las células en cada pocillo durante 5 min con 1 ml de DPBS. </li><li> Fijar las células O / N a 4 ° C con 500 l de solución de paraformaldehído al 4% en DPBS. </li><li> Lavar las células de 3 x 5 min con 1 ml de DPBS por pocillo. Añadir y eliminar los DPBS utilizando una pipeta y un aspirador, respectivamente. </li><li> Permeabilizar las células para 3 x 10 min con 0,2% de polisorbato 20 en DPBS. </li&gt; <li> Se incuban las células durante 1 hora a RT en tampón de bloqueo que contiene 10% de FBS en DPBS. </li><li> Células de la mancha a 4 ° CO / N en 300 l de tampón de dilución de anticuerpo (0,1% de albúmina de suero bovino en DPBS) que contiene anticuerpos primarios dirigidos contra CD34 (10 mg / ml), CD144 (1: 300) o vWF (1: 250) . Ver Tabla 1 para más detalles. </li><li> Lavar anticuerpos primarios no consolidados para 5 x 10 min con DPBS. </li><li> Se incuban las células durante 1 hora a RT con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia apropiada, como se detalla en la Tabla 1 (todos a 1: 200). </li><li> Lavar secundaria de anticuerpos no unidos para 5 x 10 min con DPBS. </li><li> Se incuban las células con 1 mg / ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en DPBS durante 10 min a RT. </li><li> Lavar las células con DPBS durante otros 3 x 5 min. </li><li> Celdas de imagen a 100 aumentos utilizando un microscopio invertido equipado con una fuente de luz externa para la excitación de fluorescencia, y capturar imágenes utilizando un adjuntarcámara digital ed para su posterior análisis fuera de línea. </li></ol> 8. congelación y descongelación PBMNCs <ol><li> Al final de la etapa 3.2, después de la centrifugación, aspirar el medio y alterar manualmente el sedimento celular con repetido pipeteado arriba y hacia abajo utilizando una punta de pipeta P1000. Añadir 1 ml de medio de congelación, 90% de suero y 10% de DMSO, asegurándose de mezclar suavemente para producir una suspensión celular. Transferir la suspensión celular a un criovial y congelar y descongelar como se describe en la Sección 5. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos un protocolo detallado que permite la derivación robusta y eficiente de BOEC a partir de células mononucleares de sangre periférica adultas (PBMNC). Nuestro protocolo incluye dos refinamientos importantes que representan avances en los métodos anteriores de aislamiento de BOEC. 14-16 Estos incluyen la ausencia de heparina en el medio de cultivo inicial de PBMNC y el uso de suero definido y calificado para células madre embrionarias. Este último refinamiento es de particular importancia. El suero calificado con células madre embrionarias (ESC) es un grado de suero más consistente y, aunque aún no se sabe qué componente (s) están enriquecidos en el suero que benefician el aislamiento de BOEC, el impacto de este suero definido en la eficiencia de la generación de BOEC es claro en nuestras manos. Además, también hemos tenido éxito en el aislamiento de BOEC utilizando suero humano, lo que permite la generación de BOEC para la traducción clínica. En nuestras manos, este protocolo refinado da como resultado el aislamiento exitoso de cultivos estables de BOEC de más del 90% de los donantes, lo que lo convierte en uno de los métodos de generación de BOEC más confiables reportados hasta el momento. Aunque el uso de sueros particulares es fundamental para la generación de BOEC, también representa una limitación principal del protocolo actual. Las mejoras futuras de la técnica podrían incluir la generación de estas células en condiciones de cultivo definidas y libres de suero.
Los pasos críticos en el protocolo incluyen el procesamiento de muestras de sangre lo antes posible después de la recolección, la recolección completa de las células de la capa leucocitaria después de la centrifugación por gradiente de densidad y el paso oportuno de las colonias iniciales de P0 a P1. Este paso de paso es fundamental para establecer un aislamiento estable. Al igual que otras células endoteliales, las BOEC parecen ser muy sensibles a la densidad de la placa. Si la densidad de recubrimiento después del paso es demasiado baja, los BOEC no proliferarán. Por el contrario, si se permite que las colonias se vuelvan demasiado confluentes antes de pasar, las células también dejarán de proliferar y tendrán la tendencia a convertirse en un fenotipo celular mesenquimal alargado. Si aparecen pocas colonias entre los días 7 y 14, o si las colonias son de tamaño pequeño, la solución de problemas puede incluir el aumento de la densidad celular pasando colonias P0 a un matraz T-25 en lugar de un T-75.
Una vez que se domina la técnica, los BOEC resultantes se pueden utilizar en varias aplicaciones, incluidos estudios in vitro de biología de células endoteliales, modelado de enfermedades y detección de fármacos, así como terapias de trasplante celular in vivo . Una consideración importante para el desarrollo de cualquier proceso de terapia celular es utilizar células libres de mutaciones patógenas. Hemos demostrado previamente que los BOEC aislados utilizando nuestro protocolo poseen genomas que están libres de variaciones en el número de copias y, por lo tanto, son representativos del individuo del que se recolectaron. Además, también hemos demostrado que la mayoría de las líneas iPSC derivadas de BOEC están libres de variaciones en el número de copias. 13 Esto contrasta con informes anteriores de variación en el número de copias en las iPSC derivadas de fibroblastos. Hasta la fecha, estas células siguen siendo las únicas iPSC para las que se ha informado de este grado de fidelidad genómica. Esta característica es importante para el campo de la biología de las iPSC y el uso de iPSC en el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y futuras terapias de trasplante de células.

Hasta hace poco, se creía que la generación post-natal de nuevos vasos sanguíneos que se produzca exclusivamente a través de un proceso conocido como angiogénesis, definido como el surgimiento de nuevos vasos a partir de las células endoteliales de los vasos preexistentes. 1 Este proceso contrasta de la vasculogénesis, o la formación de novo de vasos sanguíneos a partir de progenitores endoteliales, que se cree que se producen exclusivamente durante la embriogénesis. 2 Sin embargo, estudios más recientes han identificado y aislado células progenitoras endoteliales circulantes (EPC) en la sangre periférica de adultos. Estas células poseen la capacidad de diferenciarse en células endoteliales maduras en cultivo y se cree que participar en la vasculogénesis postnatal. 3,4 Los protocolos para el aislamiento y expansión de estas EPCs típicamente involucran el cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) en medios que contienen factores de crecimiento endoteliales, incluyendo vasculfactor de crecimiento endotelial ar (VEGF) y las culturas EPC factor de crecimiento fibroblástico-2 5-8. producen una variedad de diferentes tipos de células de manera espectacular. Culturas iniciales (&lt;7 días) están dominados por un tipo celular de monocitos, conocida en la literatura como &quot;primeros&quot; EPC. A pesar de su nombre, estas células expresan el marcador CD14 de monocitos, son negativos para el marcador CD34 progenitor y expresan niveles sólo mínimas de la clásica marcadores endoteliales CD31 y VEGF receptor 2 (VEGFR2). 5 cultura Continuación da lugar a una población secundaria de las células, conocido como EPC finales de excrecencia o células endoteliales excrecencia de sangre (BOECs), que aparecen como colonias discretas de células similares a las endoteliales. A diferencia de los principios de EPCs monocíticas, BOECs, que también han sido llamados formadoras de colonias (células endoteliales ECFCs), células endoteliales o células endoteliales excrecencia late-excrecencia, exhiben la morfología de adoquines que es típico de monocapas de células endoteliales y son muy similares en marcador de superficie5 y la expresión génica 9 a madurar las células endoteliales. La generación de células similares a las endoteliales de sangre periférica ofrece varias ventajas, en particular para el estudio de la disfunción de la célula endotelial asociada con trastornos vasculares tales como la hipertensión arterial pulmonar (HAP) 10 o von Willebrand enfermedad. 11 Antes de la disponibilidad de BOECs, endotelial células sólo se podrían derivar de órganos explantados en el momento de la muerte o el trasplante de órganos, o aislada de la vena umbilical en el nacimiento. Esta disponibilidad reducida representado una seria limitación para la comprensión de la biología de las células endoteliales de pacientes con trastornos cardiovasculares, así como las interacciones entre las células endoteliales y, o bien células de la sangre o células murales. Además, el aislamiento y el cultivo de una población pura de células endoteliales a partir de estas fuentes es técnicamente difícil y las células obtenidas por estos métodos exhiben solamente un limited capacidad proliferativa. Por lo tanto, BOECs ofrecen un sustituto valiosa para el aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias derivadas del paciente. Además de sus aplicaciones in vitro, BOECs también son potencialmente útiles en terapias de trasplante de células autólogas. Estas aplicaciones incluyen tanto el trasplante de células endoteliales para promover la neovascularización (véase 12 y referencias en él), así como la generación de células madre pluripotentes inducidas (CMPI). 13 iPSCs derivados de BOEC se pueden utilizar para el modelado de la enfermedad y ofrecen un potencial inmenso como el de partida material para las terapias con células autólogas. BOECs reprogramar más rápido y con una mayor eficiencia que los fibroblastos de la piel. Además, BOECs también permite la generación de células iPS que están libres de anomalías del cariotipo, que es una característica esencial de cualquier tecnología que será adecuado para aplicaciones de traslación. La capacidad de generar iPSCs de una muestra de sangre de un pacientelso elimina la necesidad de una biopsia de piel y la generación de fibroblastos de la piel, facilitando de este modo la generación de células de pacientes con trastornos de la cicatrización de heridas, o los muy jóvenes. El protocolo se detalla a continuación, aprobado por y realizadas de conformidad con las directrices del Comité de Servicio de Ética de la Investigación Nacional (este de Inglaterra), proporciona un método sencillo y fiable para la generación de BOECs con una eficiencia superior al 90% a partir de un volumen relativamente pequeño (60 ml) de sangre periférica. Estas células son altamente proliferativa y pueden ser pasados ​​repetidamente, lo que permite la generación de cientos de millones de células de una única muestra de sangre.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Para la extracción de sangre</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 60 ml con punta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>19G Surflo Winged Infusion Set</td><td>Terumo</td><td>SV-19BL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubo de centrífuga cónico</td><td>StarLab</td><td>E1450</td><td>2 por donante</td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Martindale Pharmaceuticals</td><td>270541</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>For buffy coat isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus GE</td><td>Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (sin Ca2+ y Mg2+)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de plástico envueltas estériles</td><td>Appleton Woods</td><td>KC231</td><td></td></tr><tr><td>Turk' s Solución</td><td>Millipore</td><td>1.093E+09</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Para cultivo celular, paso y congelación de células</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo 1 (derivado de la cola de rata)</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4236</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (sin Ca2+ y Mg2+)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.02M Ácido Acético&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>preparado en agua de grado reactivo</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento endotelial-2MV (contiene Bullet Kit, pero no suero)</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td><fuerte>Nota:</fuerte> Es esencial que el medio no contenga heparina. &nbsp; No usar</fuerte> EGM-2.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (EE. UU.),</td><td>Hiccona</td> definida <td>SH30070</td><td></td></tr><tr><td>10x Tripsina EDTA</td><td>Gibco</td><td>T4174</td><td>Diluir a 1x en PBS antes de usar</td></tr><tr><td>FBS inactivado por calor</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Contenedor</td> <td>de congelaciónSigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Para la caracterización por citometría de flujo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>conjugado con FITC ratón anti-humano CD14 BD</td><td>Biosciences</td><td>555397</td><td>IgG de ratón1k, Clon: WM59 Dilución: 1:20</td></tr><tr><td>Ratón conjugado con FITC anti-humano CD31 BD</td><td>Biosciences</td><td>555445</td><td>IgG1k, Clon: WM59 Dilución: 1:20</td></tr><tr><td>Ratón conjugado con APC anti-humano CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>555824</td><td>Ratón IgG1k, Clon: 581/CD34 Dilución: 1:20</td></tr><tr><td>conjugado con FITC ratón anti-humano CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560976</td><td>IgG1k, Clon: HI30 Dilución: 1:20</td></tr><tr><td>&nbsp; Ratón conjugado con APC anti-humano VEGFR2</td><td>R& D Systems</td><td>FAB357A</td><td>ratón IgG1, clon: 89106 Dilución: 1:10</td></tr> Control <tr><td>de isotipo de IgG1k de ratón conjugado con FITC</td> BD <td>Biosciences</td><td>555748</td><td>Clon: MOPC-21 Dilución: 1:20</td></tr><tr><td>IgG1k de ratón conjugada con APC</td> Clon de <td>BD Bioscience</td><td>555751</td> s<td>: MOPC-21 Dilución: 1:20</td></tr><tr><td>IgG de ratón conjugada con APC1k control de isotipo</td><td>R& D Systems</td><td>IC002A Dilución: 1:10</td><td>Clon: 11711</td></tr><tr><td>EDTA, solución 0.5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Para microscopía inmunofluorescente&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich 158127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Ratón monoclonal anticuerpo anti-CD34 humano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB72271</td><td>Clon 756510, IgG1, uso a 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Cabra policlonal anti-cadherina VE-humana (CD144)</td><td>R& D Systems</td><td>AF938</td><td>IgG purificada por afinidad de antígenos, uso a 1:300</td></tr><tr><td>Monoclonal de conejo antihumano Von Willebrand Factor (vWF)</td><td>Abcam</td><td>ab154193</td><td>Clon EPSISR15, uso a 1:250</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón burro, conjugado Alexa Fluor 488 Life</td><td>Technologies</td><td>A-21202</td><td>Policlonal, 2 mg/ml, uso a 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-cabra de burro, conjugado</td> <td>Alexa Fluor 488Life Technologies</td><td>A-11055</td><td>Policlonal, 2 mg/ml, 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo anti-burro, conjugado Alexa Fluor 568 Life Technologies</td><td></td><td>A-10042</td><td>Policlonal,&nbsp; 2 mg/ml, 1:200</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>uso a 1 &mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

generación y cultura de sangre consecuencia endoteliales las células de la sangre periférica humana

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Históricamente, la disponibilidad limitada de células endoteliales primarias de pacientes con trastornos vasculares ha dificultado el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la disfunción endotelial en estos individuos. Sin embargo, la reciente identificación de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC), generadas a partir de progenitores endoteliales circulantes en sangre periférica adulta, puede eludir esta limitación al ofrecer un sustituto de células primarias de tipo endotelial para las células endoteliales derivadas del paciente. Más allá de su valor para comprender la biología endotelial y el modelado de enfermedades, los BOEC tienen usos potenciales en las terapias de trasplante de células endoteliales. También son un sustrato celular adecuado para la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) mediante reprogramación nuclear, ofreciendo una serie de ventajas sobre otros tipos de células. Describimos un método para la generación, cultivo y caracterización fiables de BOECs a partir de sangre periférica adulta para su uso en estas y otras aplicaciones. Este enfoque (i) permite la generación de células endoteliales específicas del paciente a partir de un volumen relativamente pequeño de sangre periférica adulta y (ii) produce células que son muy similares a las células endoteliales primarias en morfología, señalización celular y expresión génica.

Aislamiento de células mononucleares de la capa leucocitaria de 60 ml de sangre normalmente produce 100-150x10 6 células blancas de la sangre totales. Cuando chapada en un solo matraz T-75, el gran número de células en la suspensión celular no lisadas hace que sea difícil de resolver células adherentes mediante microscopía de campo claro individuales. Cambios de medio repetidas dan lugar a la liquidación de las células no adherentes y permiten la visualización de la población adherente de monocitos &quot;primeros&quot; EPC. Al día 7, el T-75 contendrá aproximadamente 7x10 6 de estas células adherentes alargados. Desde el día 7 al 14, las colonias de BOECs deben aparecer dentro del matraz (Figura 2A). Colonias primero aparecen como 3 a 5 células adyacentes. Número de colonias excrecencia puede variar de 1 a 10 colonias por 60 ml de sangre. En general, los donantes más jóvenes (es decir, 20-25 años de edad) tienden a producir un mayor número de colonias excrecencia, que también aparecen antes en la cultura.BOECs proliferan de este grupo central de las células para formar colonias circulares que consisten en varios cientos de células. Las células dentro de estas colonias presentan una clásica morfología de adoquines endotelial. Es preferible paso colonias iniciales cuando contienen aproximadamente 1.000 células por colonia. Colonias consecuencia suelen alcanzar este tamaño de 7 días después de su aspecto original en la cultura. Una vez que las colonias originales se pasan a un nuevo matraz T-75, deberían proliferar para formar una monocapa confluente (3-5x10 6 células por matraz) dentro de los 5 días o menos (Figura 2B). En un pequeño porcentaje de aislamientos (&lt;10%), las colonias excrecencia no aparecen o no proliferan suficientemente tras este paso inicial pases. BOECs que exhiben baja proliferación después de su primer pases rara vez van a convertirse en aislamientos BOEC estables ya menudo detener la proliferación en dos o tres pasajes. El monocíticaEPC principios contenidos en las culturas BOEC son no proliferativa y típicamente se borran de las culturas dentro de 1-2 pasajes. Liquidación de estas células tempranas se debe a la muerte celular, la insuficiencia de las células tempranas de volver a adherirse después de pases y la dilución de los principios de EPCs no proliferativas con pases repetidos. Células Passage 1 o bien se pueden pases más en la cultura o congelaron para su uso posterior. Una vez que se genera un aislamiento estable, las células pueden ser pasados ​​a una velocidad de 1 matraz confluente a 3-5 nuevos matraces T-75 hasta el paso 8 o 9 antes de convertirse en reposo. Una vez más, la densidad celular es crítica a través de la cultura. En nuestra experiencia, no menos de 750.000 células deben ser chapada en un matraz T-75, como densidades celulares más bajos puede causar la detención del crecimiento. A pesar del alto potencial proliferativo de BOECs, las células deben tampoco se les permitirá convertirse overconfluent (es decir.,&gt; 5x10 6 células por frasco) ya que esto puede causar convers<html> ion de BOECs a un fenotipo no proliferativa. Proponemos que cualquier célula está etiquetado como un BOEC debe mostrar superficie celular apropiado y tinción intracelular de marcadores endoteliales. Caracterización de BOECs se puede lograr mediante citometría de flujo (Figura 3) o microscopía de fluorescencia (Figura 4), ​​después de la tinción para los marcadores típicos de células endoteliales. BOECs son positivas para el CD31 marcadores de superficie endotelial y VEGFR2 y son negativos para el marcador CD14 de monocitos y el marcador CD45 pan-leucocitario. BOECs también posess cuerpos de Weibel-Palade y así expresar el factor de Von Willebrand (vWF) como tinción citoplasmática discreta, punteada. A diferencia de otros tipos de células endoteliales maduras, tales como la arteria pulmonar o células endoteliales aórticas, BOECs también expresan el progenitor y la activación marcador CD34 en su superficie. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Diagrama esquemático del protocolo de generación BOEC. Células mononucleares de sangre periférica son aisladas de sangre venosa mediante centrifugación en gradiente de densidad y se cultivaron en placas recubiertas con colágeno en medio de crecimiento endotelial con adición de FBS definidos. Colonias BOEC aparecen dentro de 7-14 días de cultivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig2.jpg" /> Figura 2. Imágenes campo claro de culturas BOEC representativos. (A) colonias consecuencia aparece en culturas entre los días 7 y 14. Las colonias se presentan como colecciones de células de tipo endotelial, que se disponen en una sola capa de adoquines y proliferan radialmente hacia fuera desde un punto central. Alrededor de las colonias excrecencia son el mono adherentecélulas cytic que componen la gran mayoría de las células en las primeras culturas. Estas células, previamente descritas como &quot;principios&quot; células progenitoras endoteliales, tienen una morfología de tipo huso y expresan el marcador CD14 monocitos. (B) A raíz de los pases, los BOECs altamente proliferativas hacerse cargo de las culturas, ya que las células monocíticas no proliferativas o bien mueren o dejan de volver a conectar después de pases. Barra de escala 250 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterización de BOECs por citometría de flujo. BOECs se tripsinizaron y se tiñeron con anticuerpos de control de isotipo conjugados con fluorescencia (gris pico de llenado) o anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie específicos (línea roja). Marcadores de superficie para la caracterización de citometríaincluyen los marcadores hematopoyéticos CD45 y CD14, los marcadores endoteliales CD31 y VEGFR2 y la progentior y marcador de activación endotelial CD34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig4.jpg" /> Figura 4. La tinción de inmunofluorescencia de BOECs para marcadores de células endoteliales. Inmunofluorescencia imágenes representativas de BOECs immunostained con anticuerpos dirigidos contra endotelial marcador de superficie celular CD144 (VE-cadherina, panel superior derecho) y la glicoproteína de sangre Factor von Willebrand (vWF, panel inferior derecho) . Paneles correspondientes que muestran tinción DAPI nuclear se muestran a la izquierda. Barra de escala 50 micras. para CD144. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una mayor</a>versión de esta figura.

Este protocolo permite la generación y caracterización fiables de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOECs) a partir de un pequeño volumen de sangre periférica adulta. Las BOEC se pueden utilizar como sustituto de las células endoteliales de pacientes con trastornos vasculares y como sustrato para la generación de células madre pluripotentes inducidas.

Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

El objetivo general de este protocolo es generar de forma confiable células endoteliales de crecimiento sanguíneo a partir de sangre periférica humana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vascular, como la forma en que la disfunción de las células endoteliales contribuye a enfermedades cardiovasculares, incluyendo la hipertensión arterial pulmonar o la enfermedad de von Willebrand. La principal ventaja de esta técnica es que genera de manera constante una población estable de células endoteliales de crecimiento sanguíneo a partir de un pequeño volumen de sangre periférica de adultos. El procedimiento será demostrado por Christopher Wang, el estudiante de posgrado de mi laboratorio, y el profesor del laboratorio Nicholas Morrell.Para comenzar este procedimiento, agregue tres mililitros de citrato de sodio a cada uno de los dos tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros por cada donante. Luego, agregue 30 mililitros de la sangre recolectada a cada tubo.Invierta suavemente los tubos dos o tres veces para mezclar. A continuación, diluya 60 mililitros de sangre con DPBS en una proporción de uno a uno; incline el tubo que contiene el gradiente de densidad a un ángulo de 20 grados con respecto a la superficie de trabajo utilizando un ayudante para pipeta y una pipeta serológica de 25 mililitros.Coloque lentamente 21 mililitros de sangre diluida encima del medio. Posteriormente, centrifugue las muestras a 400 × g durante 35 minutos a temperatura ambiente con el acelerador y el freno desactivados. Durante la centrifugación, prepare una solución de colágeno a 50 microgramos por mililitro diluyendo el stock. El colágeno tipo I en 10 mililitros de ácido acético 0,02 molar estéril.Filtre la suspensión de colágeno antes de usarla. A continuación, agregue 7,5 mililitros de la solución de colágeno a un matraz de cultivo celular T 75. Deje que el matraz se recubra durante una hora a temperatura ambiente.Después de una hora de recubrimiento, aspire la solución de colágeno y agregue mediante pipeta 10 mililitros de DPBS al frasco para eliminar el ácido acético residual. Aspire el DPBS y repita el lavado una vez más. Luego, agregue cinco mililitros de medio de generación de BOEC al frasco para evitar que el recubrimiento de colágeno se seque hasta que la suspensión celular esté lista para sembrarse.Tras la centrifugación en gradiente de densidad, recolecte cuidadosamente la capa de capa leucocitaria utilizando una pipeta estéril de transferencia de plástico y evite transferir el medio de gradiente de densidad. La recolección de la capa leucocitaria debe producir aproximadamente 20 mililitros de suspensión celular y plasma de cada tubo. Posteriormente, diluya la suspensión de células mononucleares en DPBS en una proporción de uno a uno e invierta para mezclar; luego, centrifugue a temperatura ambiente durante 20 minutos a 300 × g con el freno y el acelerador al máximo. Tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda las células agregando un mililitro de medio de generación BOEC a cada precipitado y pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente. Reúna todas las suspensiones celulares y complete el volumen total hasta 10 mililitros con el medio restante.Para obtener una estimación del número total de células, diluya 10 microlitros de la suspensión celular con 490 microlitros de solución de Turk para lisar los glóbulos rojos. Luego cuente una muestra de 10 microlitros de la suspensión celular diluida utilizando un hemocitómetro. Posteriormente, siembre la suspensión celular en un matraz T 75 recubierto con colágeno.Complete el volumen del medio hasta 15 mililitros por frasco y cultive las células a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida que contenga 5%CO2. Ahora cambie el medio cada dos días añadiendo 15 mililitros de medio fresco de generación BOEC al cultivo; durante los fines de semana, los cambios de medio pueden retrasarse hasta cada tres días.Monitoree el frasco de cultivo de BOEC desde el día siete hasta el 14 para detectar la aparición de colonias de crecimiento periférico. Identifique las colonias como grupos circulares de células que exhiben la morfología clásica de empedrado endotelial. Una vez identificada una colonia o múltiples colonias en el frasco, continúe con los cambios de medio y permita que las colonias crezcan hasta aproximadamente 1000 a 2000 células por colonia.Antes del envasado, determine el número de células por colonia mediante una estimación visual aproximada. Luego, pase las células enjuagando los frascos dos veces con 10 mililitros de DPBS. Añada cinco mililitros de tripsina 1 x EDTA e incube en un incubador a 37 grados Celsius durante cinco minutos.Después de cinco minutos, neutralice la tripsina con 10 mililitros de medio que contenga suero bovino fetal (FBS) y suspenda las células mediante pipeteo repetido. A continuación, centrifugue la suspensión a 300 × g durante cinco minutos. Re suspenda las células en 15 mililitros de medio fresco de generación de BOEC y siembre toda la suspensión celular en un nuevo frasco T75 sin recubrimiento de colágeno. Continúe.Cambios de medio hasta que las células alcancen confluencia y pase. Las células, tal como se describió previamente, para el mantenimiento continuo de la placa de empaquetamiento. No menos de 750.000 células por matraz T75, ya que densidades celulares bajas pueden hacer que las BO eecs dejen de proliferar.En este procedimiento, la tripsina actúa sobre las células y se centrifugan a 300 × g durante cinco minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y re suspenda las células en 10 mililitros de medio. Tome una muestra de 10 microlitros de la suspensión celular y realice un recuento manual de células.A continuación, centrifugue la muestra nuevamente y resuspenda en medio de criopreservación frío con hielo a una concentración de dos por diez a la seis células por mililitro. Añada 0,5 mililitros de suspensión celular a cada vial y coloque los viales en un recipiente de criopreservación con isopropanol frío con hielo. Luego, coloque el recipiente en un congelador a menos 80 grados Celsius durante al menos dos horas antes de transferirlo a nitrógeno líquido.Para descongelar las células, agregue 10 mililitros de medio precalentado a un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros. Retire las células del nitrógeno líquido y descongele en un baño de agua a 37 grados Celsius con agitación suave hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo en el vial. Luego, agregue el contenido del vial gota a gota al tubo cónico de centrífuga y centrifugue a 300 veces G durante cinco minutos.A continuación, aspire el sobrenadante y resuspenda el botón celular. Añada la suspensión celular al frasco T 75 y complete el medio hasta 15 mililitros. En esta imagen, las colonias de crecimiento, que aparecen como agrupaciones de células similares a las endoteliales, se disponen en una monocapa tipo adoquín y proliferan radialmente desde un punto central. Alrededor de las colonias de crecimiento se encuentran las células monocíticas adherentes que constituyen la gran mayoría de las células en los cultivos iniciales. Tras el aislamiento, las BOEC altamente proliferativas predominan en el cultivo, mientras que las células monocíticas no proliferativas mueren o no logran volver a adherirse.Aquí se muestra una imagen representativa de inmunofluorescencia de Bo Oecs inmunomarcados con un anticuerpo contra el marcador de superficie de células endoteliales CD144. Y en esta imagen, los Bo Oecs fueron inmunomarcados con un anticuerpo contra la glucoproteína sanguínea factor de von Willebrand. Una vez dominada, esta técnica podría realizarse en menos de dos horas si se lleva a cabo adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar procesar las muestras de sangre lo más pronto posible y preferiblemente dentro de las dos horas posteriores a la recolección. Tras seguir este procedimiento, las células pueden utilizarse para estudiar la función de las células endoteliales en condiciones de salud y enfermedad, o reprogramarse en células madre pluripotentes inducidas para su uso en estudios de diferenciación, modelado de enfermedades o terapia celular tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para estudiar el impacto de las mutaciones en el receptor tipo dos de la proteína morfogenética ósea sobre la patogénesis de la hipertensión arterial pulmonar, tanto en células endoteliales de crecimiento sanguíneo del paciente como en células musculares lisas derivadas de iPSC.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar y caracterizar células endoteliales de crecimiento sanguíneo estables a partir de un pequeño volumen de sangre periférica. No olvide que trabajar con sangre humana sin cribar puede ser extremadamente peligroso y que siempre se debe usar equipo de protección personal, incluyendo guantes y una bata de laboratorio, al realizar este procedimiento.

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Investigación

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