Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana

El objetivo general de este protocolo es generar de forma fiable células endoteliales de crecimiento sanguíneo a partir de sangre periférica humana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vascular, como cómo la disfunción de las células endoteliales contribuye a las enfermedades cardiovasculares, incluida la hipertensión arterial pulmonar o la enfermedad de von Willebrand. La principal ventaja de esta técnica es que genera consistentemente una población estable de células endoteliales de crecimiento sanguíneo a partir de un pequeño volumen de sangre periférica adulta.

Para iniciar este procedimiento. Para cada donante, agregue tres mililitros de citrato de sodio a cada uno de los dos tubos de centrífuga cónicos de 50 mililitros. Luego agregue 30 mililitros de la sangre recolectada a cada tubo.

Invierta suavemente los tubos dos o tres veces para mezclar. A continuación, diluya 60 mililitros de sangre con DPBS en una proporción de uno a uno e incline el tubo que contiene el gradiente de densidad. Medio de centrifugación en un ángulo de 20 grados con la superficie de trabajo utilizando una pipeta auxiliar y una pipeta serológica de 25 mililitros.

Coloque lentamente 21 mililitros de sangre diluida sobre el medio. A continuación, centrifugar las muestras a 400 veces G durante 35 minutos a temperatura ambiente con el acelerador y la rotura Durante la centrifugación, repare una solución de colágeno a 50 microgramos por mililitro diluyendo el caldo. Colágeno tipo uno en 10 mililitros de ácido acético 0,02 molar estéril.

Filtre la suspensión de colágeno antes de usar. A continuación, agregue 7,5 mililitros de solución de colágeno a un matraz de cultivo celular T 75. Deje que el matraz se cubra durante una hora a temperatura ambiente.

Después de una hora de recubrimiento, aspire la solución de colágeno y pipetee 10 mililitros de DPBS en el matraz para lavar el ácido acético residual. Aspire el DPBS y repita el lavado una vez más. A continuación, añada cinco mililitros de medio de generación de BOEC al matraz para evitar que el recubrimiento de colágeno se seque hasta que la suspensión celular esté lista para el recubrimiento.

Después de la centrifugación con gradiente de densidad, recoja cuidadosamente la capa de capa leucocitaria con una pipeta de transferencia de plástico estéril y evite transferir el medio de gradiente de densidad. La recolección de buffy coat debe producir aproximadamente 20 mililitros de suspensión de celuloide y plasma de cada tubo. Luego, diluya la suspensión de la celda mononuclear en DPBS en una proporción de uno a uno e invierta para mezclar, luego centrifugue a temperatura ambiente durante 20 minutos a 300 veces G con el freno y el acelerador configurados al máximo después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las celdas agregando un mililitro de medio de generación BOEC a cada pellet y pipeteando hacia arriba y hacia abajo repetidamente junte todas las suspensiones de celdas y rellene el volumen total a 10 mililitros con el medio restante.

Para obtener una estimación del número total de células, diluya 10 microlitros de la suspensión celular con 490 microlitros de solución de turco para los glóbulos rojos. A continuación, cuente una muestra de 10 microlitros de la suspensión celular diluida utilizando un hemocímetro. Posteriormente, coloque la suspensión celular en un solo matraz T 75 recubierto de colágeno.

Rellene el volumen medio hasta 15 mililitros por matraz y cultivo. Las celdas a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2. Ahora se cambia el medio cada dos días añadiendo 15 mililitros de BOEC fresco de generación, medio al cultivo para los fines de semana, los cambios de medio se pueden retrasar a cada tres días.

Monitoree el matraz de cultivo BOEC en los días siete a 14 para detectar la aparición de colonias de excrecencia. Identificar las colonias como grupos circulares de células que exhiben la morfología endotelial clásica de adoquín. Una vez que se identifica una colonia o varias colonias en el matraz, continúe con cambios medios y permita que las colonias crezcan hasta aproximadamente 1000 a 2000 células por colonia.

Antes de empaquetar, determine el número de células por colonia a través de una estimación visual aproximada. A continuación, pase las celdas enjuagando los matraces dos veces con 10 mililitros de DPBS. Añadir cinco mililitros de un x tripin EDTA e incubar en una incubadora a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Después de cinco minutos, neutralice la tripsina con 10 mililitros de medio que contenga FBS y ponga las células en suspensión con pipeteo repetido. A continuación, centrifugar la suspensión a 300 veces G durante cinco minutos. Vuelva a suspender las células en 15 mililitros de BOEC fresco de generación, medio, y coloque toda la suspensión celular en un nuevo matraz T 75 sin recubrimiento de colágeno. Continuar.

El medio cambia hasta que las células son confluentes y pasan. Las celdas como se describió anteriormente para la placa de embalaje continua. No menos de 750.000 células por matraz T 75, ya que las bajas densidades de células pueden hacer que los BO eecs dejen de proliferar.

En este procedimiento, la tripsina examina las células y las centrifuga a 300 veces G durante cinco minutos. Después de eso, aspire el snat y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio. Recoja una muestra de 10 microlitros de la suspensión celular y realice un recuento celular manual.

A continuación, vuelva a centrifugar la muestra y vuelva a suspenderla en un medio de criopreservación helado a dos veces 10 por las seis células por mililitro. Agregue 0,5 mililitros de suspensión celular a cada vial y coloque los viales en un recipiente de criopreservación de isopropanol helado. Luego, coloque el recipiente en un congelador a 80 grados centígrados negativos durante al menos dos horas antes de transferirlo a nitrógeno líquido.

Para descongelar las celdas, agregue 10 mililitros de medio precalentado a un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros. Retire las células del nitrógeno líquido y descongele en un baño de agua a 37 grados centígrados con agitación suave hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo en el vial. A continuación, añada el contenido del vial gota a gota al tubo de centrífuga cónico y gire a 300 veces G durante cinco minutos.

Posteriormente, aspirar el sobrenadante y resus suspender el pellet de la célula. Agregue la suspensión de celdas al matraz T 75 y rellene el medio a 15 mililitros. En esta imagen, las colonias de excrecencia, que aparecen como colecciones de células endoteliales, están dispuestas en una monocapa de adoquín y proliferan radialmente desde un punto central que rodea las colonias de excrecencia. Las colonias de excrecencia son las células monocíticas adherentes que constituyen la gran mayoría de las células en los cultivos tempranos. Después del empaquetado, las oeco altamente proliferativas se hacen cargo del cultivo a medida que las células monocíticas no proliferativas mueren o no logran volver a unirse.

Esta es una imagen representativa de inmunofluorescencia de inmunos Bo Oecs teñidos con un anticuerpo contra el marcador de superficie de células endoteliales CD 1 44. Y en esta imagen, las oecs B estaban inmunoteñidas con un anticuerpo contra la glicoproteína sanguínea del factor von Willebrand. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de dos horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que procese las muestras de sangre lo antes posible y preferiblemente dentro de las dos horas posteriores a la recolección. Siguiendo este procedimiento, las células se pueden usar para estudiar la función de las células endoteliales en la salud y la enfermedad o reprogramadas en células madre potentes inducidas para su uso en estudios de diferenciación, modelado de enfermedades o terapia celular después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para estudiar el impacto de las mutaciones en el receptor de la proteína morfogenética ósea tipo dos en la patogénesis de la hipertensión arterial pulmonar tanto en las células endoteliales de crecimiento sanguíneo del paciente como en las células musculares del estado de ánimo derivadas de IPSC.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar y caracterizar células endoteliales de crecimiento sanguíneo estable a partir de un pequeño volumen de sangre periférica. No olvide que trabajar con sangre humana no analizada puede ser extremadamente peligroso y siempre se debe usar equipo de protección personal, incluidos guantes y una bata de laboratorio, mientras se realiza este procedimiento.