Aislamiento y composicional Análisis de Planta cutícula lípidos poliéster Monómeros

Las plantas vasculares dependen de capas extracelulares que funcionan como barreras impermeables entre los tejidos vegetales y el entorno externo. Estas estructuras asociadas a células lipofílicas restringen la infección por patógenos y regulan el transporte pasivo de gases, agua y sustancias disueltas hacia el interior y el exterior de los tejidos vegetales. Una barrera importante es la cutícula vegetal, una estructura compleja exclusiva de las plantas.

La cutina es un poliéster de glicerol lipídico insoluble que constituye la matriz estructural de la cutícula y está asociada con ceras extraíbles con disolvente. Aquí presentamos una técnica confiable para analizar la composición de poliésteres lipídicos y retener tejidos vegetales libres de lípidos. En este protocolo, se recolectan muestras completas de tejido, se homogenizan y se someten exhaustivamente a una serie de extracciones con disolventes para eliminar los lípidos solubles en disolvente, incluyendo ceras cuticulares y epicuticulares.

Triglicérido en lípidos de membrana. Luego, las muestras se despolimerizan en sus monómeros lipídicos componentes mediante lisis metílica catalizada por metóxido de sodio. Se añaden reactivos de simulación para transmetilar los grupos hidroxilo en sus derivados correspondientes de trimetilsililo, adecuados para el análisis por cromatografía de gases.

Los residuos derivatizados se transfieren luego a viales de GC y se cargan en A-G-C-M-S para su análisis, generando un cromatograma que caracteriza la composición monomérica de los biopoliésteres presentes en las muestras extraídas. En este trabajo, cosechamos muestras completas de hojas de plantas de Arabidopsis ANA de tipo silvestre y de dos mutantes maduros.

Para la extracción y el análisis, agregue 0.5 gramos de tejido a tubos de vidrio limpios que previamente se hayan enjuagado con cloroformo. Coloque 100 mililitros de isopropanol en un matraz y añada butilhidroxitolueno hasta alcanzar una concentración del 0.01%. El BHT es un antioxidante que se agrega para proteger los dobles enlaces y los ácidos grasos de la oxidación durante las extracciones con solvente. Precaliente el solvente en un baño de agua a aproximadamente 85 grados.

Añada 25 mililitros de isopropanol calentado por gramo de tejido vegetal e incube las muestras en el bloque térmico a 85 grados durante 15 minutos. Deje que los tubos se enfríen hasta la temperatura ambiente con protección auditiva y ocular. Finalmente, triture las muestras con un homogenizador para obtener una dispersión homogénea, selle los tubos con tapas roscadas y agite a 100 RPM durante uno o dos minutos; luego, centrifugue las muestras a 800 G durante 10 minutos.

Para separar la fase orgánica de los materiales de mayor densidad compactados en el precipitado, retire y deseche el sobrenadante utilizando un pipeta de Pasteur o propent. Tenga cuidado de no perturbar el precipitado. Añada un volumen igual de isopropanol a temperatura ambiente y agite las muestras durante la noche.

Centrifugar las muestras a 100 RPM y desechar el sobrenadante. Añadir 25 mililitros de una solución de cloroformo-metanol en proporción dos a uno por gramo de tejido, y agitar las muestras durante la noche. Centrifugar y desechar la fase orgánica. A continuación, repetir este proceso utilizando una solución de cloroformo-metanol en proporción uno a dos.

Seque el precipitado durante la noche y transfiera los tubos de la campana extractora a un desecador al vacío que contenga sulfato de calcio anhidro para deshidratar las muestras durante un período de al menos tres días o hasta que se alcance una masa constante. Una vez que las muestras estén completamente secas, estarán listas para la defloración mediante metálisis catalizada por metóxido de sodio. Añada dos soluciones de estándares internos a los tubos que contengan tejidos secos utilizando una jeringa de vidrio, comenzando con 25 microlitros de decanoato de metilo HETO y 25 microlitros de pentadecanolactona omega.

Para iniciar la polimerización profunda, agregue 0,9 mililitros de acetato de metilo a las muestras, seguidos de 1,5 mililitros de catalizador de metóxido de sodio y 3,6 mililitros de metanol. Incube las muestras a 60 grados durante dos horas con vortexado periódico dentro del sistema de reacción; los poliésteres lipídicos reaccionan con aniones metóxido nucleófilos para formar intermediarios tetraédricos inestables, que se disocian fácilmente en ácidos grasos, ésteres metílicos y aniones óxido. Estos óxidos son bases conjugadas y reaccionan con metanol, regenerando los aniones metóxido catalíticamente activos, sosteniendo así reacciones adicionales de polimerización profunda.

Si hay agua presente en el sistema, reaccionará con el metóxido de sodio para formar hidróxido de sodio. Una base fuerte que convierte irreversiblemente los poliésteres en ácidos grasos libres indeseables. En lugar de grasas, para prevenir la hidrólisis se añade acetato de metilo para eliminar cualquier hidróxido de sodio presente en el sistema.

Deje que los tubos se enfríen hasta la temperatura ambiente. Después de la incubación, extraiga los monómeros añadiendo 10 mililitros de diclorometano a cada tubo. Luego agregue 1,5 mililitros de ácido acético glacial para acidificar las muestras.

Llene los tubos con solución de cloruro de sodio 0.5 molar, vortexee completamente y centrifugue durante minutos. Bajo la campana extractora. Transfiera cuidadosamente la fase orgánica inferior mediante pipeta a tubos medianos limpios y previamente enjuagados.

Lave las muestras nuevamente con solución salina, agite en vórtex y centrifugue durante 10 minutos. Retire la fase acuosa superior, luego agregue sulfato de sodio anhidro a las muestras como agente desecante para eliminar los rastros de agua que quedan en la solución; agite las muestras en vórtex, centrifugue y transfiera el disolvente a tubos pequeños limpios y previamente enjuagados. Coloque los tubos en un evaporador de nitrógeno para evaporar el disolvente y obtener residuos secos de monómeros. Mediante una jeringa de vidrio, añada 100 microlitros de purina y 100 microlitros de B-S-T-F-A para convertir los grupos hidroxilo en derivados volátiles de trimetilcilo.

Incubar las muestras a 100 grados durante 10 minutos. Dejar que los tubos se enfríen y evaporar bajo gas nitrógeno. Añadir 500 microlitros de una solución de HEPTANO y tolueno en proporción uno a uno para disolver los residuos, que luego se centrifugan brevemente.

Transfiera las muestras derivatizadas a viales de GC que contengan insertos de 400 microlitros. Cierre los viales, cargue las muestras en un cromatógrafo de gases, que las inyecta en una columna capilar para su análisis; los eluidos se detectan entonces mediante un espectrómetro de masas cuádruplo. Los datos brutos obtenidos mediante el análisis por GC-MS se procesan y presentan como un cromatograma para cada muestra.

Los monómeros individuales correspondientes a diferentes picos cromatográficos se identifican por sus espectros de masas específicos. En los tiempos de retención de CG, las cantidades de monómeros individuales se determinan mediante el método del estándar interno de cuantificación, lo que permite realizar comparaciones de abundancia y composición de monómeros entre muestras. Aquí se muestran cromatogramas superpuestos de análisis representativos de monómeros liberados de un tejido foliar de absceso de conejo, correspondientes al tipo silvestre y a dos alelos mutantes de un gen que codifica una enzima mono oxigenasa P cuatro 50, que muestran perfiles monoméricos distintos.

Nuestros resultados demuestran diferencias significativas, la abundancia de tres monómeros principales de cutina, y plantas silvestres y mutantes de Arabidopsis. Este protocolo es un método robusto para analizar la composición de poliésteres lipídicos vegetales mediante el aislamiento, identificación y cuantificación de sus monómeros constituyentes. El procedimiento es escalable y puede adaptarse fácilmente para procesar grandes cantidades de diversos materiales vegetales, incluyendo raíces, semillas, hojas y otros tejidos completos.

Esta técnica es aplicable a estudios que investigan la regulación de la biosíntesis y la distribución de la cutina y la suberina en plantas superiores.