Aislamiento y composicional Análisis de Planta cutícula lípidos poliéster Monómeros

Las plantas vasculares dependen de capas extracelulares que funcionan como barreras impermeables entre los tejidos vegetales y el entorno externo. Estas células lipofílicas, aunque son estructuras asociadas, restringen la infección patógena y regulan el transporte pasivo de gases, agua y sustancias disueltas dentro y fuera de los tejidos vegetales. Una barrera importante es la cutícula de la planta, una estructura compleja exclusiva de las plantas.

La cutina es un poliéster lipídico glicerol insoluble que constituye la matriz estructural de la cutícula y se asocia a ceras extraíbles con disolventes. Aquí presentamos una técnica confiable para analizar la composición de poliésteres lipídicos y retener tejidos vegetales lipídicos. En este protocolo, se recolectan muestras de tejido entero, se homogeneizan y, de manera exhaustiva, se dilapizan mediante una serie de extracciones con solventes para eliminar los lípidos solubles en solventes, incluidas las ceras cuticulares y epi particulares.

Triglicerol en lípidos de membrana. A continuación, las muestras se despolimerizan en los monómeros lipídicos que las componen mediante metilolisis catalizada por óxido de metanfetamina de sodio. Los reactivos de simulación se añaden a los grupos hidroxilo transmetilato en sus correspondientes derivados de células de trimetilo adecuados para el análisis por cromatografía de gases.

A continuación, los residuos derivados se transfieren a los viales de GC y se cargan en A-G-C-M-S para su análisis, generando un cromatograma que caracteriza la composición monomérica de los biopoliésteres. Presente en las muestras extraídas. Aquí recolectamos muestras de hojas enteras de tipo silvestre y dos mutantes de plantas maduras de arabidopsis ANA.

Para la extracción y el análisis, agregue 0,5 gramos de tejido a los tubos de vidrio limpios que se enjuagaron previamente con cloroformo. Coloque 100 mililitros de isopropanol en un matraz y agregue hidroxitolueno butilado a una concentración del 0.01%El BHT es un antioxidante agregado para proteger los dobles enlaces y los ácidos grasos de la oxidación durante las extracciones con solventes. Precaliente el disolvente en un baño de agua a aproximadamente 85 grados.

Agregue 25 mililitros de isopropanol calentado por gramo de tejido vegetal e incube las muestras en el LOC caliente a 85 grados durante 15 minutos. Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente y con protección para los oídos y los ojos. Finalmente, moler las muestras con un homogeneizador para lograr una dispersión homogénea, sellar los tubos con tapones de rosca y agitar a 100 RPM para una o dos muestras de centrífuga a 800 G durante 10 minutos.

Para separar la fase orgánica de los materiales de mayor densidad compactados en el pellet, retire y deseche el sobrenadante con un Pasteur o próctero. Tenga cuidado de evitar perturbar el pellet. Agregue un volumen igual de isopropanol a temperatura ambiente y agite las muestras durante la noche.

A 100 RPM, centrifugar las muestras y desechar el sobrenadante. Agrego 25 mililitros de una solución dos a uno de cloroformo, metanol, pergrama de tejido, y agito las muestras durante la noche en centrífuga y desecho la fase orgánica. Luego repita este proceso usando una o dos soluciones de metanol de cloroformo.

Seque el pellet durante la noche y transfiera los tubos de la campana extractora a un desecado al vacío que contenga sulfato de calcio anhidro para deshidratar las muestras durante un período de al menos tres días o hasta que se logre una masa constante. Una vez que están completamente secas, las muestras están listas para la desfloración por metálisis catalizada por óxido de metanfetamina de sodio. Agregue dos soluciones de patrones internos a los tubos que contienen tejidos secos usando una jeringa de vidrio, comenzando con 25 microlitros de decanoato de metilo HETO y 25 microlitros de omega pentec y lactona.

Para iniciar la polimerización profunda, agregue 0,9 mililitros de acetato de metilo a las muestras, seguido de 1,5 mililitros de catalizador de óxido de metanfetamina de sodio y 3,6 mililitros de metanol. Incubar muestras a 60 grados durante dos horas con vórtice periódico dentro del sistema de reacción, los poliésteres lipídicos reaccionan con aniones nucleofílicos de óxido de metanfetamina para formar intermedios tetraédricos inestables, que se disocian fácilmente en ácido graso, ésteres metílicos y aniones de óxido. Estos óxidos a son bases conjugadas y reaccionan con el metanol regenerando los aniones IDE metanfetamina cataláricamente activos, manteniendo así reacciones de polimerización profundas adicionales.

Si el agua está presente en el sistema, reaccionará con el óxido de metanfetamina de sodio para formar hidróxido de sodio. Una base fuerte que convierte irreversiblemente los poliésteres en ácidos grasos libres indeseables. En lugar de fas para evitar la hidrólisis, se agrega acetato de metilo para eliminar cualquier hidróxido de sodio dentro del sistema.

Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente. Después de la incubación, extraiga los monómeros agregando 10 mililitros de dicloruro de metileno a cada tubo. A continuación, añada 1,5 mililitros de ácido glacial para acidificar las muestras.

Llene los tubos con una solución de cloruro de sodio 0,5 molar, haga un vórtice a fondo y centrifugue durante minutos. Debajo de la campana extractora. Transfiera con cuidado la fase orgánica inferior por pipeta a tubos limpios y preenjuagados de tamaño mediano.

Lavar las muestras nuevamente con solución salina en vórtice y centrifugar durante 10 minutos. Retire la fase acuosa superior, luego agregue sulfato de sodio anhidro a las muestras como agente de secado para eliminar las trazas de agua que quedan en la centrífuga de muestras de vórtice de solución y transfiera el solvente a tubos de tamaño pequeño limpios y preenjuagados, cargue los tubos en un evaporador de nitrógeno para evaporar el solvente y obtener residuos secos de monómeros. Con una jeringa de vidrio, agregue 100 microlitros de purina y 100 microlitros de B-S-T-F-A para convertir los grupos hidroxilo en derivados volátiles de células trimetilo.

Incubar las muestras a 100 grados durante 10 minutos. Deje que los tubos se enfríen y se evaporen bajo el gas nitrógeno. Agregue 500 microlitros de una solución de tolueno HEPTANE uno a uno a los residuos de disolución roja, que luego se centrifugan brevemente.

Transfiera las muestras derivadas a viales de GC que contengan 400 insertos de microlitros. Encierre los viales de carga muestras en un cromatógrafo de gases, que las inyecta en una columna capilar para su análisis, luego se detectan mediante un espectrómetro de masas cuádruple. Los datos brutos adquiridos por el análisis GCMS se procesan y se presentan como un cromatograma para cada muestra.

Los monómeros individuales correspondientes a diferentes picos cromatográficos se identifican por sus espectros de masas específicos. En los tiempos de retención de GC, las cantidades de monómeros individuales se determinan utilizando el método estándar interno de cuantificación, lo que permite realizar comparaciones de la abundancia y composición de monómeros entre muestras. Aquí se muestran cromatogramas superpuestos de análisis representativos de monómeros, liberados de un tejido foliar de absceso de conejo correspondiente al tipo salvaje y dos alelos mutantes de un gen que codifica una enzima P 4 50 monooxigenasa que muestra perfiles monoméricos distintos.

Nuestros resultados demuestran diferencias significativas, la abundancia de tres principales plantas de cutina, monómeros, y arabidopsis de tipo silvestre y mutante. Este protocolo es un método robusto para analizar la composición de poliésteres lipídicos vegetales mediante el aislamiento, la identificación y la cuantificación de sus monómeros constituyentes. El procedimiento es escalable y se puede adaptar fácilmente para procesar cantidades a granel de diversos materiales vegetales, incluidas raíces, semillas, hojas y otros tejidos enteros.

Esta técnica es aplicable a estudios que investigan la biosíntesis, regulación y distribución de cutina y suberina en plantas superiores.