Name: De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en Drosophila melanogaster Uso de la Flywalk Paradigma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Aprende a cuantificar el comportamiento guiado por olor en Drosophila melanogaster usando el sistema Flywalk. Este bioensayo automatizado permite estudiar la olfacción de insectos con alta resolución temporal.

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Damos las gracias a Daniel Veit para la asistencia técnica y Pedro Gouveia en Electricidade Em Po (electricidadeempo.net) para personalizar el software de seguimiento de nuestras demandas. También agradecemos a Tom Retzke de apoyo durante el proceso de filmación. Este estudio fue apoyado por la Sociedad Max Planck.

Los detalles constructivos y técnicos de Flywalk se han descrito en otra parte 26 (en caso de cualquier problema de establecer esta configuración, más información se puede solicitar desde MK). Aquí nos centramos en las instrucciones detalladas sobre el manejo del paradigma que le ayudará a obtener resultados fiables. 1. Fly Manipulación <ol><li> Posterior vuela en bajo a las culturas media densidad en medio alimenticio 27 en virtud de un 12 h luz: 12 h: régimen de oscuridad a 23-25 ​​° C y una humedad relativa del 70%. Con este fin, permitir 20-30 adultos recién surgido vuela de reproducir en un gran frasco de comida durante 1 semana, luego descarta moscas adultas y esperar a surgir descendencia. </li><li> Recoger 30-40 recién emergidas (edad &lt;24 h) las moscas adultas y les envejecer en en nuevo un vial que contiene medio de los alimentos 27 durante 3-5 días. </li><li> Veinticuatro horas antes del inicio del experimento de comportamiento: Transferir todo el 30-40 recogido previamente 3-5 d de edad (ver 2.2) vuela a una nueva vial que contiene un tapón de espuma de caucho húmedo o un pañuelo de papel humedecido utilizando un aspirador. NOTA: No anestesiar las moscas utilizando CO 2. </li></ol> 2. Preparación de la instalación de Flywalk <ol><li> Use 250 ml botellas como humidificadores. Llenar humidificadores con 100 ml de agua destilada. </li><li> Preparar viales de olor. <ol><li> Preparar 500 l 10 -3 diluciones del acetato de etilo olores puros, butirato de etilo, acetato de isopentilo y 2,3-butanodiona en el aceite mineral disolvente. </li><li> Adjuntar dos válvulas de retención de bola por el olor vial. El registro de entrada válvulas permiten únicamente el flujo de aire unidireccional. Por lo tanto, conectar válvulas de retención de tal manera que el aire pueda entrar en el vial en un lado y dejarlo en el otro lado. </li><li> Retirar la tapa de un tubo de reacción de PCR 200 l. Pipetear 100 l de cada dilución de olor en un tubo de reacción separado y colocar los tubos en viales de olores distintos. También preparará un olor vial que contiene sólo el oi mineral disolventel. </li><li> Sellar herméticamente los viales de olor por cerrarlos utilizando tapones de acero inoxidable y juntas de goma. </li><li> Conectar los 5 viales de olor (4 olores que contienen 1 y que contienen aceite mineral) al sistema de suministro de olor. Asegúrese de conectar en la dirección de flujo de la derecha. Una conexión incorrecta no sólo pondrá en peligro el experimento planeado, pero también puede contaminar el sistema de entrega. </li></ol></li><li> Compruebe si hay fugas mediante el sellado de la salida de la cámara de mezcla del dispositivo de estímulo. Asegúrese de que todas las corrientes de aire antes de que el dispositivo de estímulo ahora caen progresivamente a cero. Si no es así, compruebe si hay fugas que ahora se pueden identificar por el silbido de aire que sale del sistema. </li><li> Transferir cuidadosamente 15 moscas individuales a 15 tubos de vidrio individuales utilizando un aspirador y tubos de vidrio cercanos en ambos lados utilizando los adaptadores correspondientes. Nota: Debido a que el sistema debe estar herméticamente sellado para experimentos exitosos, asegúrese de que los adaptadores encajan tubos de vidrio herméticamentey tenga en cuenta que los tubos de vidrio pueden romperse durante este paso. Tenga cuidado para evitar lesiones por el uso de guantes y gafas de protección. </li><li> Conecte los tubos de vidrio a la configuración Flywalk y, a partir de ahora, esperar por lo menos 15 minutos antes de comenzar el experimento para permitir que las moscas que se habitúan al nuevo entorno. </li><li> Después de colocar tubos de vidrio: compruebe la lectura de los medidores de flujo aguas abajo digitales en el ordenador 1 si los 16 flujos de aire después de que los tubos de vidrio se suman al flujo de aire que entra en el sistema. También puedes ver en el ordenador 1, si la humedad está entre 60% y 80%. </li><li> Diseño de protocolo de estímulo que controla la secuencia y el calendario de los estímulos de olor presentados a las moscas. Para obtener los datos descritos por ejemplo, presentes 4 olores y el control (aceite mineral) individualmente y es posible ternario y las mezclas cuaternarias de los olores de forma simultánea durante 40 veces cada uno. Establecer duración de pulso de 500 ms a un intervalo inter de 90 segundos y de forma aleatoria secuencia de estímulo. </li><li> Encienda la lifuente de lucha (cluster LED; λ = 630). Asegúrese de proporcionar suficiente luz para el seguimiento eficiente sin incrementar la temperatura en el interior de los tubos de vidrio. </li><li> Configurar una región de interés del sistema de seguimiento arrastrando un marco a través del área a monitorizar de una manera tal que se incluyen todos los 15 tubos de vidrio y aproximadamente 5 mm de los bordes de los tubos están excluidos. </li><li> Configurar 14 líneas de separación paralelas entre tubos individuales en el sistema de seguimiento por el cambio de sus Y-posiciones en la secuencia de comandos correspondiente para mantener individuo vuela identificables durante todo el experimento. Asegúrese de situar ellos de tal manera que siempre hay un tubo de vidrio entre dos de tales líneas de separación, ya que sólo una mosca se realizará un seguimiento entre cualquier conjunto de dos líneas. </li><li> Asegúrese de establecer parámetros de la cámara de tal manera que las moscas se realiza un seguimiento de forma fiable a través de los tubos de vidrio. Si moscas se pierden en los bordes de la región de interés, aumentar el brillo o la ganancia de la s de seguimientooftware. Evitar las vibraciones mecánicas del sistema de seguimiento. Seguir utilizando software comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Comience experimento iniciando el protocolo de estímulo. Grabar flies&#39; XY coordenadas a 20 fps (fotogramas por segundo) e ingrese combinación con el estado de la válvula olor en archivos de texto. </li></ol> Análisis 3. Datos NOTA: Los siguientes pasos en el análisis de datos están automatizados utilizando rutinas personalizadas-escrita programadas en R. Debido a que estos pasos son cruciales para obtener resultados significativos del análisis obstante, se presenta de una manera paso a paso. Los datos en bruto para el análisis son .csv archivos que contienen información sobre el estado de la válvula sincronizada olor, número de impulsos en el experimento y 15 de la mosca x posiciones en cm sobre un eje de tiempo común para el ciclo de estimulación de un olor. El código personalizado para el análisis de los datos se puede proporcionar a petición. <ol><li> Abrir .csv-file, encontrar tiempo-punto de apertura de la válvula significada por un chaENS en la columna que representa el estado de la válvula. </li><li> Calcular la función lineal de la posición olor de la forma f (t) = s * t + i donde t es el tiempo en el ciclo de estimulación, s es la velocidad del viento (aquí 20 cm / seg) y el intercepto i se puede calcular utilizando el punto de tiempo el olor entra en los tubos en la posición 0 (apertura de la válvula, más retraso). </li><li> Encuentra el punto de tiempo en el que el olor y vuela posición x se cruzan por cada mosca y establecer este punto de tiempo a 0. Nota: De esta manera las posiciones de moscas están alineados con cada uno del individuo encuentro con el olor. </li><li> Excluir moscas sentadas en los bordes de la región de interés. </li><li> Calcula la velocidad de X-posiciones dividiendo el desplazamiento a lo largo del eje x por el intervalo de tiempo (100 ms) y repetir el procedimiento para cada ciclo de estimulación. </li><li> Para obtener cursos temporales de velocidad, como se muestra en la Figura 2E calcular media-transcurso de tiempo de velocidad para cada mosca y olor y de los que el curso temporal media para un olor determinado. </li><li> Para obtener desplazamiento neto como se muestra en la Figura 3C calcular el desplazamiento neto dentro de 4 seg después del pulso de olor para cada evento de seguimiento y después el desplazamiento neto medio por mosca y el olor. </li></ol> 4. Procedimiento de limpieza <ol><li> Limpia Tubos de cristal <ol><li> Retire las moscas y los adaptadores de tubos de vidrio y disfrutar de tubos de vidrio en detergente. </li><li> Enjuagar los tubos de cristal bajo el chorro de agua destilada y secarlos usando aire a presión. </li><li> Tubos de vidrio térmico a 200 ° C durante 8 horas. </li></ol></li><li> Limpie Olor Sistema de Entrega <ol><li> Retire todos los viales de olor y tubo de la cámara de mezcla central. </li><li> Eliminar los adaptadores de tubo de la cámara de mezcla. </li><li> Cámara de mezcla limpia por lavado con solución de limpieza de laboratorio y disolventes (por ejemplo, etanol, acetona). Realice estos pasos bajo la campana de laboratorio. </li><li> Cámara de mezcla en seco utilizando aire a presión y se calienta a 200 ° C durante 8 horas. </li></ol></li><li> Limpie olor Viales y Válvulas <ol><li> Retire el tapón de acero (junta de goma de descarte) y válvulas de retención de viales de olor y disfrutar todos los componentes de la solución de limpieza de laboratorio. </li><li> Componentes sonicado en un baño de ultrasonidos y enjuague con agua destilada. </li><li> Limpie todos los componentes excepto válvulas de retención con etanol y acetona. Realice estos pasos bajo la campana de laboratorio. </li><li> Componentes secos utilizando aire a presión y les calientan a 200 ° C durante 8 horas. </li><li> Limpie las válvulas de retención en el interior por el lavado con etanol y acetona usando una jeringa (considerar la dirección del flujo). Realice estos pasos bajo la campana de laboratorio usando gafas de laboratorio. Debido a la acetona ataca a las piezas de goma, inmediatamente las válvulas de retención en seco mediante el lavado con aire a presión. </li><li> Quite los olores residuales mediante un pulso de aire a través de las válvulas de retención durante varios días. Utilice una incubadora a 60 ° C y un aire de 1 segundo encendido / 1 segundo aire de régimen para esta etapa de limpieza. </li></ol&gt; </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aunque el sistema Flywalk parece bastante sofisticada a primera vista, una vez puesto en marcha, es fácil de usar y produce resultados muy robustos. Para destacar la consistencia de los resultados obtenidos con el bioensayo se puede decir que los resultados representativos se muestran aquí se obtuvieron casi 2 años después de algunos de los resultados que se muestran en un estudio previo 29 con una configuración modificada usando un nuevo software de seguimiento y de la fuente de luz. Sin embargo, las respues...

El objetivo primordial de cualquier investigación neuroethological es establecer una relación de causalidad entre los estados de actividad de neuronas individuales o circuitos neuronales y el comportamiento de un organismo. Para lograr este objetivo la actividad neuronal y el comportamiento debe ser monitoreado en condiciones de estímulo idénticas y estas condiciones de estímulo debería idealmente ser similares a los del sistema nervioso bajo escrutinio evolucionado para darle sentido. Particularmente cuando se trata de bioensayos de comportamiento, estos requisitos históricamente han demostrado ser muy exigente en Drosophila melanogaster neuroetología olfativo. Una vez liberado de la fuente, plumas olor rompen rápidamente en filamentos delgados con difusión turbulenta provocada por el movimiento del aire es el principal determinante de la distribución de olor 1. Como resultado, un insecto navegando hacia una fuente de olor experimenta estimulación intermitente con paquetes de olor intercalados con intervalos variables de aire limpio. Ambas cosascaminar y los insectos voladores - incluyendo Drosophila - se han demostrado para explotar este régimen estimulación intermitente para la navegación por el aumento en ceñida al encuentro penacho y predominantemente movimiento transversal del viento en la ausencia de olores 2 - 5. Considerando que los procedimientos de estimulación en experimentos fisiológicos imitar en gran medida los de un insecto puede experimentar en su entorno natural o bien proporcionando bocanadas individuales de olores intercalados con períodos prolongados de aire limpio o secuencias de estimulación dinámicos 6 - 11, muchos bioensayos de comportamiento utilizados en Drosophila neuroetología tales como ensayo TRAP , arenas en campo abierto o T-laberinto confían en olor-gradientes de 12 - 15. Sin embargo, debido a los gradientes de olor, por definición, son variables en la concentración dependiendo de la distancia desde la fuente de olor, un comportamiento particular no puede atribuirse a una concentración de olor precisa el uso de estos paradigmas. Además, la pendiente deun gradiente olor depende fundamentalmente de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia odorífera. Un gradiente de un compuesto muy volátil será menos profunda que la creada por un compuesto menos volátil y por lo tanto también más difíciles de rastrear para un organismo basándose en la medición de diferencias de concentración en el espacio como el único medio de navegación 16 - 20, que puede conducir a una interpretación errónea de las preferencias olfativas particularmente en ensayos de elección. Este efecto también es muy perjudicial cuando se investiga el comportamiento hacia mezclas de olores, ya que conduce a diferentes relaciones de componentes de mezcla en cada punto en el espacio, por lo que una vez más se opone a una clara correlación entre la fisiología y el comportamiento. Mientras moscas del vinagre tienden a agregarse en la fermentación de la fruta, que son solitarias en su navegación hacia fuentes de alimento y sitios de oviposición. Sin embargo, en lugar de pruebas de los animales individuales muchos paradigmas conductuales utilizadas en Drosophila neuroethología examinar el comportamiento de olores guiada por cohortes de moscas y la atracción se anotó como la fracción de moscas que eligen el olor más de un estímulo de control. Estos experimentos de cohortes han contribuido en gran medida a la comprensión de neuroetología mosca y muchas de las observaciones formuladas por el uso de ellos podría ser confirmado en experimentos de una sola mosca. Sin embargo, se ha observado que las moscas pueden influir en cada decisión other&#39;s 21 y en casos extremos la evaluación de un olor puede pasar de la indiferencia a la evitación en función de la densidad de población 22. Además, los resultados de este tipo de experimentos proporcionan a menudo sólo el punto final de una secuencia de decisiones de comportamiento en lugar de observar lo que está haciendo la marcha mientras se está haciendo, lo que sería deseable cuando se intenta correlacionar el comportamiento con la actividad neuronal. Estos experimentos de cohortes en vez de baja resolución contrastan con alta resolución de los métodos de una sola mosca tales como arenas de vuelo atados y cintas de correr que permitenpara una observación directa de las respuestas de comportamiento en el momento del estímulo se presenta 20,23,24. Sin embargo, los experimentos de cohortes siguen siendo populares, porque son muy eficientes y proporcionan resultados sólidos, incluso a baja comparativamente tamaños de muestra, porque la variabilidad inter-individual y entre ensayos están parcialmente en promedio debido a la observación de las poblaciones durante períodos prolongados de tiempo. Mientras vuelo atado cinta de correr y probablemente proporcionan el estándar de oro en relación con la presentación del estímulo y la resolución temporal, las arenas utilizadas están diseñados para los animales individuales y por lo tanto es mucho tiempo para obtener el tamaño de muestra necesario para un análisis estadístico. Recientemente se han desarrollado varios otros enfoques que permiten una adquisición eficiente de los datos de comportamiento de alta resolución en combinación con un régimen de estímulo bien definido. Estos incluyen sin supervisión seguimiento 3D de múltiples moscas del vinagre en un túnel de viento en combinación con un modelo 3D preciso del olor penacho 5 </sup&gt;, el seguimiento de múltiples moscas individuales en cámaras elección suministradas con corrientes de aire de ambos lados 25 y el paradigma Flywalk 26. En Flywalk, 15 moscas individuales están situados en pequeños tubos de vidrio y monitoreados continuamente por una cámara aérea en condiciones de luz roja. Los olores se añaden a una corriente de aire continua de 20 cm / seg y se desplazan por los tubos de vidrio a una velocidad constante. La corriente de aire se humidifica pasándolo a través de botellas de 250 ml que contenían agua destilada (humidificadores) antes de entrar en el sistema de suministro de olor. Las posiciones flies&#39; se registran dentro de una región cuadrada de interés (ROI) que abarca la mayor parte de la longitud de los tubos de olor (pero excluyendo los bordes exteriores de los tubos (aproximadamente 5 mm en cada lado), donde las moscas no pueden moverse más hacia arriba o hacia a favor del viento) en la época de presentación de olor (Figura 1 A, B). Fly identidades se mantienen constantes por el sistema de seguimiento de turante el experimento sobre la base de sus Y-posiciones (es decir, sus límites de tubo de vidrio). Olor estimulación se consigue utilizando un dispositivo de estímulo multi-componente que permite la presentación de hasta 8 olores individuales y todas las mezclas posibles de los mismos 26,29 (Figura 1B). El curso de un experimento se controla por un ordenador que regula el sistema de suministro de olor y la recolección de la temperatura y la humedad información (ordenador 1, la Figura 1C). Este equipo también controla un datalogger (iniciar / detener la grabación) en un segundo equipo que rastrea continuamente las posiciones de la mosca a 20 fotogramas por segundo (ordenador 2). Vuela posiciones, estado de la válvula de olor (es decir, el tiempo-punto de apertura de la válvula), el olor de identificación, la temperatura y la humedad alrededor de los ciclos de estimulación olor se registran en el ordenador 2. De esta manera la información sobre el olor y volar posiciones están sincronizados y se exportan como .csv archivos que se pueden procesar más y analizados mediante rutinas de análisis personalizadas escrita. Porquetodo el sistema es controlado por ordenador, ninguna intervención humana es necesaria durante una sesión experimental.

<table><tbody><tr><td>Configuración de Flywalk</td><td>Detalles personalizados</td><td></td><td>disponibles a pedido</td></tr><tr><td>Dispositivo de estímulo</td><td>Detalles personalizados</td><td></td><td>disponibles a pedido</td></tr><tr>Grupo<td>de LED</td><td>Detalles personalizados</td><td></td><td>disponibles a pedido</td></tr><tr><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Logitech, Lausana, Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Computadoras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flywalk Reloaded v1.0 software</td><td>Electricidade Em P&oacute; (electricidadeempo.net)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Labview 11.0</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimento estándar para moscas</td><td>Personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viales estándar para moscas</td><td>Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viales estándar para moscas</td><td>Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aspirador</td><td>personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>odors</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l Tubos de reacción PCR</td><td>Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Alemania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado olor en<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; uso de la<em&gt; flywalk</em&gt; paradigma

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

En su ambiente natural, los insectos como la mosca del vinagre Drosophila melanogaster son bombardeados con una gran cantidad de olores químicamente distintas. Para complicar aún más las cosas, los olores detectados por el sistema nervioso de los insectos no suelen ser compuestos simples, pero las mezclas cuya composición y proporciones de concentración variar. Esto conduce a una cantidad casi infinita de diferentes estímulos olfativos que tienen que ser evaluada por el sistema nervioso. Para entender qué aspectos de un estímulo olor determinan su evaluación por parte de la marcha, por lo que es conveniente examinar de manera eficiente el comportamiento olor guiada hacia muchas sustancias odoríferas y mezclas de olores. Para correlacionar directamente el comportamiento a la actividad neuronal, la conducta debe ser cuantificado en un plazo de tiempo similar y bajo condiciones de estímulo idénticos como en experimentos neurofisiológicos. Sin embargo, muchos bioensayos olfativas que actualmente se utilizan en Drosophila neuroetología son bastante specializado ya sea hacia la eficiencia o hacia la resolución. Flywalk, un sistema de entrega olor y seguimiento automatizado, llena el vacío entre la eficiencia y la resolución. Permite la determinación de exactamente cuando un paquete olor estimula una mosca libremente caminar, y para determinar las del animal reacción de comportamiento dinámico.

Debido a que las moscas pueden distribuir libremente dentro de sus tubos de vidrio entre los pulsos de olor y viaja por el pulso de olor a través de los tubos de vidrio a una velocidad constante moscas encuentran el olor en diferentes momentos dependiendo de su posición x en el momento de la estimulación. Como resultado, los inicios de las trayectorias contra el viento evocadas por un pulso de 500 mseg de una atractiva 10 -3 dilución de acetato de etilo se retrasan en alrededor de 1 seg para las moscas en el ...

El Flywalk automatizado sistema de seguimiento se utiliza para la alta resolución de la cuantificación del comportamiento de olor guiada en Drosophila melanogaster.

De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uso de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

El objetivo general de este bioensayo conductual es investigar el comportamiento guiado por olores en moscas del vinagre. Fly Walk es un sistema de alto rendimiento que rastrea y analiza automáticamente las respuestas conductuales de múltiples moscas individuales frente a estímulos olfativos. Esta nueva técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el área de la olfacción de insectos.Por ejemplo, ¿cuál es el equilibrio hedónico de un olor, o qué significa la adición de otros odorantes para este equilibrio? La principal ventaja de este experimento es que podemos observar el comportamiento guiado por olores con una alta resolución temporal, y utilizamos estímulos olfativos similares a los que los insectos experimentan en la naturaleza o a aquellos que también empleamos en grabaciones electrofisiológicas. En general, las personas que intenten utilizar este método podrían tener dificultades porque, en realidad, requiere un sistema hermético, por lo que es necesario saber por dónde fluye el aire y asegurarse de que no existan fugas en ningún punto por donde el aire pueda escapar del sistema. Para estos experimentos, es importante criar a las moscas en un ciclo luz-oscuridad de 12 a 12 horas, en cultivos de densidad baja a media que contengan un medio alimenticio normal.Mantenga la temperatura ambiente entre 23 y 25 grados Celsius, y la humedad relativa alrededor del 70 % durante la preparación. Utilice frascos de cultivo grandes para obtener 20 a 30 adultos durante una semana y recolecte grupos de 30 a 40 descendientes de sexo mixto para formar una cohorte experimental. Cuando la cohorte tenga entre dos y cuatro días de edad, transfiera a un nuevo frasco que contenga un tapón de espuma húmeda o un papel absorbente húmedo.Deje que las moscas pasen hambre en este frasco durante 24 horas antes de la prueba. Es fundamental que las moscas no sean anestesiadas durante esta transferencia. Para este montaje, botellas de 250 mililitros sirven como humidificadores múltiples.Llene cada frasco con 100 mililitros de agua destilada. A continuación, prepare alícuotas de trabajo de medio mililitro de cada odorante mediante una dilución 1:1000 de los olores puros en aceite mineral. De manera similar, prepare un tubo PCR que contenga solo aceite mineral para utilizarlo como control negativo.Ahora prepare el sistema de entrega de olores para cada odorante en el experimento. Conecte dos válvulas de retención esféricas a cada vial de olor.Asegúrese de conectar los frascos de olor en la dirección correcta del flujo. Una conexión incorrecta no solo comprometerá el experimento planeado, sino que también podría contaminar el sistema de entrega. A continuación, verifique el sistema en busca de fugas.Primero, selle la salida de la cámara de mezclado. Luego, verifique que todo el flujo de aire antes del dispositivo de estímulo disminuya a cero. Si hay fugas en el sistema, escúchelas.Normalmente se pueden resolver intercambiando juntas de goma en conexiones cruciales o reemplazando el tubo de teflón. Para el primer paso de este procedimiento, existe el riesgo de rotura de vidrio, por lo que debe ponerse equipo de protección. Transfiera cuidadosamente 15 moscas de prueba individuales a los tubos de vidrio individuales utilizando un aspirador, y cierre los tubos de vidrio por ambos lados con los adaptadores correspondientes, los cuales deben ajustarse muy firmemente.A continuación, conecte los tubos de vidrio cargados al montaje del aparato de caminata de moscas. Una vez que todos los tubos estén sujetos, permita que las moscas se habitúen al nuevo entorno durante al menos 15 minutos antes de comenzar el experimento. Ahora encienda la fuente de luz.Asegúrese de proporcionar suficiente luz para un seguimiento eficiente sin aumentar la temperatura dentro de los tubos de vidrio. En este momento, todos los frascos de olor deben estar conectados para crear un sistema cerrado. El período de habituación depende de un sistema cerrado sin fugas, de modo que el flujo de aire a través de los tubos sea a la misma velocidad que durante los períodos de prueba.Verifique el flujo de aire en la computadora y conéctela a los medidores de flujo digitales. Los flujos de aire totales que salen del sistema deben ser iguales al flujo de aire que entra al sistema. Si no es así, hay una fuga presente.La fuga afectará el flujo de aire en todos los tubos, pero el tubo problemático generalmente es el que presenta la mayor caída en el flujo de aire. Si se identifica una nueva fuga, por lo general es causada por un tubo de vidrio roto dentro del adaptador, o por fragmentos de vidrio en los adaptadores provenientes de experimentos anteriores. Durante este proceso, asegúrese de que la humedad del aire que sale del sistema esté entre 60 y 80%. Después de que las moscas se hayan aclimatado a sus tubos, se puede comenzar el experimento.En principio, se puede presentar cualquier secuencia de olores hasta ahora. Los mejores resultados se obtienen aleatorizando los estímulos y separándolos por al menos 90 segundos en total.Presente cada olor 40 veces en pulsos de 500 milisegundos. A continuación, configure una región de interés arrastrando un marco sobre el área que se va a monitorear. Incluya los 15 tubos de vidrio en el marco, pero excluya los cinco milímetros externos de los extremos de los tubos.El siguiente paso consiste en desactivar el software de seguimiento y realizar modificaciones en el script. Esto cambiará la posición del eje Y de las 14 líneas paralelas que separan los tubos individuales. Cuando el software de seguimiento vuelva a activarse, solo debe haber una mosca entre dos líneas cualesquiera.A continuación, asegúrese de que los parámetros de la cámara estén configurados para que las moscas sean rastreadas de manera confiable a lo largo de los tubos de vidrio. Si las moscas se pierden en los bordes de la región de interés, aumente el brillo o la ganancia del software de rastreo. Ahora que el sistema está completamente preparado, inicie el protocolo de estímulo.Registre las posiciones de las moscas a una velocidad de 20 cuadros por segundo y registre estas posiciones coordenadas junto con el estado de la válvula de olor en archivos de texto. Dado que el experimento es muy sensible a los olores, se requiere limpieza regular para limpiar los tubos de vidrio, sumergirlos en detergente y luego enjuagarlos con agua destilada corriente. Tras el enjuague, seque los tubos con aire presurizado y luego caliéntelos a 200 grados Celsius durante ocho horas.Para limpiar primero el sistema de entrega de olores, retire todos los viales de olor y los tubos de la cámara de mezclado central. Luego, retire los adaptadores de los tubos de la cámara de mezclado. Limpie la cámara de mezclado vacía enjuagándola con un disolvente bajo una campana, al igual que los tubos.Seque la cámara de mezclado utilizando aire presurizado y caliéntela a 200 grados Celsius durante ocho horas. Para limpiar los viales de olor y las válvulas, retire los tapones de acero, deseche las juntas de goma y extraiga las válvulas de retención, las válvulas de retención con jabón, el etanol y otros componentes tanto en etanol como en acetona. A continuación, someta los componentes en remojo a ultrasonidos durante 30 minutos a la máxima potencia y enjuáguelos con agua destilada.Como antes, utilice aire presurizado para secar y caliente los componentes a 200 grados Celsius durante ocho horas. Enjuague con etanol cuando la acetona esté en la dirección del flujo de aire, ya que la acetona ataca las piezas de goma; seque inmediatamente cada válvula de retención enjuagada con aire presurizado para eliminar todos los olores residuales de las válvulas de retención enjuagadas. Pase aire a través de ellas durante varios días y colóquelas en una incubadora de 60 grados Celsius con el flujo de aire pulsando encendido y apagado en intervalos de un segundo.15 moscas hembra en ayunas fueron expuestas al butirato de etilo. La barra amarilla representa el pulso de olor. Los cuadrados azules muestran el movimiento ascendente dentro de un período de 100 milisegundos.Los cuadrados rojos correspondientes representan el movimiento a favor del viento. Las mismas moscas también mostraron movimiento en contra del viento en respuesta a la estimulación con acetato de isopentilo, acetato de etilo o dos tres butano d promediado a la población. La respuesta de la mosca al acetato de etilo tuvo un inicio brusco, alta amplitud y corta duración.En contraste, la respuesta a dos tres butano Dion tuvo un inicio promedio más tardío, menor amplitud y mayor duración. En última instancia, los datos de cada odorante se resolvieron de esta manera y luego se analizaron más a fondo para demostrar que los cuatro olores provocaron un mayor desplazamiento hacia aguas arriba dentro de los cuatro segundos en comparación con el disolvente. Además, al abrir los frascos de odorante de forma sincrónica, las moscas fueron expuestas a todas las mezclas posibles.Después de estimular a las moscas con los cuatro olores individuales, las estimulaciones con mezclas de los cuatro olores fueron al menos tan atractivas como el compuesto individual más atractivo en la mezcla. Una vez dominado, puede realizar este experimento en una hora, y luego el experimento dura ocho horas y ya a los 30 minutos puede visualizar sus primeros resultados. Por lo tanto, este método permite realmente obtener datos de muchas moscas en poco tiempo con una alta resolución temporal.Pero tenga cuidado. Este experimento requiere una limpieza exhaustiva entre los experimentos. Si su sistema aún está contaminado con las hormigas del experimento anterior, puede olvidarse de sus resultados en el fly walk.Por supuesto, también puede probar moscas modificadas genéticamente para investigar el impacto de circuitos neuronales individuales o específicos sobre el comportamiento guiado por olores. Tras el desarrollo de esta nueva técnica, se allanó el camino para realizar investigaciones en este campo, la fisiología de los insectos, con el fin de comprender el procesamiento de estos olores en el cerebro del insecto. Y lo más importante, el uso del mismo tipo de estimulación para el comportamiento en la marcha de la mosca y para experimentos fisiológ游戏副本Después de ver este video, debería tener una buena idea sobre cómo establecer el ensayo de caminata de la mosca, y debería poder establecer este experimento en su propio laboratorio y comenzar sus propios experimentos de alto rendimiento sobre el afecto en insectos en breve. Pero no olvide que trabajar con material de vidrio y productos químicos puede ser extremadamente peligroso, por lo tanto, siempre use una bata de laboratorio. Utilice gafas protectoras y guantes.

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