De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en Drosophila melanogaster Uso de la Flywalk Paradigma

El objetivo general de este bioensayo conductual es investigar el comportamiento guiado por el olor en las moscas del vinagre. Fly Walk es un sistema de alto rendimiento que rastrea y analiza automáticamente las respuestas conductuales de múltiples moscas individuales a los estímulos olfativos. Esta nueva técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el área del olfato de los insectos.

Por ejemplo, ¿cuál es el equilibrio hedónico de un olor, o qué significa la adición de odorantes adicionales a este equilibrio? La principal ventaja de este experimento es que podemos oler el comportamiento guiado en alta resolución temporal, y utilizamos estímulos olfativos que son similares a los que experimentan los insectos en la naturaleza o a los que también utilizamos en las grabaciones electrofisiológicas. En general, las personas que intentan usar este método pueden tener dificultades porque realmente necesita un sistema hermético, por lo que debe saber por dónde pasa el aire y debe asegurarse de que no haya fugas donde el aire pueda salir del sistema. Para estos experimentos, es importante criar las moscas bajo un ciclo de oscuridad de 12 a 12 luces en cultivos bajos a medianos que contienen un medio alimenticio normal.

Mantenga la temperatura ambiente entre 23 y 25 grados centígrados, y la humedad relativa debe ser de alrededor del 70% en la preparación. Utilizando grandes viales de cultivo se realizaron de 20 a 30 adultos durante una semana y se recolectaron grupos de 30 a 40 crías de sexo mixto para hacer una cohorte experimental. Cuando una cohorte tenga de dos a cuatro días de edad, transfiérala a un nuevo vial que contenga un tapón de espuma húmedo o un papel de seda húmedo.

Deje que las moscas mueran de hambre en este vial durante 24 horas antes de la prueba. Es vital que las moscas no estén anestesiadas durante este traslado. Para esta configuración, las botellas de 250 mililitros sirven como humidificadores.

Llena cada botella con 100 mililitros de agua destilada. A continuación, prepare medio mililitro de caldos de trabajo de cada odorante como una dilución de 1000 de los olores puros y el aceite mineral. Del mismo modo, prepare un tubo de PCR solo con aceite mineral para que sirva como control negativo.

Ahora prepare el sistema de entrega de olores para cada odorante. En el experimento. Conecte dos válvulas de retención de bola a cada vial de olor.

Asegúrese de conectar los viales de olor en la dirección de flujo correcta. Una conexión incorrecta no solo comprometerá el experimento planeado, sino que también puede contaminar el sistema de entrega. A continuación, compruebe si hay fugas en el sistema.

Primero, selle la salida de la cámara de mezcla. A continuación, comprueba que todo el flujo de aire antes del dispositivo de estímulo caiga a cero. Si hay fugas en el sistema, escúchelas.

Por lo general, se pueden resolver intercambiando juntas de goma en conexiones cruciales o intercambiando tubos de teflón. Para el primer paso de este procedimiento, romper vidrios es una preocupación, así que póngase equipo de protección. Transfiera con cuidado 15 moscas de prueba individuales a los tubos de vidrio individuales Con un aspirador, cierre los tubos de vidrio por ambos lados con los adaptadores correspondientes, deben encajar muy bien.

A continuación, conecte los tubos de vidrio cargados a la configuración de la pasarela de mosca. Una vez que todos los tubos estén conectados, deje que las moscas se habitúen al nuevo entorno durante al menos 15 minutos antes de comenzar el experimento. Ahora encienda la fuente de luz.

Asegúrese de proporcionar suficiente luz para un seguimiento eficiente sin aumentar la temperatura dentro de los tubos de vidrio. Todos los viales de olor deben estar conectados en este punto para crear un sistema cerrado. El período de habituación se basa en un sistema cerrado sin fugas, por lo que el flujo de aire a través de los tubos es a la misma velocidad que durante los períodos de prueba.

Verifique el flujo de aire en la computadora, conéctelo a los medidores de flujo digitales. El total de flujos de aire que salen del sistema debe ser igual al flujo de aire que ingresa al sistema. De lo contrario, hay una fuga presente.

La fuga afectará el flujo de aire en todos los tubos, pero el tubo problemático generalmente es el que muestra la mayor caída en el flujo de aire. Si se identifica una nueva fuga, generalmente es causada por un tubo de vidrio que se rompió dentro del adaptador, o es causada por fragmentos de vidrio dentro de los adaptadores de experimentos anteriores. Durante este proceso, asegúrese de que la humedad del aire que sale del sistema esté entre el 60 y el 80%Después de que las moscas se hayan aclimatado a sus tubos, se puede realizar el experimento.

En principio, hasta ahora se puede presentar cualquier secuencia de olores. Los mejores resultados se pueden obtener aleatorizando los estímulos y separándolos por al menos 90 segundos. En total.

Presente cada olor 40 veces en pulsos de 500 milisegundos. A continuación, configure una región de interés arrastrando un fotograma por el área que se va a supervisar. Incluya los 15 tubos de vidrio en el marco, pero excluya los cinco milímetros exteriores de los extremos de los tubos.

El siguiente paso es apagar el software de seguimiento y realizar modificaciones en el script. Eso cambiará la posición del eje Y de las 14 líneas paralelas que separan los tubos individuales. Cuando el software de seguimiento vuelva a estar encendido, solo debe haber una mosca entre dos líneas cualesquiera.

A continuación, asegúrese de que los parámetros de la cámara estén configurados para que las moscas se rastreen de manera confiable a través de los tubos de vidrio. Si las moscas se pierden en los bordes de la región de interés, aumente el brillo o la ganancia del software de seguimiento. Ahora que el sistema está completamente preparado, inicie el protocolo de estímulo.

Registre las posiciones de las moscas a una velocidad de 20 fotogramas por segundo y registre estas posiciones de coordenadas en combinación con el estado de la válvula de olor en archivos de texto. Debido a que el experimento es muy sensible a los olores, se requiere una limpieza regular para limpiar los tubos de vidrio, remojarlos en detergente y luego enjuagarlos con agua destilada corriente. Después del enjuague, seque los tubos con aire presurizado y luego caliéntelos a 200 grados centígrados durante ocho horas.

Para limpiar primero el sistema de entrega de olores, retire todos los viales y tubos de olor de la cámara de mezcla central. A continuación, retire los adaptadores de tubos de la cámara de mezcla. Limpie la cámara de mezcla vacía enjuagándola con un solvente debajo de una campana como los tubos.

Seque la cámara de mezcla con aire presurizado y caliéntela a 200 grados centígrados durante ocho horas. Para limpiar los viales de olor y las válvulas, retire los tapones de acero, deseche las juntas de goma y retire las válvulas de retención, las válvulas de retención de jabón y etanol, y otros componentes tanto en etanol como en acetona. A continuación, sonique los componentes empapados durante 30 minutos al máximo y enjuáguelos con agua destilada.

Como antes, utilice aire presurizado para el secado y caliente los componentes a 200 grados centígrados durante ocho horas. Cuando la acetona esté en la dirección del flujo de aire, debido a que la acetona ataca las piezas de goma, seque inmediatamente cada válvula de retención enjuagada con aire presurizado para eliminar todos los olores residuales de las válvulas de retención enjuagadas. Pulse aire a través de ellos durante varios días, colóquelos en una incubadora de 60 grados centígrados con flujo de aire que se enciende y apaga en intervalos de un segundo.

15 moscas hembras hambrientas fueron expuestas al butirato de etilo. La barra amarilla representa el pulso de olor. Los cuadrados azules representan el movimiento contra el viento dentro de un marco de tiempo de 100 milisegundos.

En consecuencia, los cuadrados rojos representan el movimiento a favor del viento. Las mismas moscas también mostraron movimiento contra el viento en respuesta a la estimulación con acetato de pentilo isop, acetato de etilo o dos tres butano d promediados a la población. La respuesta de la mosca al acetato de etilo tuvo un inicio brusco, alta amplitud y corta duración.

Por el contrario, la respuesta a dos Dion de tres butano tuvo un inicio promedio más tardío, menor amplitud y mayor duración. En última instancia, los datos de cada odorante se resolvieron de esta manera y luego se analizaron más a fondo para mostrar que los cuatro olores provocaron un mayor desplazamiento contra el viento en cuatro segundos que el solvente. Además, al abrir los viales de odorante, las moscas se expusieron sincrónicamente a todas las mezclas posibles.

Después de estimular las moscas con los cuatro olores individuales, las estimulaciones con mezclas de los cuatro olores fueron al menos tan atractivas como el compuesto individual más atractivo de la mezcla. Una vez que lo domines, puedes ejecutar este experimento en una hora, y luego se ejecuta durante ocho horas y ya 30 minutos después puedes visualizar tus primeros resultados. Por lo tanto, este método realmente permite obtener datos de muchas moscas en poco tiempo con una alta resolución temporal.

Pero ten cuidado. Este experimento requiere una limpieza exhaustiva entre los experimentos. Si su sistema todavía está contaminado con las hormigas del último experimento, puede olvidarse de sus resultados en la caminata de moscas.

Por supuesto, también puede probar moscas modificadas genéticamente para investigar el impacto de los circuitos neuronales individuales o de fábrica en el comportamiento guiado por OD. Después del desarrollo de esta nueva técnica, allanó el camino para que nosotros investigamos en esta área, la facción de los insectos, para comprender la codificación de estos olores en el cerebro del insecto. Y lo que es más importante, el uso del mismo tipo de estimulación para el comportamiento en la marcha de la mosca y para el experimento fisiológico significa que realmente podemos comparar estos dos paradigmas experimentales diferentes.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo establecer la caminata de la mosca, y debería poder establecer este experimento en su propio regazo y comenzar pronto sus propios experimentos de alto rendimiento sobre el afecto de los insectos. Pero no olvide que trabajar con cristalería y productos químicos puede ser extremadamente peligroso, por lo tanto, siempre use una bata de laboratorio. Use gafas y guantes.