Un nuevo enfoque que elimina el manejo para el estudio de la agresión y el efecto "Loser" en
30 de diciembre de 2015
Durante mosca de la fruta peleas, los patrones de comportamiento observados, lucha dinámica, y el aprendizaje y la memoria asociada están influenciadas por las condiciones experimentales. El protocolo que se presenta aquí describe un procedimiento novedoso que elimina por completo la manipulación de las moscas durante los experimentos. Esto mejora la dinámica de lucha y permite la formación de efectos fuertes "perdedor".
El objetivo general de este método es inducir la formación de los efectos de perdedor y ganador en drosophila, melanin, gaster eliminando el manejo de las moscas del procedimiento conductual. La mayoría de los estudios conductuales en animales que se realizan en un entorno de laboratorio implican el manejo de los animales. A su vez, el manejo de los animales generalmente induce estrés, y el estrés puede interferir con los estudios conductuales que se intentan realizar; por ello, se busca eliminar el manejo estresante de los animales.
Desarrollamos una nueva cámara para nuestros estudios de agresión en moscas de la fruta que elimina por completo el manejo de los animales antes, durante o después de los experimentos. Al utilizar estas nuevas cámaras, todos los parámetros conductuales que hemos medido han resultado ser mejores. Con este método, minimizamos la variabilidad conductual entre individuos.
Reducimos el tiempo necesario para generar una relación de dominancia clara, y fuimos capaces de inducir mentalidades fuertes de perdedor y ganador. Estas cámaras son fáciles de usar y pueden tener múltiples propósitos para estudiar diferentes comportamientos de moscas de la fruta. Para comenzar el experimento, críe y mantenga las cepas de moscas en un incubador con ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a 25 grados Celsius y 50% de humedad relativa.
A continuación, prepare viales de aislamiento calentando alimento fresco para moscas hasta que se derrita. Utilizando una pipeta Pasteur, transfiera aproximadamente 1,5 mililitros de alimento derretido a tubos de ensayo de vidrio vacíos individuales y permita que el alimento se solidifique con un pincel fino. Retire suavemente una pupa macho en estadio tardío del vial de reserva y colóquela en la pared de un tubo de ensayo que contenga alimento recién preparado.
Cierre los viales de aislamiento con algodón y almacene los viales de aislamiento en el incubador. Después del aislamiento, las moscas están listas para ser marcadas. Anestesie la mosca con dióxido de carbono y luego utilice un palillo fino.
Coloque un pequeño punto de pintura acrílica en el tórax y evite pintar la cabeza, las alas, el abdomen o las patas. Deje secar la pintura durante aproximadamente 10 segundos y transfiera suavemente las moscas de vuelta a sus viales de aislamiento originales. Devuelva los viales de aislamiento al incubador.
Continúe con la preparación del equipo calentando alimento fresco para moscas hasta que se derrita. Utilice una pipeta posterior para transferir 0,8 mililitros de alimento a la tapa del vial con tapón de rosca y deje que el alimento se enfríe. Una vez que el alimento esté frío.
Aplique una pequeña gota de pasta fresca de levadura en el centro de la superficie del vaso de alimento. Lave el aparato y las cámaras individuales de combate con agua antes de cada uso y séquelos con una toalla de papel. A continuación, aplique una gota de masilla en el vaso de alimento y colóquelo en el centro de cada cámara de combate.
Cubra las cámaras de combate con la tapa del aparato. Coloque el aparato cubierto bajo una fuente de luz e instale una cámara de video encima de la estructura. Comience los experimentos de comportamiento insertando divisores de plástico en cada cámara de combate.
Retire el tapón de algodón del tubo de aislamiento y coloque el tubo debajo de un orificio abierto en el lateral del aparato. Permita que la mosca entre en la cámara de combate mediante geotaxis negativa. Luego cierre la pared deslizante después de que la mosca haya entrado en la cámara. Repita el procedimiento para introducir la segunda mosca en la cámara de combate por el otro lado del aparato.
A continuación, coloque nuevamente el aparato en la posición iluminada para la grabación de video. Inicie la grabación de video y retire el divisor de plástico para permitir que las moscas interactúen en experimentos del efecto perdedor. Registre las primeras peleas durante 20 minutos para asegurar la formación de relaciones de dominancia fuertes.
Después de 20 minutos, coloque suavemente el divisor de plástico nuevamente en las cámaras de combate para separar a las moscas y detener el video. Para inducir una fuerte mentalidad de perdedor, asegúrese de que las moscas establezcan y mantengan una relación de dominancia durante la primera pelea, y luego minimice la perturbación del animal al insertar los divisores para separar a las moscas. Después de un período de descanso de 10 minutos, comience a grabar y retire suavemente el divisor de plástico.
Deje que las moscas interactúen durante 20 minutos adicionales. Detenga la grabación después de 20 minutos para concluir el experimento. Retire las moscas de las cámaras de comportamiento mediante el eje geotáctico negativo invirtiendo el procedimiento descrito antes de que se utilizara el nuevo método para observar las primeras peleas.
En promedio, el primer encuentro se observa tras dos minutos. La primera arremetida ocurre tras cuatro minutos, y las moscas establecen una relación de dominancia tras ocho minutos. Durante los 12 minutos restantes, la relación de dominancia se refuerza.
A medida que los ganadores avanzan cada vez más y los perdedores retroceden cada vez más. El nuevo enfoque se utilizó para cuantificar el efecto del perdedor: el porcentaje de perdedores que pierden las segundas peleas durante dichas peleas. Se observa un efecto significativo cuando los perdedores previos se emparejaron con ganadores conocidos o con ganadores desconocidos para sus segundas peleas.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar el ensayo de agresión utilizando moscas macho de seis a siete días de edad que se criaron en aislamiento social. Una vez dominadas, estas cámaras permiten la introducción, monitoreo, interacción y separación fáciles de las moscas sin manipulación alguna, lo que induce un fuerte efecto de perdedor. El uso de divisores para separar las moscas después de la primera pelea permite variaciones en el protocolo experimental.
Podemos mantener a los ganadores y emparejarlos con un oponente diferente en la segunda pelea para inducir un efecto de ganador. Con pequeños ajustes, las mismas cámaras pueden utilizarse para estudiar el cortejo, la locomoción y otros comportamientos sociales de la mosca de la fruta. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar ensayos de agresión y cómo inducir un efecto de perdedor sin manipular a las moscas antes y durante los experimentos.
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Descripción general
Este estudio presenta un método novedoso para estudiar la agresión en moscas de la fruta al eliminar el manipuleo, lo que reduce el estrés y mejora los resultados conductuales. El nuevo diseño de la cámara aumenta la fiabilidad de la medición de los efectos de ganador y perdedor en Drosophila melanogaster.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del comportamiento
- Comportamiento animal
Antecedentes
- El manejo de animales puede inducir estrés, lo que afecta los estudios conductuales.
- Los métodos tradicionales suelen implicar manejo, lo que conduce a una variabilidad en los resultados.
- Comprender la agresión en Drosophila puede proporcionar información sobre las dinámicas conductuales.
- Eliminar el manejo podría permitir evaluaciones conductuales más precisas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método que minimice el estrés en las moscas de la fruta durante estudios de agresión.
- Investigar los efectos del manipuleo sobre los resultados conductuales.
- Mejorar la confiabilidad en la medición de comportamientos relacionados con la agresión.
Métodos Utilizados
- Desarrollo de una nueva cámara para estudios de agresión.
- Eliminación del manejo antes, durante y después de los experimentos.
- Medición de diversos parámetros conductuales en Drosophila.
- Comparación de los resultados con métodos tradicionales de manejo.
Resultados principales
- Los parámetros conductuales mostraron mejoras con el nuevo método.
- Se observó una menor variabilidad entre individuos.
- Se registraron efectos de perdedor más fuertes en ausencia de manipulación.
- La dinámica general de las peleas se vio potenciada.
Conclusiones
- El nuevo diseño de cámara reduce eficazmente el estrés en las moscas de la fruta.
- La eliminación del manejo conduce a datos conductuales más confiables.
- Este método puede aplicarse en estudios posteriores sobre el comportamiento animal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método aborda un desafío clave en la neurociencia del comportamiento: minimizar los factores de confusión experimentales introducidos por el manejo de los animales. Al eliminar la intervención manual, el enfoque mejora la fiabilidad de los datos para estudiar cambios conductuales dependientes de la experiencia, como los efectos de perdedor y ganador. Esto permite una validación más precisa de objetivos en las líneas de descubrimiento neuroconductual donde las respuestas conductuales informan hipótesis mecanicistas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las influencias genéticas y ambientales sobre las vías relacionadas con la agresión sin interferencias por estrés inducido por el manejo.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad conductual entre individuos, mejorando la sensibilidad del ensayo para detectar cambios fenotípicos sutiles.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos en dianas implicadas en el aprendizaje, la memoria y el comportamiento social al proporcionar lecturas conductuales más precisas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona una plataforma estandarizada y reproducible para cuantificar la dinámica de la agresión y la formación de jerarquías sociales.
- Valor operativo: Facilita flujos de trabajo compatibles con alto rendimiento mediante la entrada automatizada de moscas a través de geotaxis y la separación de cámaras usando deslizadores.
- Preparación del ensayo: Genera resultados cuantitativos como la latencia de la pelea, la frecuencia de embestidas y el tiempo de las relaciones de dominancia, útiles para aplicaciones de cribado de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia traslacional: Permite el estudio de cambios conductuales relacionados con la experiencia que modelan aspectos de trastornos psiquiátricos asociados a la derrota social y a la reactividad al estrés.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite aislar circuitos neuronales específicos o vías moleculares que contribuyen a la formación del efecto perdedor, sin interferencias provocadas por el manejo.
- Continuidad preclínica: Facilita el seguimiento conductual longitudinal a lo largo de varias rondas de combate para evaluar la plasticidad conductual adaptativa o maladaptativa.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que se utilizan fenotipos conductuales para validar objetivos que afectan la función de los circuitos neuronales y la regulación del comportamiento. Permite un fenotipado consistente antes de avanzar hacia estudios de intervención mecanicistas o terapéuticos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre genes o fármacos que influyen en las vías de agresión, memoria social y respuesta al estrés.
- Selección: Proporciona métricas conductuales cuantitativas y reproducibles, esenciales para comparar condiciones genéticas o farmacológicas.
- Análisis: Permite medir parámetros conductuales temporales (por ejemplo, inicio de la pelea, frecuencia de embestidas, establecimiento de dominancia) para informar sobre correlaciones dosis-respuesta o genotipo-fenotipo.
- Investigación Traducional: Se conecta con modelos preclínicos al capturar comportamientos sociales etológicamente relevantes que reflejan mecanismos conservados del estrés y el aprendizaje.
- Reutilización Empresarial: El diseño de la cámara es adaptable a otros comportamientos sociales de Drosophila, aumentando su utilidad en múltiples programas de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los ensayos conductuales al eliminar el manipuleo como variable confundente.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante flujos de trabajo estandarizados sin manipulación.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción en la validación de objetivos al reducir los falsos positivos derivados del ruido conductual inducido por el estrés.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización más precisa de objetivos basada en fenotipos conductuales confiables en sistemas relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, observación del comportamiento y fenotipado basado en video.
- Depende del acceso a sistemas de seguimiento del comportamiento y controles ambientales (ciclos luz/oscuridad, temperatura, humedad).
- Necesita estandarización entre laboratorios en cuanto al montaje de las cámaras, aislamiento de las moscas y temporización de los periodos de comportamiento.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir modificaciones en los mecanismos de entrada basados en geotaxis.
- Las limitaciones prácticas incluyen restricciones por el tamaño de las cámaras y la dependencia de la motilidad de las moscas para su autoentrada en las arenas.
