Control de RNAi mediada por aflatoxinas en Maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete / Aspergillus Patosistema

El objetivo general de este trabajo es proporcionar un método confiable, preciso, económico y rápido para probar la eficacia del silenciamiento mediado por ARNi de los genes de síntesis de aflatoxinas de aspergillus en maní transgénico utilizando un número mínimo de semillas, por lo general, se requieren cientos de gramos de semillas para cuantificar efectivamente las aflatoxinas en las muestras. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza menos de cinco semillas para probar un tratamiento en particular 10 días antes de preparar las semillas, establecer un cultivo de aflatoxina positiva para aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 en medio barrena ZAP Pex. Cultiva este cultivo a 25 grados centígrados.

Se utilizará para la inoculación de semillas. Después de preparar las plantas transgénicas que expresan el ARNAI, que se detalla en el protocolo de texto, se procede a la recolección de sus semillas. Primero, retire la carpa pérrica usando abrasión de una lavadora a presión configurada a bajo, o raspe la carpa périca con la mano.

Una vez que se retira la carpa perí, identifique el color de la carpa meso colocando las vainas en una tabla de madurez en los grupos adecuados. Ahora retire los agujeros y procese las semillas amarillas y marrones por separado. Calcule el número de semillas necesarias para el experimento: al menos tres piezas de semillas, lo que significa que se necesitan tres mitades de coplomo por línea de maní que se muestrea.

Cubra el fondo de un vaso de precipitados estéril con una capa de semillas y, a continuación, cubra las semillas con un volumen medido de etanol al 75%. Luego duplica ese volumen. Deje que las semillas se incuben en solución durante 30 segundos y luego enjuáguelas con agua destilada esterilizada.

A continuación, trate las semillas con un volumen de hipoclorito al 2% como se hace con el etanol F. Deje que esta incubación continúe durante cinco minutos. A continuación, utilice tres enjuagues en cinco volúmenes de agua destilada esterilizada.

Para eliminar el hipoclorito, es fundamental que toda la solución de hipoclorito se lave en este paso. Las semillas ahora están esterilizadas en la superficie. A continuación, hidrata las semillas sumergiéndolas en agua destilada esterilizada durante dos horas preparada para poner las semillas hidratadas en una placa de Petri estéril.

Todos los materiales deben estar esterilizados en este punto. Retire las capas de semillas con pinzas, luego separe el cohain. Por último, retira los embriones con un bisturí.

Los embriones pueden ser desechados o utilizados para regenerar nuevas plantas. A continuación, corta la oleína por la mitad con un bisturí y sumerge las mitades y el agua destilada esterilizada hasta que estén listas para la inoculación. A continuación, seque el exceso de agua de la mitad de la co-plomo en toallas de papel estériles y coloque los trozos de semilla en platos separados de 1,5% con hendiduras del tamaño de la semilla y meta las semillas en ellas con los lados cortados hacia arriba para inocular las mitades de co plomo.

Añadir dos microlitros de una suspensión de 10.000 esporas de aspergillus por microlitro a las superficies de corte. No dejes que la suspensión se corte por los lados de la semilla. Por último, coloque los platos en una incubadora oscura a 30 grados centígrados durante uno a cuatro días hasta que se prueben.

Después de un día, después de dos días y después de tres o cuatro días de muestra, las semillas retiran suavemente las mitades inoculadas seleccionadas al azar según sea necesario. Use un pañuelo de papel para limpiar el exceso de esporas y una barrena y coloque la muestra en un vial de vidrio con tapón de rosca. Transfiera las muestras no inoculadas a tubos de dos mililitros para el análisis R-T-P-C-R.

Libere las muestras en nitrógeno líquido y almacene las muestras congeladas en un congelador hasta que se procesen. Para el análisis de aflatoxinas, obtenga la media cuna de plomo inoculada en un frasco de vidrio con tapón de rosca de cuatro mililitros si es necesario. La muestra será estable durante muchos meses a menos 80 grados centígrados.

Cuando las semillas estén a temperatura ambiente, extraiga la muestra añadiendo cuatro volúmenes de metanol y dejando que los tubos se incuben durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente sin agitación. Al día siguiente, realice primero el UPLC, prepare una mini columna de propileno de 1,5 mililitros con una frita a juego. Luego agregue 200 miligramos de óxido de aluminio.

Y a continuación, inserta otra frita. Siguiente posición, vial de muestreador automático A-U-P-L-C debajo y en contacto con la mini columna para minimizar la evaporación. Ahora agregue 0,5 mililitros de extracto de metanol de la muestra a un vaso desechable que no sea de plástico.

A continuación, añada 0,5 mililitros de aceto nitrilo al tubo y mezcle las soluciones con una pipeta. Ahora aplique 0,5 mililitros de la mezcla a la mini columna preparada y recoja el EIT utilizando solo la gravedad. Una vez que se recolecta el EIT, conecte rápidamente una tapa séptica al vial de recolección para usar en el UPLC.

Coloque los viales en A-U-P-L-C ya preparados con una fase móvil de ensayo de agua, metanol y acedonita. A continuación, cuantifique el contenido de aflatoxinas en los EIT. Consulte el protocolo de texto para obtener más detalles junto con el análisis UPLC.

Coloque las piezas de semilla utilizadas para la extracción en viales de vidrio individuales. A continuación, liofilizar los viales durante la noche y medir el peso seco de la muestra de tejido por la mañana para que las concentraciones de aflatoxinas puedan expresarse en nanogramos por gramo de muestra. A continuación, se sacan las muestras del congelador y se añade el triol y se muelen los tejidos congelados con un homogeneizador de molino de bolas a 3.100 RPM durante 40 segundos y se procede a la extracción del ARN, se utilizó un vector de ARN portador de pequeños fragmentos de cinco genes de síntesis de aflatoxinas de un flavis, para transformar las plantas de cacahuete.

Los números de identificación corresponden a los números de anotación del genoma del instituto de 99 TRANSFORMANTS regenerados, se clonaron siete líneas positivas de PCR y se analizaron como se describe. Los siete mostraron entre un 60 y un 100% menos de acumulación de aflatoxinas en comparación con las líneas de control. Se presentan los resultados de dos de las siete líneas.

Estas dos líneas de RN AI mostraron la presencia del marcador seleccionable NPT dos. De acuerdo con los resultados de S-T-N-P-C-R, el control negativo utilizado fue una línea PCR negativa que pasó por el proceso de transformación para probar la capacidad de las líneas de ARNi para resistir aflatoxinas recién cosechadas de un aflatoxina positivo. Se aplicó una línea flavis NRRL 3, 3, 5, 7 a la mitad de la cuna, plomo, embrión y testa faltantes después de la incubación durante un máximo de 96 horas.

Los tejidos inoculados se procesaron utilizando UPLC para medir sus niveles de aflatoxinas como se describe. Estos resultados se confirmaron aún más mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas. En general, el ARNi 2 88 72 mostró una reducción del 94 al 100% en la aflatoxina B dos y una reducción del 90 al 100% en la aflatoxina B uno en comparación con el control.

Mientras que el ARNi 2 88 74 mostró una reducción del 60 al 100% en ambas aflatoxinas. Siguiendo este procedimiento, los mismos extractos de semillas se pueden utilizar para analizar phyto Xin con el fin de comprender mejor la respuesta de la semilla a la invasión de hongos. Este método también proporcionará una herramienta única para ayudar a desarrollar la tecnología de ARN para el control de micotoxinas.