Name: Control de RNAi mediada por aflatoxinas en Maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete / Aspergillus Patosistema (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprende un método eficiente para analizar aflatoxinas en cacahuete transgénico mediante RNAi usando menos de cinco semillas. Esta técnica permite cuantificar micotoxinas con UPLC y evaluar la eficacia del silenciamiento génico en Aspergillus flavus.

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Este trabajo recibió el apoyo financiero del proyecto USDA-ARS CRIS 6604-21000-004-00D, el proyecto CRIS 6604-42000-008-00D, y el programa Feed-the-Future de USAID Número de acuerdo 58-0210-3-012. Agradecemos a Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell y Kathy Gray por su asistencia técnica. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica una recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de EE. UU.

Los autores no tienen nada que revelar ni ningún conflicto de intereses.

Plant-anfitrión RNAi mediada por silenciamiento de genes en hongos patógenos se ha demostrado 27,43, sin embargo, no existen publicaciones que muestran la viabilidad del control mediada por ARNi de la acumulación de micotoxinas en las plantas. Un factor limitante para estos estudios en maní fue la falta de un método para evaluar un fenotipo acumulación no-aflatoxinas en plantas individuales, como las hojas no muestran síntomas tras la infección fúngica de las vainas subterráneas. Además, la acumulación distribuido no-normalmente de las aflatoxinas, y la necesidad de grandes muestras para el análisis químico 15,16 han obstaculizado la cuantificación de potencial efecto RNAi en una sola planta. El método presentado aquí consta de 72 hr experimentos utilizando cinco semillas para llevar a cabo tres muestreos 24 hr-intervalo, por triplicado (Tabla 1, Figura 7). En comparación con el análisis de aflatoxinas típica que requiere no menos de 100 g de semillas, nuestro método es particularmente adecuado para individual eventos transgénicos de plantas de cacahuete que inicialmente no producen más de dos o tres vainas. RNA mediada por silenciamiento de la síntesis de la aflatoxina se ha demostrado mediante la transformación genéticamente Aspergillus flavus y A. parasiticus. Desde AFLR es un regulador principal de la producción de aflatoxinas en A. flavus y A. 44,45 parasiticus, se convierte en un objetivo interesante para el silenciamiento de ARN mediada en las plantas. Sin embargo, las variaciones genéticas en AFLR han demostrado entre las especies Aspergillus 46, y esas variantes genéticas podrían escapar silenciar si no hay una secuencia perfecta a juego con la señal de RNAi producido en la planta huésped. Por lo tanto, AFLR fue uno de los objetivos para silenciar en el vector p5XCAPD, pero no era el único. Repeticiones invertidas del gen AFLR introducidos en A. flavus y A. parasiticus por transformación resultó en silenciar y un mínimo o ningún productoion de las aflatoxinas 47 (McDonald et al., 2005b). Además, el silenciamiento de genes AFLD impidió la producción de aflatoxinas en hasta un 98% en A. flavus y A. parasiticus en la transformación directa 48. Para aumentar la probabilidad de éxito en nuestro sistema, cacahuete se transformó con fragmentos de repetición invertida de cinco genes implicados en la producción de aflatoxinas en A. flavus. Aquí se demuestra que el uso de p5XCAPD que se dirige para silenciar varios genes en la vía de síntesis de aflatoxinas, el 90% los niveles de -100% más bajos de aflatoxina B 1 y B 2 se lograron en la línea 288 a 72, y los niveles de 60 a 100% más bajos acumula en línea 288 a 74 en comparación con el control, cuando la mitad de los cotiledones fueron inoculados con A. flavus, Figuras 4, 7. Más importante aún, este método detecta diferencias estadísticamente significativas en la acumulación de aflatoxina por líneas 288-72, 288-74 contra el control de todo el experimento aplicando statis paramétricatics, la Figura 7. Dado el pequeño tamaño de la muestra, es importante destacar la necesidad de utilizar un método eficaz para detectar las aflatoxinas, estos experimentos fueron analizados por UPLC que tiene una alta resolución, cinco veces más rendimiento y tres veces mayor sensibilidad que HPLC 49. Expresión de la RNAi inserto en 288-74 sólo se detectó en los cotiledones inmaduros (amarillo) a 24 h de incubación. El inserto RNAi no se detectó por RT-PCR en cotiledones maduros de 288 a 74 a las 24 horas, o en cualquier grupo de madurez a 48 horas, la Figura 6. Este mismo fenómeno se observó en otras líneas de maní transgénicas RNAi (Arias, RS, 2015 sin publicar), donde por lo general las transcripciones RNAi solamente se detectaron en los cotiledones inmaduros a las 24 horas. Las muestras de ARN se trataron con ADNasa antes de la síntesis de ADNc, los datos se normalizaron al nivel de la expresión de actina y ninguna evidencia de contaminación de ADN se observó. En caso de ADN han estado presentes en las muestras, lo que deberíase han detectado en las muestras de 48 h, así, pero consistentemente que no era el caso. Expresión bajo el control del promotor 35S no siempre es uniforme; que puede verse afectada por las condiciones ambientales 50, tipo de tejido y la etapa de desarrollo 51,52. Al mismo tiempo, en la vía de interferencia de ARN, la tasa de descomposición de ARNm y la tasa de decaimiento siRNA pueden variar significativamente 53. Es posible que la rápida degradación del ARNm por el mecanismo de interferencia de ARN podría haber impedido la detección de ARNm en 48 h de incubación. Si la ausencia de expresión a las 48 horas se debió a bajas 35S-promotor impulsado por la transcripción, o a la degradación rápida de dsRNA por Dicer queda por responder. Por lo tanto, la detección de pequeños ARN de alto rendimiento de secuenciación daría una mejor comprensión de los procesos que tienen lugar a través de RNAi 54 en estos experimentos. Sin embargo, como el silenciamiento de ARN se propaga por vía sistémica, principalmente a través del floema de photosyntodiar a las fuentes a la sacarosa sumideros (en este caso las semillas de maní) 55, el silenciamiento de aflatoxina-síntesis se puede producir en las semillas sin expresión local del RNAi inserción. Mucha investigación que queda por hacer para determinar el nivel de umbral de los pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) necesarias para evitar la acumulación de aflatoxinas en las semillas. Es importante destacar el hecho de que ambos, la expresión del ARNm del RNAi construir (Figura 6), y la acumulación de las aflatoxinas B 1 y B 2 (Figura 7) mostró resultados diferentes para los inmaduros (amarillo) vs. maduro (marrón) cotiledones. Plantas de cacahuete tienen crecimiento indeterminado, es decir, que presentan en la cosecha una serie de vainas de madurez, la Figura 2. Además, las semillas de diferentes grupos de madurez difieren en su composición química, por ejemplo., 2,4% de sacarosa en semillas inmaduras, y 1,9% en semillas maduras en las mismas condiciones de campo 56,57. Por lo tanto, para entender la una eficiencia realy de control de ARN mediada por la acumulación de aflatoxina, es importante analizar grupos de madurez por separado. Una defensa natural de semillas de maní es la producción de fitoalexinas, que varía en la diversidad de compuestos producidos y sus cantidades relativas en función de la madurez de las semillas y las condiciones ambientales 58-61, y es particularmente alto en los embriones en comparación con los cotiledones 62. Los embriones también tienen concentraciones significativamente más altas de ácidos nucleicos, ADN y ARN de los cotiledones (Arias RS, no publicados). Como semillas de maní maduran, los cambios en su fisiología y la composición química se producen 63. Antioxidantes fenólicos en forma testa de maní taninos condensados ​​con actividad fungistática 64; esto también es evidente en el color mesocarpio que refleja estados de madurez, de color amarillo a negro de 35 años, ya que su contenido de taninos y compuestos fenólicos aumenta con la madurez 65. Por lo tanto, la presencia de tthis o embriones en el experimento, dadas sus propiedades antimicrobianas, podrían haber limitado el crecimiento de hongos y por lo tanto sobreestimado el efecto de RNAi silenciamiento, por lo tanto, que fueron retirados. Además, la eliminación de testa y embriones ayuda a limitar las fuentes de variación en el análisis, como el medio de cotiledón que lleva el embrión tendrá más fitoalexinas y más contenido de ARN. Además del análisis por grupos de madurez y la remoción de la testa y el embrión en estos experimentos, es importante señalar algunas observaciones más: a) aunque los resultados se muestran para un máximo de 96 horas de incubación, se recomienda el uso de no más de 72 hr para obtener resultados consistentes, como semillas quedan degradados por 96 horas; y b), mientras que los cotiledones y media de la misma semilla, aunque tomaron muestras al azar, no constituyen muestras perfectamente independientes, RT-PCR y la acumulación de aflatoxina en eventos transgénicos mostraron una variación mínima entre semillas. También, un recuento de esporas fúngicas precisa, el volumen de inóculos de 2 l, y la aplicación de esporas en la superficie de corte de los cotiledones evitando el goteo en los lados son importantes para asegurarse de que las esporas germinadas están expuestos al tejido de la planta. El agua / agar en las placas debe estar en el 1,5% (w / v), agar suave hace que el escurrimiento de las esporas, como se muestra en el último fotograma de la Figura 4 (abajo). Debería sembrar la disponibilidad de un evento transgénico particular, ser limitado, el muestreo se puede realizar por duplicado en lugar de por triplicado obtención de resultados similares (es decir, la Figura 7); Sin embargo, las muestras por triplicado ayudarán a reducir el error estándar. La única limitación de este método es que requiere un sistema altamente sensible (UPLC) para la detección de aflatoxinas / cuantificación, pero al mismo tiempo esto reduce la probabilidad de sobreestimar el efecto de RNAi debe aflatoxinas no ser detectados por métodos menos sensibles. En conclusión, este método ofrece por primera vez un enfoque fiable para estudiar laefecto de RNAi en el control de las aflatoxinas. La reducción del tiempo para un experimento de toda una temporada de cultivo a menos de una semana, este método tremendamente acelerar la investigación sobre RNAi de maní / patosistema Aspergillus hacia la mitigación y / o eliminación de las aflatoxinas.

Aproximadamente 4,5 millones de personas están expuestas crónicamente a las aflatoxinas 1, las más potentes carcinógenos conocidos en la naturaleza 2. Estas micotoxinas contaminan el 25% de los cultivos de alimentos en el mundo 3, incluyendo maíz, yuca, arroz, frutos secos, cereales y especias. 4. Las aflatoxinas causan el retraso del crecimiento en niños de 5, alteran el sistema inmunológico 6, están presentes en el 58% de los carcinomas hepatocelulares-en biopsias humanas 7,8, y matan a cientos de personas durante los brotes periódicos de aflatoxicosis 9,10. Las aflatoxinas son micotoxinas polyketide derivados normalmente producidas por Aspergillus flavus y A. parasiticus; aflatoxinas B 1 y B 2 son producidas por A. flavus, mientras que A. parasiticus también produce G 1 y G 2. La estructura química de estos compuestos y un cromatograma que muestra su separación por UPLC se muestra en la Figura 1. </strong&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> Figura 1. Las aflatoxinas y RNAi inserte Top:. Estructura química (izquierda) y el ejemplo de cromatograma (derecha) de las cuatro aflatoxinas polyketide derivados más comunes: B 1, B 2, G 1 y G 2, producida por Aspergillus parasiticus, A . flavus produce B 1 y B 2 Conclusión: Esquema de fragmentos de genes en el RNAi construir p5XCAPD utiliza para la transformación de maní, números bajo las flechas son los números de acceso de genes fragmento del genoma de Aspergillus flavus;. PIV2: intrón de patata; pares de bases;: pb RT_5X_1 y RT_5X_2:. Real-Time PCR primer sitios <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">Haga click aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Las pérdidas económicas en las exportaciones debido a las aflatoxinas en maní solos superan $ 450 millones de dólares si se calcula sobre la base del 4 ng. G -1 límite de aflatoxina permitido para el consumo humano en la Unión Europea 11. Las aflatoxinas se han conocido durante 60 años 12; sin embargo, aunque se han desarrollado muchas prácticas agrícolas para mitigar sus efectos, incluyendo la aplicación de otras cepas de hongos 13,14, ningún método consistente de control de existe, y variedades de plantas resistentes no están disponibles. Pruebas de germoplasma vegetal para la resistencia a las aflatoxinas es particularmente difícil, porque incluso bajo condiciones propicias para la invasión de patógenos, la acumulación de micotoxinas es impredecible y no sigue una distribución normal. Por lo tanto, los experimentos por lo general requieren grandes áreas de plantación, cientos de semillas y múltiples muestras de 100-1,700 g para reducir la variabilidad del 15,16 datos. La interferencia de ARN eradescubierto en 1998 17; y los beneficios de &quot;silenciamiento&quot; se están estudiando actualmente en una serie de nuevas aplicaciones, por ejemplo., en terapias humanas contra cáncer de mama metastásico 18, cáncer de hígado 19, la leucemia mieloide 20, y en la protección de las plantas contra los insectos y nematodos 22 21. En las plantas, las señales de interferencia de ARN pueden viajar una célula a otra, con el ARN pequeño de interferencia (siRNA) y el ARN de alto peso molecular, siendo responsable del gen postranscripcional sistémica silenciar 23,24, incluso dentro de los hongos patógenos que están en estrecho contacto con el anfitrión planta 25. La eficacia de RNAi en el silenciamiento mediado por la planta de los genes de hongos patógenos ha sido descrita en pocos patosistemas plantas, para estos, examen visual de los síntomas en las partes aéreas de las plantas (hojas) permite la cuantificación de la enfermedad, es decir, oomiceto Bremia en la lechuga 26 , Puccinia en el trigo <sup&gt; 27 y Fusarium en el banano 28. Mucho más difícil es evaluar la eficacia de RNAi para controlar las micotoxinas en las plantas, en especial aflatoxinas en cacahuetes como las hojas no muestran síntomas de la infección, los órganos invadidos (semillas) están bajo varias pulgadas de suelo, la aparición de la infección es impredecible, y sólo química análisis puede determinar la presencia de aflatoxinas. Además, cada evento transgénico en maní normalmente produce pocas semillas por planta (4-6); Por lo tanto, la prueba tradicional para una acumulación de rasgo sin aflatoxina en grandes parcelas de campo, con una duración temporadas enteras de cultivos y el uso de cientos de semillas no es factible. Un método se describe aquí para analizar en menos de una semana, semillas de maní RNAi para la presencia de transgen y para la acumulación de un rasgo no-aflatoxina, utilizando sólo pocas semillas.

<table><tbody><tr><td>Imprimaciones, oligonucleótidos</td><td>DNA Technologies, Coralville, IA, EE. UU.</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>69106</td><td></td></tr><tr><td>Medio de agar Czapek Dox</td><td>Oxoid, de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>CM0095</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>BP 1423</td><td></td></tr><tr><td>Congelador -80&nbsp; &deg; C</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de aluminio, Al2O3</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941</td><td></td></tr><tr><td>Depósitos SPE 1,5 ml</td><td>Grace Davison Discovery Scientific</td><td>210011</td><td></td></tr><tr><td>Fritas para depósito SPE de 1,5 ml</td><td>Grace Davison Discovery Scientific</td><td>211401</td><td></td></tr><tr><td>Viales de muestreador automático</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td>186005221</tr><tr><td>Instrumento de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) Acquity de Waters; Gerente de solvente cuaternario de clase UPLC-H; Gerente de Muestras UPLC; Detector fluorescente UPLC (FLR); UPLC BEH C18 2.1&nbsp; mm x 50 y nbsp; milímetros, 1,7 y 1,7 pulgadas; columna de mm</td><td>Waters Corporation, Milford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnigan LCQ Advantage MAX espectrómetro de masas de trampa de iones, con software Xcalibur versión 1.4</td><td>Thermo Electron Corp., San José, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estándares de aflatoxinas, B1, B2, G1 y G2</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, MO</td><td>A6636; A9887; A0138; A0263</td><td></td></tr><tr><td>Systat Software 12.2</td><td>SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de Trizol</td><td>Invitrogen, CA</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Síntesis de primera cadena Super Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11752-050</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 PCR en tiempo real</td><td>Lifetechnologies, Grand Island, NY</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth-Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>R453642</td><td></td></tr><tr><td>pENTR1A</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A10462</td><td></td></tr><tr><td>LR Mezcla de enzimas clonasa II</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1919</td><td></td></tr><tr><td>Acetosiringona</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Estación de trabajo robótica QIAcube</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos: kanamicina, cefotaxima, gentamicina; estreptomicina</td><td>Goldbio, St. Louis, MO</td><td>cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; estreptococo: S-150-50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerasa</td><td>Invitrogen</td> de alta fidelidad, CA <td>11304-029</td><td></td></tr></tbody></table>

control de rnai mediada por aflatoxinas en maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete /<em&gt; aspergillus</em&gt; patosistema

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación estima que el 25% de los cultivos alimentarios más importantes del mundo están contaminados con aflatoxinas. Eso representa 100 millones de toneladas de alimentos que se destruyen o desvían a consumo no humano cada año. Las aflatoxinas son carcinógenos poderosos normalmente acumulados por los hongos Aspergillus flavus y A. parasiticus en los cereales, nueces, tubérculos y otros productos agrícolas. Silencios de cinco genes aflatoxina-síntesis de ARN de interferencia (RNAi) en las plantas de maní se utiliza para controlar la acumulación de aflatoxina después de la inoculación con A. flavus. Anteriormente, existía ningún método de analizar la eficacia de RNAi en eventos transgénicos maní individual, ya que por lo general producen pocas semillas y los métodos tradicionales de los grandes experimentos de campo en condiciones de aflatoxinas propicio no eran una opción. En el campo, la probabilidad de encontrar semillas contaminadas de forma natural es a menudo 1/100 a 1/1,000. Además, la contaminación por aflatoxinas no se distribuye de manera uniforme. Nuestro método utiliza pocas semillas por evento transgénico, con pequeñas piezas procesadas por PCR en tiempo real (RT-PCR) o pequeña secuenciación del ARN, y para el análisis de la acumulación de aflatoxina por cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC). Líneas de maní RNAi expresan 288-72 y 288-74, mostraron una reducción de hasta el 100% (p≤0.01) en la aflatoxina B 1 y B 2 en comparación con el control que se acumuló hasta 14.000 ng. G -1 de aflatoxina B 1 cuando inoculado con A. aflatoxigénicos flavus. Como referencia, el máximo total de aflatoxinas permitidos para el consumo humano en los Estados Unidos es de 20 ng. G -1. Este protocolo describe la aplicación de control de RNAi mediada de aflatoxinas en semillas de maní transgénicos y los métodos para su evaluación. Creemos que su aplicación en el cultivo de maní y otros cultivos traerá un rápido avance en esta importante área de la ciencia, La medicina y la nutrición humana, y contribuirán de manera significativa a los esfuerzos internacionales para controlar las aflatoxinas, y potencialmente otras micotoxinas en los principales cultivos alimentarios.

Plásmido p5XCAPD se hizo como un derivado de la pCAPD 29, y lo utilizó para transformar plantas de maní; este vector lleva repeticiones invertidas de cinco fragmentos pequeños, 70-80 pb cada uno, de los genes aflatoxina-síntesis de A. flavus separadas por un intrón (Figura 1). Fragmentos de AFL2G_07224 (AFLR), AFL2G_07223 (AFLS o aflJ), AFL2G_05027 (bomba de eflujo de la aflatoxina, aflep), AFL2G_07228 (AFLC / pksA / pksL1), y AFL2G_07731 (Pes1) se utilizaron para la construcción, números en la Figura 1 corresponde a una . flavus anotación del genoma en Broad Institute, Cambridge, MA, y la literatura 42. Un total de 99 líneas de maní se regenera después de pasar por el proceso de transformación, 50 fueron PCR positiva para NPTII detectado por STN-PCR, y 33 líneas eran semillas de PCR positivos y producidos. Sólo siete líneas positivos de PCR se propagan clonalmente y probados por el present método para la acumulación de aflatoxina, todos los siete mostró entre 60% y 100% menos acumulación de aflatoxina que el control. Aquí mostramos los resultados de dos de esos siete líneas. Como eventos transgénicos individuales suelen producir pocas semillas, se desarrolló un método para utilizar un número mínimo de semillas sin dejar de ser capaz de hacer el análisis estadístico paramétrico. Un diagrama de flujo de la preparación de la muestra y la configuración experimental se muestra en la Figura 5 y en la Tabla 1. Aunque la primera generación de semillas transgénicas es típicamente hemizygous, se espera que la célula a célula y movimiento sistémico de pequeños ARN de interferencia (siRNA) generaron a través de la interferencia de ARN debe conferir silenciamiento aflatoxina-síntesis de toda la planta. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> Figura 5. Diagrama de flujo esquemático del método para analizar la eficacia de ARNi en silenciar </strong&gt; Aspergillus genes aflatoxina-síntesis en semillas de maní. Representación gráfica del flujo de trabajo cuando se procesan muestras de maní para la expresión génica o el análisis de aflatoxinas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> RNAi líneas maní 288-72 y 288-74 mostraron presencia del fabricante de seleccionables NPTII cuando se prueba por STN-PCR, las secciones de gel se muestran en la Figura 6 (arriba), las imágenes originales están disponibles de los autores que lo soliciten. El plásmido pCAPD no se utilizó como un control de la transformación ya que codifica repeticiones invertidas de dos genes CMR (resistencia a cloranfenicol) y ccdB (toxina) de efecto desconocido en las plantas. PCR línea de maní negativo 288-9 y otros que pasaron por el proceso de regeneración y se cultivan en las mismas condiciones que las líneas de RNAi, se utilizaron como con negativocontrol. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . Figura 6. Detección de transgénicos y de expresión en tiempo real de RNAi inserto superior: un solo tubo, detección de PCR anidada de líneas de maní transgénicas RNAi-288-72 y RNAi-288-74, plantas positivas. Controles: W (agua), PP (planta positivo), MM (mezcla maestra), p (plásmido p5XCAPD); fracciones 1/2 1/4 1/8 1 / R16 representan 2 veces diluciones de ADN inferior:. Real-Time PCR detección de la expresión del RNAi insertar (conjuntos de cebadores: RT_5X_1, RT_5X_2, como en la figura 1, en ​​la inmadura ( amarillo) y maduro (marrón) cotiledones de líneas transgénicas a las 24 y 48 h de incubación; línea gris: C t = 1. Los histogramas representan los medios y las barras de error estándar (T) de tres muestras biológicascon tres repeticiones técnica. La cuantificación relativa de inserción RNAi se normalizó con respecto a la limpieza de genes actina como control interno y la expresión pliegue comparativo del transgén calculado como se describe en 5.2.2 y 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Para probar la eficacia del control potencial RNAi mediada por la planta huésped de la acumulación de aflatoxina, conidios recién cosechado de Aspergillus flavus NRRL 3357 se aplica sobre la superficie de corte de los cotiledones medio de la cual se habían retirado los embriones y testa (Figuras 3, 4). A. flavus NRRL 3357, por la que el genoma se ha secuenciado y fue la base para el diseño de p5XCAPD, fue proporcionado amablemente por el Dr. Horn en el USDA-ARS-NPRL. La invasión fúngica resultante de la media de cotiledones después de 24, 48 y 72 horas a 30 ° C es espectáculo<html> n en la Figura 4. Las muestras de cotiledones medio inoculadas se recogieron a las 24, 48, 72, 96 h de incubación, y se analizaron para el principal cuatro aflatoxinas B 1, B 2, G 1 y G 2 utilizando UPLC y confirmados por LC-MS ; resultados se muestran en la Figura 6. concentraciones de aflatoxinas se determinaron utilizando un método publicado con modificaciones 36. En 96 horas de incubación, los cotiledones comienzan a desintegrarse debido a la infección por hongos. Línea de RNAi 288-72 mostró niveles significativamente más bajos de aflatoxinas que el control en todas las fechas de muestreo en los cotiledones inmaduros y en la mayoría de las fechas de muestreo en los maduros. Línea de RNAi 288-74 mostró niveles significativamente más bajos de aflatoxinas en la mayoría de las fechas de muestreo. Los niveles de significación de la prueba de Tukey se indican con asteriscos en el gráfico de la Figura 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . Figura 7. Las aflatoxinas B 1 y B 2 en la mitad de los cotiledones de maní después de la incubación (24, 48, 72 y 96 h) con Aspergillus flavus Control: semillas de 288-9 línea no transgénica; RNAi: semillas de RNAi-288-72 y RNAi-288-74, transgénicos para RNAi p5XCAPD para silenciar cinco genes aflatoxina-síntesis. (A) La aflatoxina B 1 en semillas maduras (marrón); (B) La aflatoxina B 2 semillas maduras; (C) La aflatoxina B 1 en las semillas inmaduras (de color amarillo) y (D) La aflatoxina B 2 en las semillas inmaduras. Se representan los valores medios con las barras correspondientes estándar de error (T) de las muestras biológicas duplicados. Diferencias estadísticamente significativas de Tukey test *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. En general, RNAi-288-72 mostró durante todo el experimento (24 y 96 h de incubación), un 94% de reducción de -100% en aflatoxina B 2, y un 90% de reducción de -100% en aflatoxina B 1 en comparación con el control. RNAi-288-74 mostró un 63% de reducción de -100% de la aflatoxina B 2 y el 60% -100% de reducción en la aflatoxina B 1, la Figura 7. Los cebadores usados ​​para la detección de PCR en tiempo real de la expresión del inserto de RNAi se muestran en la Figura 1. Cotiledones de cacahuete de semilla fueron analizados sin embriones, para eliminar sus defensas naturales y ser capaz de detectar el efecto potencial de RNAi en el área más expuesta a la invasión de hongos, los cotiledones. Expresión de la RNAi detecta inserto en cotiledones inmaduros (amarillo) de la línea de 288 a 74 por conjunto de cebadores RT_5X_1 era cuatro veces más de la C T </sub&gt; = 1 umbral del control negativo, y por conjunto de cebadores RT_5X_2 era 19 veces por encima del umbral, todo a 24 h de incubación. Al menos tres de los cinco fragmentos de genes consecutivos utilizados en la transformación de cacahuete, 5027, 7223 y 7228 (aflep, AFLS / aflJ, y AFLC / pksA, respectivamente) fueron detectados por RT-PCR (Figura 1, 6). Expresión de inserción RNAi no se detectó en los cotiledones maduros a las 24 horas, o en los cotiledones maduros o inmaduros de 48 h de incubación, la Figura 6 (abajo). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> Peanut Línea </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Tiempo de muestreo </td><td colspan="3" style="width:192px;"> Las muestras para RT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> Las muestras para el análisis de aflatoxinas (inoculado) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> norteúmero de semillas </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (no inoculado) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td><td style="width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> RNAi (amarillo) </td><td style="width:64px;"> 24 horas </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 horas </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdstyle = &quot;width: 64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 horas </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Controlar </td><td style="width:64px;"> 24 horas </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (amarillo) </td><td style="width:64px;"> 48 horas </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 horas </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Ejemplo de configuración de pequeña muestra para analizar la expresión génica y la acumulación de aflatoxinas en semillas de maní RNAi. Análisis completo de expresión y las aflatoxinas para un grupo madurez (es decir., Amarillo), con tres tiempos de muestreo (24, 48 y 72 h) , por triplicado, requeriría 4.5 semillas, cada número uno en la tabla representa un medio de cotiledones.

Se demuestra un método para el análisis de aflatoxinas y expresión de los transgenes en semillas de maní que contienen señales de interferencia de ARN para silenciar genes aflatoxina-síntesis en el hongo Aspergillus flavus. Control de RNAi mediada de micotoxinas en las plantas no se ha informado anteriormente.

Control de RNAi mediada por aflatoxinas en Maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Patosistema

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

El objetivo general de este trabajo es proporcionar un método confiable, preciso, económico y rápido para probar la eficacia del silenciamiento mediado por ARNi de los genes de síntesis de aflatoxinas de aspergillus en maní transgénico utilizando un número mínimo de semillas, por lo general, se requieren cientos de gramos de semillas para cuantificar efectivamente las aflatoxinas en las muestras. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza menos de cinco semillas para probar un tratamiento en particular 10 días antes de preparar las semillas, establecer un cultivo de aflatoxina positiva para aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 en medio barrena ZAP Pex. Cultiva este cultivo a 25 grados centígrados.Se utilizará para la inoculación de semillas. Después de preparar las plantas transgénicas que expresan el ARNAI, que se detalla en el protocolo de texto, se procede a la recolección de sus semillas. Primero, retire la carpa pérrica usando abrasión de una lavadora a presión configurada a bajo, o raspe la carpa périca con la mano.Una vez que se retira la carpa perí, identifique el color de la carpa meso colocando las vainas en una tabla de madurez en los grupos adecuados. Ahora retire los agujeros y procese las semillas amarillas y marrones por separado. Calcule el número de semillas necesarias para el experimento: al menos tres piezas de semillas, lo que significa que se necesitan tres mitades de coplomo por línea de maní que se muestrea.Cubra el fondo de un vaso de precipitados estéril con una capa de semillas y, a continuación, cubra las semillas con un volumen medido de etanol al 75%. Luego duplica ese volumen. Deje que las semillas se incuben en solución durante 30 segundos y luego enjuáguelas con agua destilada esterilizada.A continuación, trate las semillas con un volumen de hipoclorito al 2% como se hace con el etanol F. Deje que esta incubación continúe durante cinco minutos. A continuación, utilice tres enjuagues en cinco volúmenes de agua destilada esterilizada.Para eliminar el hipoclorito, es fundamental que toda la solución de hipoclorito se lave en este paso. Las semillas ahora están esterilizadas en la superficie. A continuación, hidrata las semillas sumergiéndolas en agua destilada esterilizada durante dos horas preparada para poner las semillas hidratadas en una placa de Petri estéril.Todos los materiales deben estar esterilizados en este punto. Retire las capas de semillas con pinzas, luego separe el cohain. Por último, retira los embriones con un bisturí.Los embriones pueden ser desechados o utilizados para regenerar nuevas plantas. A continuación, corta la oleína por la mitad con un bisturí y sumerge las mitades y el agua destilada esterilizada hasta que estén listas para la inoculación. A continuación, seque el exceso de agua de la mitad de la co-plomo en toallas de papel estériles y coloque los trozos de semilla en platos separados de 1,5% con hendiduras del tamaño de la semilla y meta las semillas en ellas con los lados cortados hacia arriba para inocular las mitades de co plomo.Añadir dos microlitros de una suspensión de 10.000 esporas de aspergillus por microlitro a las superficies de corte. No dejes que la suspensión se corte por los lados de la semilla. Por último, coloque los platos en una incubadora oscura a 30 grados centígrados durante uno a cuatro días hasta que se prueben.Después de un día, después de dos días y después de tres o cuatro días de muestra, las semillas retiran suavemente las mitades inoculadas seleccionadas al azar según sea necesario. Use un pañuelo de papel para limpiar el exceso de esporas y una barrena y coloque la muestra en un vial de vidrio con tapón de rosca. Transfiera las muestras no inoculadas a tubos de dos mililitros para el análisis R-T-P-C-R.Libere las muestras en nitrógeno líquido y almacene las muestras congeladas en un congelador hasta que se procesen. Para el análisis de aflatoxinas, obtenga la media cuna de plomo inoculada en un frasco de vidrio con tapón de rosca de cuatro mililitros si es necesario. La muestra será estable durante muchos meses a menos 80 grados centígrados.Cuando las semillas estén a temperatura ambiente, extraiga la muestra añadiendo cuatro volúmenes de metanol y dejando que los tubos se incuben durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente sin agitación. Al día siguiente, realice primero el UPLC, prepare una mini columna de propileno de 1,5 mililitros con una frita a juego. Luego agregue 200 miligramos de óxido de aluminio.Y a continuación, inserta otra frita. Siguiente posición, vial de muestreador automático A-U-P-L-C debajo y en contacto con la mini columna para minimizar la evaporación. Ahora agregue 0,5 mililitros de extracto de metanol de la muestra a un vaso desechable que no sea de plástico.A continuación, añada 0,5 mililitros de aceto nitrilo al tubo y mezcle las soluciones con una pipeta. Ahora aplique 0,5 mililitros de la mezcla a la mini columna preparada y recoja el EIT utilizando solo la gravedad. Una vez que se recolecta el EIT, conecte rápidamente una tapa séptica al vial de recolección para usar en el UPLC.Coloque los viales en A-U-P-L-C ya preparados con una fase móvil de ensayo de agua, metanol y acedonita. A continuación, cuantifique el contenido de aflatoxinas en los EIT. Consulte el protocolo de texto para obtener más detalles junto con el análisis UPLC.Coloque las piezas de semilla utilizadas para la extracción en viales de vidrio individuales. A continuación, liofilizar los viales durante la noche y medir el peso seco de la muestra de tejido por la mañana para que las concentraciones de aflatoxinas puedan expresarse en nanogramos por gramo de muestra. A continuación, se sacan las muestras del congelador y se añade el triol y se muelen los tejidos congelados con un homogeneizador de molino de bolas a 3.100 RPM durante 40 segundos y se procede a la extracción del ARN, se utilizó un vector de ARN portador de pequeños fragmentos de cinco genes de síntesis de aflatoxinas de un flavis, para transformar las plantas de cacahuete.Los números de identificación corresponden a los números de anotación del genoma del instituto de 99 TRANSFORMANTS regenerados, se clonaron siete líneas positivas de PCR y se analizaron como se describe. Los siete mostraron entre un 60 y un 100% menos de acumulación de aflatoxinas en comparación con las líneas de control. Se presentan los resultados de dos de las siete líneas.Estas dos líneas de RN AI mostraron la presencia del marcador seleccionable NPT dos. De acuerdo con los resultados de S-T-N-P-C-R, el control negativo utilizado fue una línea PCR negativa que pasó por el proceso de transformación para probar la capacidad de las líneas de ARNi para resistir aflatoxinas recién cosechadas de un aflatoxina positivo. Se aplicó una línea flavis NRRL 3, 3, 5, 7 a la mitad de la cuna, plomo, embrión y testa faltantes después de la incubación durante un máximo de 96 horas.Los tejidos inoculados se procesaron utilizando UPLC para medir sus niveles de aflatoxinas como se describe. Estos resultados se confirmaron aún más mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas. En general, el ARNi 2 88 72 mostró una reducción del 94 al 100% en la aflatoxina B dos y una reducción del 90 al 100% en la aflatoxina B uno en comparación con el control.Mientras que el ARNi 2 88 74 mostró una reducción del 60 al 100% en ambas aflatoxinas. Siguiendo este procedimiento, los mismos extractos de semillas se pueden utilizar para analizar phyto Xin con el fin de comprender mejor la respuesta de la semilla a la invasión de hongos. Este método también proporcionará una herramienta única para ayudar a desarrollar la tecnología de ARN para el control de micotoxinas.

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Control de RNAi mediada por aflatoxinas en Maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete / Aspergillus Patosistema (Video) | JoVE Journal

Control de RNAi mediada por aflatoxinas en Maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete /

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