Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

El objetivo general de este procedimiento es producir materiales biomiméticos que consisten en adherencias recombinantes puras, acopladas a perlas de poliestireno, que luego se pueden utilizar para diseccionar las interacciones bioquímicas y funcionales entre las adherencias bacterianas individuales y los receptores de la célula huésped. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones entre el huésped y el patógeno, como la medición de los efectos sobre la señalización de la célula huésped y la inhibición de la citotoxicidad mediada por el patógeno. La principal ventaja de esta técnica es que las adherencias purificadas, un AEA se acopla direccional y covalentemente a partículas de polímero que son similares en tamaño a las bacterias y, por lo tanto, imitan la visualización de la superficie bacteriana.

Demostrando el procedimiento conmigo estará TU A-C-E-D-A Estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Aquí se demostrará el acoplamiento direccional de la amina thal. Este protocolo es adecuado para el acoplamiento de proteínas que contienen cistina a perlas de polímero funcionalizadas con amina utilizando succinil SUL para butirato de fenilo p meli, o SMPB Como agente de reticulación, prepare todos los reactivos necesarios justo antes de su uso, como se describe en el texto del protocolo, para comenzar el procedimiento de activación de perlas.

Mezcle una suspensión de cuentas invirtiendo suavemente y luego transfiera la cantidad requerida de suspensión de cuentas a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Contiene un mililitro de PBS estéril pH 7.0 pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar las perlas y el pellet por centrifugación en una microcentrífuga. Enorme retire con cuidado el hocico con una pipeta y una cicatriz.

Reese suspenda el pellet de perlas en un mililitro de PBS fresco y estéril y repita el paso de lavado. Vuelva a suspender la bolita de cuentas. En 0,8 mililitros de PBS agregue 200 microlitros de SFO SMPB de 10 milimolares recién preparados.

Para obtener una concentración final de dos milimolares, incube la suspensión de perlas durante una hora a 25 grados centígrados en una rueda giratoria mientras se incuban las perlas. Prepare la proteína para el siguiente paso de acoplamiento, de modo que pueda agregarse inmediatamente a las perlas activadas. Compruebe la concentración de proteínas y ajústela a la concentración final requerida para la reacción de acoplamiento. Seis.

Para la reducción de proteínas se suelen utilizar micromolares de proteínas y PBS y un volumen de un mililitro. Agregue una solución madre de TEP para obtener una concentración final de cinco milimolares. Incubar la solución durante 30 minutos A temperatura ambiente, conserve unos pocos microlitros de la solución proteica para determinar la concentración inicial de proteína y calcular la eficiencia del acoplamiento.

Inicie el procedimiento de acoplamiento de proteínas granulando las perlas activadas y lavando la pellet. Una vez en un mililitro de PBS fresco y estéril, vuelva a suspender el pellet en la solución de proteína preparada para obtener la concentración de proteína deseada. Incubar la suspensión de perlas de proteína durante dos horas a 25 grados centígrados en una rueda giratoria Después de dos horas, desactivar los grupos activados restantes en las perlas añadiendo una solución madre de Sixtina a una concentración final de 50 milimolares e incubando en suspensión durante 30 minutos a 25 grados centígrados en una rueda giratoria.

Sujetó las cuentas por centrifugación. Guarde el snat para determinar la concentración de proteínas y calcular la eficiencia del acoplamiento. Lave el pellet de perla dos veces con un mililitro de PBS y Resus bend y un mililitro de PBS fresco para dar el producto final un día antes de la competencia, siembre cada pocillo de una placa de 24 pocillos con un mililitro de células de hela a una concentración de 150, 000 células por mililitro.

Esto permitirá que las células alcancen aproximadamente el 80% de fluidez antes de comenzar el experimento. Inocular un cultivo de LB marino de cinco mililitros con una colonia fresca de V para hemolítico y cultivar durante la noche a 30 grados centígrados con agitación. Prepare suficiente molécula de adhesión multivalente acoplada a cordones como se demostró anteriormente.

Permita 100 microlitros de 10 x stock de perlas por pocillo o una concentración final de 500 nanomolares de proteína el día del ensayo de competencia. Mida el OD 600 del cultivo bacteriano. Prepare los medios de infección diluyendo los cultivos bacterianos en DMM incoloro sin aditivos.

Precalentar a 37 grados centígrados que contiene 10%volumen a volumen de la suspensión. Para dar un MOI de 10, prepare un mililitro por pocillo y un 10 a 20% de volumen excesivo por muestra. Retire el medio viejo de los pozos y lave el cultivado.

Cure las células agregando a cada pocillo un mililitro de PBS estéril precalentado a 37 grados Celsius. Retire el PBS y agregue un mililitro de medio de infección por pocillo. Agregue soluciones que contengan perlas de control y bacterias como controles positivos y perlas de adhesión y sin bacterias como negativas. Mandos.

Agregue DMM que contenga 0.1%TRITTON X 100 como controles de lisis. Configure cada condición experimental, incluidos los controles, por triplicado. Incube la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado.

Se evalúa la citotoxicidad. Cuatro horas después de la infección. Retire 200 microlitros de cada pocillo utilizado en la placa de 24 pocillos y transfiéralos a una nueva placa de 96 pocillos.

Gire la placa de 96 pocillos a 1.500 g durante cinco minutos y transfiera 100 microlitros de cada pocillo a una placa nueva de 96 pocillos. Agregue 100 microlitros del medio utilizado durante los experimentos de infección a tres pocillos frescos de la placa de 96 pocillos que se usarán como blancos. Realice el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa utilizando un kit de detección de citotoxicidad LDH y siguiendo las instrucciones del fabricante.

En primer lugar, calcule la cantidad de reactivo necesaria en incrementos de 25. Por ejemplo, para 100 muestras. Mezclar 11,25 mililitros de reactivo A con 250 microlitros de reactivo B invertir para evitar la formación de espuma, no hacer vórtice.

A continuación, pon la mezcla en un depósito. A continuación, añada 100 microlitros de la mezcla de reactivos a cada muestra e incube la placa a temperatura ambiente a los 10, 20 y 30 minutos. Lea la absorbancia a 490 nanómetros en un lector de placas.

Posteriormente, se calcula el porcentaje de citotoxicidad como se describe en el manuscrito, las mediciones de la adhesión bacteriana se realizan una hora después de la infección. Retire el medio de la capa celular y lave a fondo la capa celular con PBS precalentado estéril para eliminar las células no adheridas. Lave al menos tres o cuatro veces con un mililitro de PBS cada vez que se lide a las células huésped agregando a cada pocillo un mililitro de una solución estéril de Triton X 100 al 1% de volumen a volumen en PBS e incube la placa a 37 grados Celsius durante cinco minutos.

Pipetear cada muestra hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de transferir el contenido de cada pocillo para separarlo. Tubos de 1,5 mililitros. Prepare diluciones en serie diez veces mayores de las muestras en una placa de PBS estéril, 100 microlitros de cada muestra en agar LB marino y extiéndalo utilizando un esparcidor de celdas, optimice qué dilución en placa en función de las cepas bacterianas y el momento de esta configuración experimental.

Una dilución de 10 a la quinta o de 10 a la sexta dará un número adecuado de UFC. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche del día siguiente, enumerar las bacterias por recuento de colonias. En los ensayos de competencia, las células del talón se infectaron con la cepa V para hemolítica.

Pobre indicado con positivo o no infectado en presencia de diferentes entidades competidoras. La infección in vitro con una mala resultó en niveles muy altos de lisis celular que fue inhibida por MAM siete perlas acopladas, pero no por MA'AM una perlas acopladas o GST. Enumeración de v paralítico adherido a células HELOC no tratadas o células incubadas con MAM.

Siete cuentas de control MAM one o GST revelaron que MAM. Siete cuentas, pero no una MAM o cuentas de control GST. Supera a la hemolítica v para la unión a los receptores de la superficie de la célula huésped.

Adherencias acopladas al flúor. Cuatro perlas marcadas pueden imitar la adhesión bacteriana a las células huésped y son herramientas poderosas para la obtención de imágenes celulares. El tubo de la derecha contiene una suspensión de perlas biomiméticas de color azul fluorescente. Mam.

Se utilizaron siete perlas azules fluorescentes acopladas para caracterizar el proceso de unión mediada por MAM siete a las células epiteliales. La unión de MAM siete a las células huésped dio lugar a reordenamientos de actina y formación de fibras de estrés que se covisualizaron utilizando Rumine Phin para teñir la factina. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la purificación por afinidad junto con la proteómica o el western blot, con el fin de responder a preguntas adicionales, como qué factores celulares del huésped están involucrados en los procesos de señalización aguas abajo de la unión bacteriana.