Name: Una célula de ensayo libre para el Estudio de la cromatina descondensación en la final de la mitosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Aprende a reconstituir la descondensación de cromatina mitótica mediante un ensayo libre de células utilizando extracto de huevo de Xenopus laevis y cromatina de células HeLa. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de la regulación cromatínica.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana para la Investigación y el ERC (AN377 / 3-2 y 309528 CHROMDECON a WA) y un doctorado Comunidad del Boehringer Ingelheim Fonds de AKS Figura 1 y 2 están reimpresos de Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., función ATPasas RuvB-como en descondensación de la cromatina en el final de la mitosis, 305-318, 2014, con el permiso de Elsevier.

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<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Xenopus laevis extractos de huevo son una herramienta muy útil para reproducir fielmente los procesos celulares in vitro, y este sistema fue utilizado con éxito en la caracterización de ciclo celular y la división celular eventos 2, 3,5,6,17. Debido a las grandes tiendas de componentes nucleares secuestradas en el huevo durante la ovogénesis, extractos de huevo son una excelente fuente de los componentes celulares. En comparación con otros enfoques como RNAi en líneas celulares de...

Extracto de huevo Xenopus laevis es una herramienta poderosa y ampliamente aplicada para estudiar eventos celulares complicados en la simplicidad de un ensayo libre de células. Desde su primera descripción por Lohka y Masui 1 se han utilizado ampliamente para estudiar procesos mitóticos tales como la condensación de la cromatina 2, conjunto de husillo 3, la envoltura nuclear desglose 4, sino también el transporte nucleocytoplasmic 5 o 6 replicación del ADN. Los eventos que tienen lugar al final de la mitosis, necesarios para la reforma del núcleo interfásico tales como reforma envoltura nuclear y de poro nuclear reensamblaje complejo son mucho menos comprendido en comparación con los primeros eventos mitóticas, pero pueden ser estudiadas de manera similar utilizando extracto de huevo de Xenopus 7. Hemos establecido recientemente un ensayo basado en extracto de huevo de Xenopus para estudiar descondensación de la cromatina en el final de la mitosis 8, un proceso de bajo-investigado que i esperats caracterización detallada. En metazoos, la cromatina se condensa altamente en la entrada mitótica el fin de realizar fielmente la segregación del material genético. Para asegurar que la cromatina es accesible para la expresión génica y la replicación del ADN durante la interfase, necesita ser compactado DE AT el final de la mitosis. En los vertebrados, la cromatina es hasta cincuenta veces más compactado durante la mitosis en comparación con la interfase 9, en contraste con las levaduras, donde la compactación mitótico es generalmente mucho más baja, por ejemplo, sólo dos veces en S. cerevisiae 10. Descondensación de la cromatina vertebrado se ha estudiado principalmente en el contexto de la reorganización de ADN de esperma después de la fertilización del huevo. Un mecanismo molecular, en el que nucleoplasmin, una proteína abundante ovocito, intercambia protaminas-esperma específica a las histonas H2A y H2B almacenados en el huevo. Este proceso también fue dilucidada mediante Xenopus extracto de huevo 11, 12. Sin embargo, la expresiónde nucleoplasmin se limita a los oocitos 13 y la cromatina mitótica no contiene estos protaminas-esperma específico. Por lo tanto la cromatina descondensación al final de la mitosis es independiente nucleoplasmin 8. Para la reacción descondensación in vitro empleamos extracto generado a partir activados huevos X. laevis y clusters cromatina aislados de células HeLa sincronizados. El tratamiento de los huevos con un ionóforo de calcio imita la liberación de calcio en el ovocito generada por la entrada de espermatozoides durante la fertilización. La ola de calcio desencadena el reinicio del ciclo celular y el huevo, detenido en la segunda metafase de la meiosis, avanza a la primera interfase 14. Por lo tanto, los extractos de huevos preparados de forma activa los huevos representan el estado de salida / interfase mitótica y son competentes para inducir eventos específicos para la salida de mitosis como descondensación cromatina, envoltura nuclear y poros reforma compleja. Para el aislamiento de ch mitóticoromatin grupos se utilizó una versión ligeramente modificada del protocolo publicado por Gasser y Laemmli 15, donde grupos de cromosomas son liberadas por la lisis de las células HeLa sincronizados en la mitosis y aislados en poliaminas que contiene tampones por centrifugaciones gradiente.

<table><tbody><tr><td>tetraclorhidrato de espermina</td><td>Fluka analítico</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>triclorhidrato de espermidina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>digitonina de alta pureza</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td> tóxico <td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td></td></tr><tr><td>timidina</td> tóxica <td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>nocodazol</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>solución tóxica</td></tr><tr><td>de formaldehído al 37%</td><td>Roth</td><td>7398-1</td> solución <td>tóxica</td></tr><tr><td>de azul de tripano (0,4% )</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>1,4-ditiotritol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF clorhidrato</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>pepstatina</td><td>Roth</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Roth</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (partículas de sílice coloidal solución)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&sup2; matraces de cultivo de tejidos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino inactivado por calor (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador (triturador de tejidos de 40 ml)</td><td>Cámara Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer</td><td>Assistent</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tubos de centrífuga Oak Ridge, policarbonato (50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; Filtro de células m, nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>citocalasina B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td> tóxica <td>Roth</td><td>8682.3</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td> tóxica <td>Merck</td><td>1,028,381,000</td><td></td></tr><tr><td>hCG disponible como Ovogest</td><td>MSD</td><td>1431593</td><td></td></tr><tr><td>PMSG disponible como Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (mezcla de calcio-magnesio-sal)</td><td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td></td></tr><tr><td>agujas de jeringa tóxicas (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>creatina fosfato sal disódica</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>creatina fosfoquinasa</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Tubos</td><td></td> de centrifugación tóxicos Roche 10236276001 <td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>para TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 pulg.)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (puntas con amplia apertura, 1.000 y micro; l)</td><td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>solución de glutaraldehído al 50%, grado I</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 ml</td><td>de solución tóxica</td></tr> de <tr><td>poli-L-lisina al 0,1% (p/v)</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>tubos de fondo plano (6 ml, 16,0/55 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield medio de montaje</td><td>Laboratorios vectoriales</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>tubos para TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 pulg.)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (puntas con amplia apertura, 200 &micro; l)</td><td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de 12 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

una célula de ensayo libre para el estudio de la cromatina descondensación en la final de la mitosis

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Durante el ciclo celular de los vertebrados, la cromatina experimenta extensos cambios estructurales y funcionales. Al entrar en la mitótica, se condensa masivamente en cromosomas en forma de bastón que son movidos individualmente por el aparato fusiforme mitótico. La condensación mitótica de la cromatina produce cromosomas compactados cincuenta veces más densos que en la interfase. Durante la salida de la mitosis, los cromosomas tienen que restablecer su estado funcional de interfase, que está encerrado por una envoltura nuclear y es competente para la replicación y la transcripción. El proceso de descondensación está morfológicamente bien descrito, pero en términos moleculares es poco conocido: carecemos de conocimiento sobre los eventos moleculares subyacentes y, en gran medida, sobre los factores involucrados, así como sobre su regulación. Describimos aquí un sistema libre de células que recapitula fielmente la descondensación de la cromatina in vitro, basado en grupos mitóticos de cromatina purificados a partir de células HeLa sincronizadas y extracto de huevo de X. laeivis. Nuestro sistema sin células proporciona una herramienta importante para una mayor caracterización molecular de la descondensación de la cromatina y su coordinación con los procesos que ocurren simultáneamente durante la salida mitótica, como la envoltura nuclear y el reensamblaje del complejo de poros.

Dependencia del tiempo de la reacción descondensación La figura 1 muestra un curso de tiempo típico de ensayo de la descondensación. El grupo de cromosomas visibles al comienzo de la reacción decondenses y se funde en una sola, redondo y el núcleo suave. Cuando el extracto de huevo se sustituye por sacarosa amortiguar el clúster cromosoma sigue siendo condensada, lo que sugiere que la actividad descondensación está presente en el extracto de huevo. <p class="jove_content...

Los mecanismos moleculares de la descondensación de la cromatina mitótica altamente compactada están mal definidos. Presentamos un ensayo libre de células basado en clústeres de cromatina mitótica aislados de células HeLa y extracto de huevo de Xenopus laevis que reconstituye fielmente el proceso de descondensación in vitro.

Una célula de ensayo libre para el Estudio de la cromatina descondensación en la final de la mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

El objetivo general de este experimento es reconstruir fielmente la descondensación de la cromatina tal como ocurre al final de la mitosis, en la simplicidad de un ensayo libre de células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de investigación de la mitosis, ya que permite la caracterización del mecanismo molecular de la cromatina, la descondensación y la identificación de los factores implicados en su regulación. La principal ventaja de esta técnica es que puede manipularse fácilmente desde el punto de vista bioquímico y la cromatina. La descolonización puede estudiarse de forma aislada, separada de otros eventos del ciclo celular. Para comenzar, aísle los racimos de cromatina mitótica de células HeLa y prepare los tampones para la preparación del extracto de huevo de Xenopus laevis IIC según se describe en el protocolo de texto adjunto. Una vez preparado, use una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 27 para inyectar 500 unidades internacionales de gonadotropina coriónica humana en ranas con ovulación inducida.Inyecte las ranas bajo la piel del saco linfático dorsal la noche anterior al experimento para inducir la liberación de los óvulos. Una vez inducidas, mantenga las ranas a 18 grados Celsius durante 13 a 17 horas en tanques individuales que contengan 1,2 litros de solución salina de Ringer modificada de Mark. Después de que las ranas pongan sus huevos, retire los óvulos ya activados junto con cualquier huevo de aspecto deficiente. Recójalos vertiendo el contenido de los tanques en vasos de precipitados de vidrio de 600 a 1000 mililitros correctamente.La clasificación de los huevos es fundamental, ya que la calidad general depende de este paso. Retire los huevos activados, filamentosos o con aspecto anormal. Además, en pasos posteriores, continúe eliminando los huevos defectuosos.Vierta el sobrenadante S una vez que los huevos se asienten y luego rellene el vaso con tampón fresco. Repita este proceso cuatro veces para lavar los huevos tras el último lavado. Elimine el sobrenadante una vez más y luego llene el vaso con una solución de L-cisteína al 2 % para delinear los huevos.Después de dos a cuatro minutos, cambie a tampón fresco que contenga L-cisteína. Considere que la desgelatización está completa cuando el volumen de los huevos disminuya drásticamente y los huevos se vuelvan más densamente empaquetados tras aproximadamente cinco a siete minutos. A continuación, lave cuidadosamente los huevos en tampón de Ringer modificado por Mark, decantando y rellenando el tampón inclinando el recipiente sobre la pared del vaso en lugar de verterlo directamente sobre los huevos.Luego active los huevos en 100 mililitros de tampón de Ringer modificado por Marx que contiene ocho microlitros de dos miligramos por mililitro de ion calcio. Cuatro, detenga la activación cuando se vuelva visible la contracción del casquete animal.O después de 10 minutos tras la activación, lave cuidadosamente los huevos en solución salina modificada de Ringer de Mark, eliminando el sobrenadante y rellenando nuevamente con la solución salina modificada de Ringer de Mark tras el último lavado. Incube los huevos a temperatura ambiente durante 20 minutos en solución salina modificada de Ringer de Mark. A continuación, prepare tubos de centrifugación de cinco mililitros con 50 microlitros de tampón de sacarosa y 50 microlitros de inhibidor de proteasas a 100 veces su concentración.Mezcle cinco microlitros de DTT uno molar, 12,5 microlitros de ciclo heida y 2,5 microlitros de citocromo B. Lave los huevos dos veces con tampón de sacarosa frío y luego transfiéralos a los tubos de centrifugación. Utilizando una pipeta Pasteur de plástico con una abertura ancha, compacte los huevos centrifugando los tubos durante un minuto a 130 ×g. Tras la centrifugación, elimine el tampón en exceso usando una pipeta Pasteur de plástico y rellene el espacio adicional con más huevos.Luego, centrifugue los tubos llenos de huevo en un rotor oscilante de seis por cinco mililitros durante 20 minutos a cuatro grados Celsius y 21.000 veces g. Con la solución ahora separada en tres capas, inserte una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 16 a través del costado del tubo y hasta la capa intermedia entre la yema amarilla en la parte superior y justo por encima de los restos oscuros de huevo roto en la parte inferior. Transfiera el extracto fásico de baja velocidad a un tubo nuevo sobre hielo y luego agregue 10 microlitros de un inhibidor de proteasa 100 veces más concentrado.Mezcle un microlitro de DTT un molar, 2,5 microlitros de cicloheximida a 20 miligramos por mililitro y 0,5 microlitros de citocalasina B. Añada 10 miligramos por mililitro a cada mililitro del extracto de baja velocidad. Centrifugue el extracto fásico de baja velocidad durante 12 minutos a 355.000 ×g en un rotor de 10 por 2 mililitros. Luego retire cuidadosamente la capa lipídica superior y transfiera el sobrenadante que contiene el extracto de alta velocidad a un tubo nuevo.Este paso es fundamental para obtener una muestra de alta calidad. Tenga cuidado de que el líquido eliminado no contenga contaminaciones provenientes de la capa lipídica superior o de la molesta capa inferior. Pipete 18 microlitros del extracto de alta velocidad en un tubo de reacción de 1.5 mililitros y luego agregue 0.5 microlitros de glicógeno y 0.5 microlitros de la mezcla de energía.3 µL de seis dimetil purina y 0,7 µL de los grupos mitóticos. Utilice puntas con abertura ancha para mezclar la reacción tan pronto como se agregue la cromatina, con el fin de evitar la ruptura de la cromatina en descomposición. Una vez mezclado, incube la mezcla de reacción hasta dos horas a 20 °C.Luego fije la muestra añadiendo 0,5 mililitros de fijador frío que contiene 4% de paraformaldehído, 0,5% de glutaraldehído y 0,1 miligramo por mililitro de dpi. Incube la muestra en hielo durante 20 a 30 minutos utilizando puntas con una abertura ancha. A continuación, cubra las laminillas redondas de 12 milímetros con una solución de poli-L-lisina al 0,1% peso en volumen e incube las laminillas durante cinco minutos para aumentar la afinidad de las mismas.Para el cromatina, seque las laminillas sobre papel filtro después. Una vez secas, agregue las laminillas recubiertas al fondo de tubos de centrifugación de fondo plano de seis mililitros, de modo que el lado recubierto quede hacia arriba. Luego, agregue 800 microlitros del cojín de sacarosa al 30 % y coloque cuidadosamente toda la muestra fijada encima.Centrifugar la muestra durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y 2.500 × g. A continuación, desechar el sobrenadante S y retirar las laminillas de los tubos introduciendo cuidadosamente una aguja de calibre 16 por la parte inferior del tubo de centrifugación. Cuando la laminilla quede levantada por un lado debido a la aguja, utilizar pinzas para extraerla, lavarla rápidamente sumergiéndola en agua desionizada y luego secarla suavemente tocando su lateral con papel de filtro. A continuación, colocar una gota de medio de montaje sobre un portaobjetos y colocar la laminilla con el lado de la muestra hacia abajo.Coloque el portaobjetos sobre el medio de montaje. Seque suavemente la cubeta con una toallita de papel y selle alrededor del borde de la cubeta con esmalte de uñas; mantenga el portaobjetos en la oscuridad hasta que se realice la imagen. A continuación, se muestra el curso temporal típico del ensayo de descompensación.El grupo de cromosomas visible al inicio de la reacción, decon, se condensa y se fusiona en un único núcleo redondo y liso. Cuando el extracto de huevo se reemplaza por tampón de sacarosa, el grupo de cromosomas permanece condensado, lo que sugiere que la actividad de descompensación está presente en el extracto de huevo. En el experimento mostrado aquí, se añadieron análogos de A TP o GTP no hidrolizados a la reacción.Estos dos aditivos inhiben la descondensación, lo que demuestra que este proceso activo depende tanto de la hidrólisis de ATP como de GTP. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente dos horas para la preparación del extracto de huevo a nivel Singapur, y en tres horas para el ensayo de promoción de la descolonización. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el éxito depende críticamente de la calidad del extracto.Especially para depleciones inmunes, se recomienda utilizar extracto recién preparado siguiendo este procedimiento. Otros métodos como depleciones inmunes y la adición de proteínas recombinantes pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como qué factores están involucrados. Esta técnica allanará el camino para que los investigadores en los campos de la mitosis o la estructura y función nucleares exploren la desetilación de la cromatina tal como ocurre al final de la mitosis en células animales.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar extractos de hígado de Xenopus y cómo aplicar el método para reconstituir la descolonización de la cromatina. No olvide que trabajar con paraformaldehído, hidracina y DARPA puede ser peligroso, y se deben tomar precauciones, como el uso de guantes.

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