Name: Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Aprende a evaluar la interacción de bacterias anaerobias con células huésped usando Porphyromonas gingivalis. Este protocolo permite medir la invasión bacteriana y visualizar mecanismos de supervivencia microbiana in vivo.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Hiroshi Miyazaki, al Dr. Scott Henderson, al Dr. Todd Kitten, al Dr. Justin Hutcherson, a la Dra. Catherine Jauregui y a Collin R. Berry. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH NIDCR R01DE016124, R01DE018039 y R01DE023304 a J.P. Lewis.
Microscopía se realizó en el Centro de Microscopía del Departamento de Anatomía y Neurobiología de la VCU, financiada, en parte, con fondos de la subvención central del Centro NIH-NINDS (5P30NS047463).

Los siguientes protocolos se describen métodos para el cultivo y el estudio de la invasión por las especies anaerobias, P. gingivalis; sin embargo, estos protocolos pueden ser utilizados para una serie de patógenos anaerobios. Aunque se utilizan HUVECs, este protocolo puede ser utilizado para otras células eucariotas, tanto inmunes y no inmunes. 1. anaeróbico Cámara de uso y mantenimiento Nota: P. gingivalis es un anaerobio sensible a los niveles normales de oxígeno encontrado en el aire ambiente. Un ambiente anaeróbico controlado es vital para el cultivo de P. gingivalis. <ol><li> Aquí, mantener una atmósfera artificial designado como gas anaeróbico mixta (80% N 2, 10% H 2, 10% de CO 2) en una cámara anaeróbica de vinilo (Figura 1A). Utilice una esclusa de aire (Figura 1B) para la transferencia de los artículos en el entorno del laboratorio a la cámara anaeróbica. La esclusa de aire opera manualmente, twpurga hielo con gas N2 antes de introducir el gas anaeróbico mixta. </li><li> Utilice una columna de eliminación de sulfuro de hidrógeno (Figura 1C) para la eliminación libre de mantenimiento del sulfuro de hidrógeno indeseable. Coloque un deshumidificador dentro de la cámara para eliminar el H 2 O creado por el catalizador y para evitar los aerosoles que facilitan la dispersión de la contaminación. Nota: El sulfuro de hidrógeno es un subproducto metabólico natural de muchas bacterias anaerobias y su acumulación es tóxico para las bacterias y puede resultar en el daño a la electrónica y disminuir el tiempo de vida de un catalizador. </li><li> Utilice una caja de ventilador para hacer circular la atmósfera de la cámara a través de un catalizador de paladio, que elimina el oxígeno en presencia de hidrógeno (Figura 1D). Nota: Un atmosférica (HEPA) elimina la recirculación de contaminantes en el aire con un tamaño de 0,22 micras o más grandes. </li><li> Bacterias anaerobias Cultura en una incubadora a 37 ° que se encuentra dentro del anaeróbicocámara. Utilizar técnicas asépticas estándar cuando se trabaja dentro de la cámara anaeróbica. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figura 1. cámara anaeróbica de vinilo y sus componentes. (A) una cámara anaeróbica de vinilo sellada completamente de oxígeno atmosférico proporciona espacio de trabajo para dos personas a la vez (32 x 78 en in). Contiene una incubadora a 37 ° C (media de la espalda). (B) Una esclusa de aire se utiliza para la transferencia de los artículos en el entorno de laboratorio a la cámara anaeróbica. En la foto, una esclusa de aire automático operado a través de un controlador que puede ser programado para realizar automáticamente los procedimientos de vacío y purga necesarios para crear un ambiente anaerobio. (C) Un sulfuro de hidrógeno Columna Remoción proporciona la eliminación de gran capacidad sin necesidad de mantenimiento de sulfuro de hidrógeno indeseable. (D) Dos cajas de ventiladores catalizador soncolocado en toda la cámara anaeróbica para ayudar a circular la atmósfera de la cámara a través de catalizador de paladio, el cual, en presencia de hidrógeno, elimina el oxígeno. La cámara anaeróbica está configurado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. Preparación de bacterias anaerobias Nota: P. gingivalis es aerotolerant y puede ser almacenado en condiciones aeróbicas pero no va a crecer en la presencia de oxígeno a niveles superiores a 6% 17,18. Una cámara anaeróbica es necesario para el cultivo apropiado de P. gingivalis y otras especies anaerobias (Figura 1). Se requiere capacitación adecuada y la educación sobre el uso de cámara anaeróbica antes de trabajar con microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrar todos los medios líquidos y placas a Condit anaeróbicoiones durante al menos 12 horas antes de la experimentación para eliminar el oxígeno residual. </li><li> Traslado P. gingivalis desde -80 ° C congelador para cámara anaeróbica, permiten deshielo. </li><li> Streak P. gingivalis en placas de agar sangre tripticasa de soja (TSA II con 5% de sangre de oveja). Envuelva las placas en parafina y se almacena a 37 ° C en una incubadora anaeróbico durante 4-7 días. </li><li> Inocular P. gingivalis en 3 ml de infusión de cerebro corazón (BHI) suplementado con hemina y menadiona, un enriquecidos medios líquidos no selectivos para el aislamiento y cultivo de anaerobios y microorganismos exigentes, utilizando bucles estériles. Nota: Para el almacenamiento a largo plazo, mezclar cultivos bacterianos preparados en BHI con glicerol o DMSO (concentración final 10 a 20%), y meterlo en un congelador a -80ºC. </li><li> Preparar un cultivo iniciador de P. gingivalis haciendo una dilución 1:10 y permitiendo que las bacterias crecen hasta la fase semilogarítmica. </li></ol> Nota: La densidad óptica de la bacsuspensión terial se determina y la concentración bacteriana para cada cepa ser examinado se ajusta. Para P. gingivalis una suspensión a una DO 660 de 0,7 corresponde a la fase semilogarítmica y ~ 7 x 10 8 células / ml. Las condiciones de crecimiento descritas en el protocolo anterior son específicos para P. gingivalis y pueden necesitar ser adaptado para otras cepas bacterianas. 3. Cultivo Celular Endotelial Nota: Compra agruparon HUVECs primarias y cultivo en medio basal que contienen factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a 37 ° C en 5% de CO 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> HUVECs de semillas en matraces T-75 en 2.5 x 10 5 células / matraz de 15 ml en los medios de comunicación VEGF. Nota: Consulte la viabilidad a través de una dilución 1: 1 con 4,0% de azul de tripano. Las células con una membrana comprometida retendrá azul tripán, aparecerá blanco células sanas con membranas intactas cuando se observa bajo un microscopio óptico binocular. CounT 100 células, asegúrese de que más del 80% de las células son viables 20. </li><li> Reemplace los medios cada 2 días con pre-calentado medios VEGF fresca hasta que las células alcanzan ~ 80% de confluencia. </li><li> Lavar las células una vez con PBS pre-calentado. Libera a las células del matraz T75 mediante incubación con 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 5 min seguido de una solución neutralizante 2 ml de tripsina. </li><li> Recoger HUVECs en suspensión en un tubo cónico de 50 ml. Lavar las células adicionales de T-75 frascos con PBS y transferir a 50 ml tubos cónicos. </li><li> Células centrifugar a 200 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante, suspender el sedimento celular en 10 ml de medio de VEGF pre-calentado. </li><li> Determinar la concentración de células utilizando un hemocitómetro o un dispositivo de recuento de células similar. </li><li> Calcular la cantidad de suspensión celular para agregar a cualquier placa de 6 pocillos (400.000 / pocillo) o una placa de 12 pocillos con cubreobjetos (50.000 / pocillo). HUVECs estará listo para la experimentación el día siguiente. </li></ol> 4. Supervivencia ensayo de invasión / Interacción(Enchapado) Nota: Al realizar este ensayo, se preparan dos placas de 6 pocillos de células endoteliales sembradas a 400.000 células / pocillo. Una placa se usa para evaluar las bacterias unidas a y internalizados por células huésped. La otra placa dará cuenta de bacterias intracelulares. La placa de 6 pocillos permite triplicados de dos muestras que se realizan en un solo experimento. Para una descripción de este protocolo por favor refiérase al diagrama de flujo ensayo de supervivencia (Figura 2). <ol><li> Preparar las bacterias anaerobias como se describió anteriormente (véase la sección 1) hasta que alcancen un crecimiento semilogarítmica (OD 660 0,5-0,7). </li><li> Bacterias centrifugar a 5000 xg durante 10 min. Nota: Si centrífuga es cámara anaeróbica exterior, llevar muestras de bacterias en un tubo de 15 ml cerrado herméticamente, envuelva la tapa con parafilm para evitar la fuga de oxígeno. </li><li> Coloque granulado P. gingivalis atrás en la cámara, se descarta el sobrenadante. Lavar con PBS, las bacterias de pellets de nuevo antes de la resuspensión de VEGF mídia. Preparar suspensiones para todas las cepas bacterianas a ensayar a una DO 660 de 0,7 que corresponde a la fase semilogarítmica (~ 7 x 10 8 células / ml). Las bacterias están ahora listos para la infección. </li><li> Transferencia de placas de 6 pocillos que contienen HUVECs de cultivo de tejidos incubadora en la cámara anaeróbica. Retire los medios de comunicación y lavar tres veces con PBS anaeróbico. Añadir 2 ml de medio anaeróbico VEGF a cada pocillo y colocar las placas a 37 ° C en la incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar la temperatura para la infección. Nota: Las bacterias de la placa sobre placas de agar sangre para garantizar las utilizadas para la infección son homogéneos y no contaminada tras la infección. </li><li> Infectar células huésped con bacterias a una multiplicidad de infección (MOI: bacterias anfitrionas) de 100: 1. Nota: el número de células HUVEC se determina mediante la realización de una prueba de exclusión tripano en un solo pozo antes de la infección. El número de células bacterianas se determina mediante densidad óptica (por ejemplo, OD de 0,5 x 5 = 10 8 células / ml). segundoconcentración acterial se ajusta a MOI adecuado basado en la concentración HUVECs 21. </li><li> Colocar placas de 6 pocillos con HUVECs infectadas en incubadora anaeróbica y permiten que las bacterias interactúan con las células huésped durante 30 min. </li><li> Preparar saponina en BHI (1,0% w / v) dentro de la cámara anaeróbica y filtrar a través de un filtro de 0,2 micras. </li><li> La supervivencia de ambas bacterias adheridas y internalizados. <ol><li> Retire las placas de la incubadora, los medios de aspirado, lavado tres veces con PBS y anaeróbico añaden 2 ml filtran 1,0% saponina (preparado como se describe en el paso 4.8). Incubar durante 15 min para permitir la lisis de la célula huésped. </li><li> Raspar el fondo de cada pocillo con rascador de células. Recoger la mezcla de células de cada pocillo y hacer una dilución 1: 1 en BHI. </li><li> Proceda a realizar diluciones seriadas de la muestra. Dependiendo de las especies bacterianas y concentración, ajuste diluciones en serie. Comience con 1: 100 o 1: 1000 diluciones. </li><li> Placa 200 l de la dilución deseada sobre placas de agar sangre. Wrap tél placas en parafina y el lugar en la incubadora anaeróbica a 37 ° C. </li><li> Después de siete días de incubación a 37 ° C, retirar las placas y contar unidades formadoras de colonias (UFC) utilizando una caja de luz para contar manualmente colonias. Nota: UFC se enumeran. Para cantidades más grandes de UFC, las imágenes pueden ser tomadas y los programas informáticos se pueden utilizar para facilitar el recuento de UFC. </li></ol></li><li> La supervivencia de las bacterias internalizadas. <ol><li> Retire las placas de la incubadora. Lavar tres veces con PBS anaerobio y añadir 2 ml de medios suplementados con VEGF antibióticos (300 g / ml de gentamicina y 400 g / ml de metronidazol). </li><li> Incubar durante 1 hora. Asegúrese de probar los antibióticos por lo que son 100% eficaz en matar la cepa bacteriana deseado y asegurarse de que no penetran en las células huésped 22,23. </li><li> Aspirar los medios de comunicación, añadir 2 ml de filtrada 1,0% saponina. Incubar durante 15 min para permitir la lisis de la célula huésped. </li><li> Raspe parte inferior de cada well con rascador de células. Recoger la mezcla de células de cada pocillo y hacer dilución 1: 1 en BHI. </li><li> Preparar diluciones seriadas de la muestra (1: 100, 1: 1000). </li><li> Placa 200 l de la dilución deseada sobre placas de agar sangre. Envuelva las placas en parafina y colocar en la incubadora anaeróbico. </li><li> Después de siete días de incubación a 37 ° C eliminar los platos y contar UFC. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figura 2. Representación esquemática de un protocolo utilizado para la supervivencia de las bacterias anaerobias con células eucariotas. Ambos ensayos para una supervivencia total de bacterias y la supervivencia de las bacterias internalizadas se pueden realizar al mismo tiempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 5. La internalización de bacterias en Host CeLLS (fluorescente Microscopy) Nota: P. gingivalis se etiqueta con 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo (BCECF-AM). BCECF-AM es un colorante de la membrana permeable no fluorescente; su conversión a BCECF fluoresceína a través de la acción de esterasas intracelulares puede indicar la viabilidad celular. P. gingivalis se etiqueta con el BCECF-AM colorante y luego se usa para infectar células eucariotas. Después de la infección, las células se fijan y se marcaron con DAPI y TRITC-faloidina. La mancha DAPI se utiliza para teñir el núcleo de la célula eucariota también etiquetar núcleo de la célula bacteriana, que proporciona una contramedida para identificar bacterias no viables que pueden no metabólicamente pegue BCECF-AM. Las células huésped se destacan con TRITC-phalloidin, un tinte rojo actina. <ol><li> Cubreobjetos autoclave. Añadir asépticamente cubreobjetos a placas de 12 pocillos antes de la siembra de células endoteliales a 5 x 10 4 células / pocillo. (Preparado días antes de experimento) </li><li&gt; tienen células endoteliales preparadas en 18 mm (# 1.5) de espesor cubreobjetos circulares en placas de 12 pocillos como se describió anteriormente. </li><li> Preparar bacterias anaeróbicas que crecen a mediados de la fase de registro (OD 660 = 0,5 a 0,7) como se describe en el apartado 1. </li><li> Bacterias Lavar 2 veces con PBS anaerobio por centrifugación a 5000 xg y se suspende el sedimento en PBS a 5-7 x 10 8 células / ml. </li><li> Añadir 20 l de 0,2 mM BCECF-AM a 2 ml de suspensión bacteriana (5-7 x 10 8 células / ml) a una concentración final de BCECF-AM de 2 mM. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. </li><li> Placas de transferencia con las células endoteliales sembradas en 18 mm (# 1.5) de espesor cubreobjetos circulares de cultivo de tejidos incubadora en la cámara anaeróbica. Lavar con PBS y el intercambio con los medios de comunicación VEGF anaeróbico. Nota: Verifique que HUVEC están sanos bajo un microscopio óptico. HUVECS debe ser ~ 80% de confluencia, la morfología debe ser comparable a los fabricantes. </li><li> Centrifugar etiquetados bacterias en5.000 xg durante 10 min para eliminar residual colorante BCECF-AM. Suspender en 2 ml de medio VEGF anaeróbico. </li><li> Infectar células huésped con bacterias marcadas en MOI de 100: 1 (bacterias: host). </li><li> Incubar en cámara anaeróbica a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Después de la infección las células de lavado con PBS tres veces y fijar en recién preparada 4,0% de paraformaldehído durante 10 min. Nota: Después de fijar las células, el experimento puede llevarse a cabo fuera de la cámara anaeróbica. </li><li> Wash cubreobjetos con PBS tres veces. </li><li> Añadir 1 ml de 0,2% Triton X-100 durante 10 min. </li><li> Wash cubreobjetos con PBS tres veces. </li><li> Añadir 50 l de TRITC faloidina (50 g / ml) a cubreobjetos durante 45 min. </li><li> Lave cubreobjetos tres veces, retirar de la placa de 12 pocillos y el lugar en un portaobjetos con medio de montaje-set blanda que contiene DAPI. Selle los lados con esmalte de uñas. Nota: Las diapositivas se puede conservar durante un par de meses en la oscuridad. Evitar exposición a la luz para evitar la foto-blanqueo. </li><li> Ver diapositivasutilizando un microscopio confocal. <ol><li> En este caso, utilizar un sistema de 34 canales espectrales (detector de red de 32 canales y dos detectores PMT lado, además de un detector de luz transmitida) configurado en torno a un AxioObserver (invertida) de pie con una etapa de XY motorizado. El sistema cuenta con cinco rayos láser: diodo azul (405 nm), varias líneas de argón (458, 488, 514 nm), el diodo verde (561 nm), HeNe rojo (633 nm) y un láser pulsado nm 440. Equipa un sistema de imágenes de vida de fluorescencia con 2 detectores híbridos GaAsP (para FRET Flim). </li><li> Detectar la fluorescencia de DAPI y TRITC en un canal utilizando un filtro de doble banda con longitudes de onda de excitación de 340-380 nm y 540-560 nm, y un filtro de emisión de 435 a 485 nm y 570 a 590 nm, respectivamente. Detectar fluorescencia de BCECF-AM utilizando un filtro con excitación longitud de onda de 440 a 500 nm y un filtro de emisión de 510 a 590 nm. Nota: Los controles para BCECF-AM se debe hacer en cada cepa bacteriana siendo estudiado para garantizar el etiquetado adecuado de bacterias viables. Primero validar que nonviabbacterias le son DAPI-positivas y BCECF negativo. En segundo lugar, asegúrese de que las bacterias vivas pueden metabolizar BCECF-AM en BCECF fluoresceína. Concentraciones variables de las bacterias o BCECF-AM tinte pueden necesitar ser probado para el etiquetado óptimo. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Todos los métodos anteriores se pueden utilizar para diseñar ensayos específicos para evaluar la interacción de las bacterias anaeróbicas con células eucariotas. Sin embargo, hay varias consideraciones para realizar con éxito los experimentos. Primero están los cepas microbianas para ser utilizados en un estudio. Es crucial en la comparación de dos cepas tanto con el ensayo de supervivencia así como por análisis de microscopía de que están en fases de crecimiento similares y alcanzan concent...

Las bacterias anaerobias colonizan casi todas las superficies del cuerpo humano. Aunque predominante en la flora de los tractos intestinales y genitourinarias, donde las concentraciones de oxígeno son bajos, sino que también existen en altos niveles en la piel, la boca, la nariz y la garganta 1. Las bacterias anaerobias son una causa común de infecciones endógenas y se aíslan con frecuencia de sitios enfermos. Sin embargo, debido a su naturaleza fastidioso, anaerobios pueden ser difíciles de aislar y cultivar. Los estudios que incluyen bacterias anaerobias deben realizarse bajo condiciones restringidas. Técnicas anaeróbica de cultivo modernos permiten a los investigadores para imitar la configuración anaeróbicas necesarias para estudiar muchas cepas de laboratorio anaeróbico o incluso aislados clínicos 2,3. Bacterias anaerobias patógenas han desarrollado una relación dinámica y co-evolución con las células huésped en las que residen. La mayoría de los anaerobios son susceptibles a la destrucción por la respuesta inmune del huésped antes de llegar a infectiniveles sas. Sin embargo, algunas bacterias patógenas han desarrollado mecanismos para escapar de o subvertir el respuesta inmune del huésped. Logran este objetivo a través de mecanismos tales como la evasión de reconocimiento inmune, la neutralización de mediadores inmunes, alteración de la inmunidad celular, la invasión de las células huésped, y la alteración de inmune de señalización 4. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativas implicado en tanto oral como enfermedades extraorales, es un ejemplo de un patógeno bacteriano altamente adaptada capaz de causar cambios patógenos en el hospedador 5-7. Los bolsillos de la placa de biofilm devengan en profundas grietas que se forman entre los dientes y la mucosa gingival tejido pueden albergar bacterias anaerobias que están protegidos de oxígeno atmosférico 8. Estas bolsas periodontales sirven como un nicho para diversos patógenos anaerobios, tales como P. gingivalis 9. P. gingivalis es un patógeno piedra angular que es capaz de remodelacióning la comunidad microbiana oral en formas que promuevan el desarrollo y la progresión de las enfermedades periodontales 10. Produce un gran número de factores de virulencia que son activos contra un amplio espectro de proteínas del huésped y proporciona mecanismos para la evasión de las defensas del huésped 11. También es capaz de invadir células epiteliales, endoteliales, fibroblastos, y células del ligamento periodontal in vitro 12-14 in vivo 15. Al invadir con eficacia las células huésped, P. gingivalis puede escapar la inmunidad del huésped. Invasión eficaz de las células huésped no sólo permite la bacteria para escapar de las defensas del huésped sino que también sirve como un depósito para futuras re-infección, así como altera la célula huésped. Se necesitan estudios de los mecanismos moleculares implicados en la adhesión y la internalización de la bacteria por células huésped. La investigación en varios laboratorios se centra en la comprensión de los eventos moleculares asociados con la internalización de P. gingivalis por las células huéspedasí como los mecanismos utilizados para reprimir y secuestrar la respuesta inmune y sobrevivir a los mecanismos de defensa del huésped hostiles. Hay muchos ensayos capaces de identificar y caracterizar los agentes patógenos que son capaces de invadir células huésped. Sin embargo, los estudios in vitro con patógenos anaeróbicos plantean muchos problemas experimentales para el investigador principalmente porque es difícil llevar a cabo estudios que se basan en instrumentos voluminosos en la ausencia de oxígeno. Esto se ve agravado por el hecho de que las células eucariotas requieren oxígeno para crecer y por lo tanto deben ser preparados por separado en incubadoras de cultivo de tejidos. Una forma de evitar estos obstáculos sería realizar los estudios con el oxígeno del aire, pero eso haría que el crecimiento de las bacterias anaerobias imposible. Otro método sería utilizar bacterias muertas por calor para infectar y estudiar las interacciones de la célula huésped. Sin embargo, existen diferencias entre las bacterias muertas por calor y viables que disminuyen la relevancia de la interacti huésped-patógenoel 16. Es fundamental para estudiar bacterias viables con la expresión inalterada la interacción con las células huésped; por lo tanto, métodos para el cultivo de P. se dan gingivalis en un entorno anaeróbico. También, dos protocolos rentables simples se demuestran para la evaluación de la capacidad de P. gingivalis a ser internalizado por las células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC). El primer protocolo se basa en el ensayo de protección populares antibiótico. Aunque el ensayo es sencillo, se dan consideraciones al utilizar microorganismos anaerobios. El segundo protocolo requiere el uso de un microscopio de barrido fluorescente para visualizar la interacción e internalizado P. gingivalis. Cada ensayo tiene sus limitaciones y ventajas que se tratarán de proporcionar al investigador un esquema para el estudio de la invasión de bacterias anaerobias. Aunque el manuscrito actual estudia P. gingivalis y HUVECs, estos protocolos se pueden utilizar para muchas otras bacterias anaerobias, asíEn cuanto a otros tipos de células huésped.

<table><tbody><tr><td>Cámara anaeróbica de vinilo-tipo B</td> Productos <td></td><td>de laboratorio Coy Modelo</td><td>2000 incubadora&nbsp;</td></tr><tr><td>TSA II Agar Tripticasa de Soja con 5% de Sangre de Oveja</td><td>BBL</td><td>221261</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales de la vena umbilical humana Pool de 10 donantes</td><td>Tecnología LifeLine</td><td>FC-0044</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medio Kit completo</td><td>Tecnología LifeLine</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>TrypKit</td><td>LifeLine</td><td>LL-0013</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Riedel-de Haen</td><td>16109</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sulfato de gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1264</td><td></td></tr><tr><td>metronidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3761</td><td></td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>LifeTechnologies</td><td>B1150</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Phalloidin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Cubreobjetos</td><td>circulares Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje VectaShield con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Las bacterias anaerobias son mucho más numerosos aerobios en muchos nichos humanos, como el intestino, la boca y la vagina. Además, las infecciones anaeróbicas son comunes y con frecuencia de origen indígena. La capacidad de algunos patógenos anaeróbicos para invadir las células humanas les da medidas de adaptación para escapar de la inmunidad innata, así como para modular el comportamiento de la célula huésped. Sin embargo, lo que garantiza que las bacterias anaerobias son en vivo durante la investigación experimental de los eventos puede plantear desafíos. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativas, es capaz de invadir una variedad de células no fagocíticas eucariotas. En este artículo se describe cómo con éxito la cultura y evaluar la capacidad de P. gingivalis para invadir las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Se desarrollaron dos protocolos: uno para medir las bacterias que pueden invadir y sobrevivir con éxito dentro del huésped, y el otro para visualizar las bacterias que interactúan con las células huésped. Estas técnicas requieren el uso de un anaeRobic cámara para suministrar P. gingivalis con un ambiente anaeróbico para un crecimiento óptimo. El primer protocolo se basa en el ensayo de protección a los antibióticos, que se utiliza en gran medida para estudiar la invasión de células huésped por bacterias. Sin embargo, el ensayo de protección de antibiótico es limitada; sólo las bacterias intracelulares que son cultivables tras el tratamiento antibiótico y la lisis de la célula huésped se miden. Para evaluar todas las bacterias que interactúan con las células huésped, tanto vivas y muertas, hemos desarrollado un protocolo que utiliza la microscopía de fluorescencia para examinar la interacción huésped-patógeno. Las bacterias se marcaron fluorescentemente con 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína acetoximetilo éster (BCECF-AM) y se utiliza para infectar las células eucariotas bajo condiciones anaeróbicas. Después de la fijación con paraformaldehído y permeabilización con 0,2% Triton X-100, las células huésped se etiquetan con TRITC faloidina y DAPI para etiquetar el citoesqueleto de la célula y el núcleo, respectivamente. Múltiple images tomadas en diferentes puntos focales (Z-pila) se obtienen para la visualización temporal-espacial de las bacterias. Los métodos utilizados en este estudio se pueden aplicar a cualquier anaerobio cultivable y cualquier tipo de célula eucariota.

Protocolos mencionados anteriormente fueron utilizados en el estudio de la interacción huésped-patógeno entre P. gingivalis y las células endoteliales. P. gingivalis W83 y P. gingivalis V3150 que porta una deleción de PG0228 se utilizaron en el estudio. El PG0228 se prevé para codificar una proteína que puede alterar los niveles de ARN y proteínas, lo que puede afectar en última instancia interacción de P. gingivalis con células huésped. Para investigar el efecto de la PG0228...

Este artículo presenta dos protocolos: uno para medir las bacterias anaeróbicas que pueden invadir y sobrevivir con éxito dentro del huésped, y el otro para visualizar las bacterias anaeróbicas interactuando con las células huésped. Este estudio se puede aplicar a cualquier anaerobio cultivable y a cualquier tipo de célula eucariota.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

El objetivo general de este video es demostrar protocolos para evaluar la interacción de bacterias anaeróbicas con células hospedadoras. Las condiciones utilizadas para cultivar células hospedadoras son tóxicas para las bacterias anaeróbicas y viceversa. Esto representa un desafío para estudiar sus interacciones, y deben lograrse condiciones óptimas para ambas, a fin de que permanezcan metabólicamente activas durante el período de estudio.Dichas condiciones reflejarán con mayor precisión el escenario de interacción entre el patógeno y el huésped encontrado in vivo. El método presentado aquí ayudará a responder preguntas sobre los mecanismos implicados en la supervivencia microbiana, así como en la unión y la internalización de células bacterianas anaeróbicas durante la infección. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque trabajar con bacterias anaeróbicas requiere conocimientos sobre el uso de una cámara anaeróbica y buenas técnicas sépticas.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos que implican el uso de una cámara anaeróbica son difíciles de aprender. Además, se debe tener precaución al experimentar con cámaras anaeróbicas para el cultivo y experimentación con por ominosa gingiss. Se mantiene una cámara anaeróbica de vinilo con una atmósfera artificial que contiene 80% nitrógeno, 10% hidrógeno y 10% dióxido de carbono; coloque 30 placas de agar sangre, 500 mililitros de PBS y 30 mililitros de medio de factor de crecimiento endotelial vascular o VEGF dentro de la cámara anaeróbica.24 horas de antelación, para equilibrar los reactivos, siembre cuatro veces 10 a la cinco células endoteliales de vena umbilical humana o VE por pocillo en placas de seis pocillos con medio VEGF y déjelas en el incubador de cultivo celular durante la noche para su adherencia. Prepare cultivos de Porro gingis en caldo infusión cerebro corazón, o medio BHI, como se describe en el texto adjunto, y permita que los cultivos alcancen la fase logarítmica mientras la densidad óptica del cultivo a 660 nanómetros oscila entre 0,5 y 0,7. Transfiera las bacterias a un tubo de 15 mililitros y envuelva un trozo de parafina alrededor de la tapa para evitar el cierre aeróbico.Luego, centrifugue las bacterias a 5.000 × g durante 10 minutos dentro de la cámara anaeróbica. Lave las bacterias sedimentadas con PBS anaeróbico y centrifugue nuevamente a 5.000 × g durante 10 minutos. Reese tiene las bacterias en medio VEGF para infectar el HU X mediante transferencia por ominosa.Las placas de seis pocillos se transfieren desde el incubador a la cámara anaeróbica; se aspira el medio de los pocillos de prueba y se lavan tres veces con PBS anaeróbico. Determine el número de células de un pocillo representativo mediante el ensayo de exclusión con azul de tripano. Luego, añada dos mililitros por pocillo de medio VEGF anaeróbico y coloque las placas a 37 grados Celsius en el incubador anaeróbico durante 20 minutos para equilibrar. Determine la densidad óptica de las bacterias y resuspenda.Siéntelas en un volumen adecuado de medio VEGF para infectar las células a una multiplicidad de infección de 100 bacterias por una célula. Añada la suspensión bacteriana a las células e incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius para la infección y lisis celular dentro de la cámara anaeróbica. Prepare una solución de saponina al 1% peso por volumen en medio BHI y filtre a través de un filtro de 0,2 micrones para estudiar las interacciones bacterianas con las células huésped.Retire la placa de seis pocillos del incubador y aspire el medio de infección. Lave tres veces con PBS anaeróbico. A continuación, agregue dos mililitros de solución de saponina a cada pocillo e incube durante 15 minutos para permitir la lisis celular.A continuación, raspe las células del fondo de la placa y diluya el lisado celular uno a uno con medio BHI. Luego realice diluciones seriadas comenzando por uno a 100, y siembre 200 microlitros de una dilución adecuada en placas de agar sangre. Envuelva las placas con perfil e incúbelas en un incubador anaeróbico a 37 grados Celsius durante siete días para permitir la formación de colonias.Luego, utilizando una caja de luz, cuente las unidades formadoras de colonias o UFC en cada placa tras la infección de las células HU E. Lave las células tres veces con PBS anaeróbico. A continuación, agregue dos mililitros de medio VEGF suplementado con concentraciones previamente optimizadas de antibióticos a las células HU E.Incube las células durante una hora, aspire el medio y agregue dos mililitros de solución de esaponina al 1% en BHI a cada pocillo; incube durante 15 minutos. A continuación, raspe las células lisadas y recoja el lisado en un tubo de centrífuga. Diluya el lisado uno a uno con medio BHI y luego prepare diluciones seriadas comenzando en uno a 100.Plaque 200 microlitros de las concentraciones adecuadas en agar sangre. Deje crecer las bacterias durante siete días en una cámara anaeróbica y luego cuente las colonias.El método de siembra descrito tiene en cuenta únicamente las bacterias vivas que interactúan con las células. Para superar esta limitación, utilizamos microscopía, donde pueden visualizarse tanto las bacterias vivas como las muertas asociadas a la célula, con el fin de observar las bacterias internalizadas. Primero, transfiera de forma aséptica al autoclave.Los cubreobjetos de vidrio dentro de cada pocillo de una placa de 12 pocillos, cinco veces 10 a la cuatro hve por pocillo sobre el cubreobjeto e incubar durante 24 horas para etiquetar las bacterias, centrifugar, fase media de las bacterias y resuspender el precipitado con PBS anaeróbico, centrifugar nuevamente y repetir el paso de lavado. Añadir 20 microlitros de B-C-E-C-F-A-M 0,2 milimolar a dos mililitros de PBS anaeróbico que contienen de cinco a siete veces 10 a la octava.Bacterias por mililitro se incuban a 37 grados Celsius durante 30 minutos en la oscuridad. El colorante fluorescente que utilizamos puede teñir la mayoría de las bacterias anaeróbicas, por lo que no se requieren otros reactivos como un anticuerpo específico. Centrifugue la suspensión bacteriana a 5.000 × g durante 10 minutos para eliminar el reactivo de marcado no unido y resuspenda las bacterias en medio VEGF.Luego, infecte las células UIC a una relación de 100 bacterias por una célula e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Tras la incubación, retire el medio de infección y lave las células tres veces con PBS. A continuación, agregue paraformaldehído al 4% e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.Para fijar las células en la cámara anaeróbica, retire las células fijadas de la cámara y luego lave las laminillas con PBS 3 veces. Incube las laminillas en un mililitro de Tritón X-100 al 0,2 % durante 10 minutos para permeabilizar las células. A continuación, lave las laminillas con PBS 3 veces ahora. Añada 50 microlitros de 50 microgramos por mililitro de T-R-I-T-C foid en cada laminilla y incube durante 45 minutos a temperatura ambiente para teñir el actina oligomérica celular.Después de la incubación, lave el cubreobjetos con PBS tres veces. Invierta el cubreobjetos sobre un portaobjetos con medio de montaje blando que contenga un microgramo por mililitro de dappy para la tinción nuclear. Luego, selle el perímetro del cubreobjetos con esmalte de uñas y observe bajo microscopía confocal la interacción de la bacteria anaerobia.Se muestran gingivitis porosas con uve en estos resultados. La dilución seriada de la célula, lisado que contiene bacterias adheridas o internalizadas hasta 100 veces, produjo un número contable de UFC en placas de agar sangre. Aquí se muestra la comparación siete días después de la incubación del rendimiento de UFC en placas de agar entre la infección con el tipo salvaje porus vallis W 83 y la infección con el mutante de deleción V 315.La mutación afecta la capacidad de la bacteria para infectar. El VE mostrado aquí es una representación gráfica de las colonias bacterianas obtenidas a partir de células infectadas. Cuando se evaluó la interacción, se recuperaron menos bacterias mutantes de las células infectadas en comparación con la cepa de tipo silvestre.Los resultados obtenidos tras eliminar las bacterias extracelulares mediante tratamiento con antibióticos se muestran en las columnas de la derecha. Nuevamente, la cepa mutante fue ineficiente en invadir células uve vivas. Las bacterias se observan tras la marcación con BCE CFAM.La tinción adicional de los filamentos de actina y del núcleo celular es visible en fluorescencia roja y azul, respectivamente. Una vez dominadas, cada una de estas técnicas puede realizarse en seis horas si se llevan a cabo adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener a las bacterias en condiciones anaeróbicas, así como igualar todos los medios y materiales dentro de la cámara anaeróbica hasta por 24 horas antes del experimento.No olvide que trabajar con patógenos anaeróbicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como usar guantes, lavarse las manos y emplear técnicas asépticas durante la realización de este procedimiento. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre patógenos prebucales. También puede aplicarse a otros sistemas, como la aspiración, la neumonía, las infecciones intraabdominales, las infecciones ginecológicas y muchas otras infecciones anaeróbicas presentes en diversos sitios del cuerpo humano.Las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestra terapia farmacológica contra diversos patógenos anaerobios, ya que se pueden agregar fácilmente medidas inhibitorias al protocolo y medir directamente la internalización tras el tratamiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar bacterias anaerobias y evaluar su capacidad de interactuar con células hospedadoras.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Calatayud Arroyo, M., et al. Evaluación de la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz intestino-microbio in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demuestra un modelo intestino-microbio in vitro para estudiar la viabilidad bacteriana. Se incuba un cocultivo de células Caco-2 y HT29-MTX con bacterias pretratadas bajo condiciones digestivas simuladas. Se evalúa la integridad de la barrera epitelial utilizando resistencia eléctrica transepitelial, y se recogen...

Modelo intestinal in vitro para evaluar la adhesión bacteriana e internalización

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

A Transwell Tissue Model for Studying Interactions Between Human Oral Biofilms and Epithelium

Este video muestra una técnica para evaluar la capacidad de Porphyromonas gingivalis, una bacteria patógena anaeróbica, para adherirse e invadir las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Después de infectar las células huésped con las bacterias, las células huésped se lisan para liberar bacterias adheridas e internalizadas. Cuando el lisado se siembra en un medio apropiado, la presencia de colonias indica interacciones exitosas entre bacterias y células huésped.

Ensayo de infección bacteriana para el estudio de las interacciones anaeróbicas entre bacterias y células huésped

En este video, demostramos un procedimiento para visualizar Porphyromonas gingivalis, una bacteria patógena anaeróbica, dentro de células endoteliales humanas utilizando microscopía confocal. Las bacterias se tiñen con un tinte fluorescente, mientras que el citoesqueleto de actina de la célula endotelial del huésped se marca con un tinte fluorescente diferente. La Porphyromonas gingivalis internalizada dentro de las células endoteliales se visualiza mediante microscopía confocal.

Visualización de bacterias anaeróbicas internalizadas dentro de las células endoteliales del huésped

En este video, demostramos un ensayo para evaluar la supervivencia de Porphyromonas gingivalis dentro de células endoteliales humanas. La medida de supervivencia y crecimiento de Porphyromonas gingivalis internalizada se evalúa por el número de colonias en la placa de agar sangre.

Evaluación de Porphyromonas gingivalis internalizado en células endoteliales del huésped

Los modelos animales han demostrado ser herramientas muy valiosas en la definición de mecanismos de acogida y de patógenos específicos que contribuyen al desarrollo de la inflamación crónica. Aquí se describe un modelo de ratón de infección oral con el patógeno humano Porphyromonas gingivalis y metodologías detalle para evaluar la progresión de la inflamación en sitios locales y sistémicos.

Un modelo de ratón para Patógenos inducida inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos

Interacciones de host-microbio intestinal fueron evaluadas usando un nuevo enfoque que combina una comunidad oral sintético, en vitro la digestión gastrointestinal y un modelo del epitelio del intestino delgado. Presentamos un método que puede ser adaptado para evaluar invasión celular de patógenos y biofilms multiespecies, o incluso para probar la supervivencia de las formulaciones probióticas.

Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut

El presente protocolo describe la aplicación de modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones huésped-patógeno in vitro. En concreto, el sistema modelo descrito utiliza un epitelio oral de múltiples capas expuesto a microorganismos asociados a biopelículas (placa dental) en el contexto de la salud bucal frente a la enfermedad.

Sistemas de modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones huésped-patógeno in vitro

Se describe un protocolo para identificar las principales funciones de las moléculas de señalización de acogida en la replicación lítica de un modelo herpesvirus, virus herpes gamma 68 (γHV68). La utilización de cepas de ratón modificados genéticamente y los fibroblastos embrionarios de γHV68 replicación lítica, el protocolo permite tanto la caracterización fenotípica y molecular de las interacciones interrogatorio virus-huésped durante la replicación viral lítico.

Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

Aprende a evaluar la interacción de bacterias anaerobias con células huésped usando Porphyromonas gingivalis. Este protocolo permite medir la invasión bacteriana y visualizar mecanismos de supervivencia microbiana in vivo.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

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