Extracción secuencial de soluble e insoluble alfa-sinucleína de cerebros parkinsonianos

El objetivo general de esta metodología es extraer alfa-sinucleína soluble e insoluble de cerebros parkinsonianos post-mortem. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la enfermedad de Parkinson. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de una técnica relativamente sencilla que utiliza reactivos e instrumentos de laboratorio comunes.

Después de preparar las soluciones y tampones necesarios, comience colocando una muestra de 0,5 gramos de tejido de ganglios basales congelado en una pequeña placa de Petri. Utilice una hoja de bisturí estéril para picar rápidamente en fragmentos cuadrados de un milímetro. Recoja el pañuelo picado en un tubo de 15 mililitros y agregue 10 volúmenes de hielo frío, 1X TBS al tubo.

Homogeneizar las muestras utilizando un homogeneizador mecánico a 20.000 rpm durante 10 segundos. Luego enfríe sobre hielo durante dos minutos. Repita la homogeneización tres veces, enfriando sobre hielo cada vez.

Centrifugar el homogeneizado a 10.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante de homogeneizado crudo a tubos de centrífuga de policarbonato y centrifugue a 100, 000 g durante una hora a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a tubos enfriados en hielo y reténgalo como la fracción soluble de TBS.

Lavar en cinco volúmenes de tampón 1X TBS y centrifugar a 100.000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar y desechar el sobrenadante. A continuación, repita el lavado.

El lavado exhaustivo de los gránulos entre los pasos de ultracentrifugación es fundamental para el éxito de este procedimiento. Después de permitir que las muestras alcancen una temperatura de 10 grados centígrados para evitar la precipitación de SDS, agregue cinco volúmenes de 1X TBS-SDS y vuelva a suspender el pellet final sonicando durante 10 segundos a 20 kilohercios a temperatura ambiente. Ultracentrífuga a 100.000 gs durante 30 minutos a 25 grados centígrados.

Después de la ultracentrifugación, transfiera el sobrenadante a tubos enfriados en hielo y manténgalo como fracción soluble SDS. Agregue cinco volúmenes de tampón 1X TBS-SDS a temperatura ambiente al pellet y centrifugue a 100, 000 g durante 15 minutos a 25 grados centígrados. Deseche el tampón de lavado y repita el lavado.

Después de desechar el sobrenadante, agregue 50 microlitros de 1X TBS-SDS-Urea y solubilice usando un sonicador ajustado a 20 kilohercios durante 10 segundos. Etiquete esta muestra como la fracción soluble de urea. Es esencial asegurarse minuciosamente de que todas las proteínas insolubles se extraigan en el procedimiento.

Diluya las muestras de TBS-SDS-urea una a una con tampón TBS 1X para permitir la compatibilidad con los reactivos de ensayo de proteínas, y analice cada fracción para determinar el contenido total de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Alícuota de las muestras en alícuotas de 20 microlitros con 10% de glicerol para reducir futuros ciclos de congelación-descongelación, y almacene a menos 80 grados centígrados. Cargue 10 microlitros de los extractos TBS, TBS-SDS y TBS-SDS-Urea en un marcador de peso molecular en 10 pocillos, cuatro a 12 por ciento de gel de poliacrilamida Bis-Tris con MOPS como tampón de funcionamiento utilizando técnicas estándar.

Ejecute el gel a 200 voltios durante una hora, o hasta que el tinte azul de la carga del tampón haya llegado al fondo del gel. Humedece una membrana de nailon en metanol al 100 % y luego remoja en un tampón de transferencia que contiene un 20 % de metanol. Haga una marca de identificación en la mancha para determinar el lado de la proteína y la orientación de los marcadores de tamaño de peso molecular.

Coloca el gel con la membrana junto con papel de filtro húmedo. Realice la transferencia durante dos horas a 40 voltios. Bloquee la solución de BSA al 5% en 1X PBS-T durante 30 minutos agitando a 70 rpm para evitar la unión inespecífica del anticuerpo primario a la membrana.

Pruebe la transferencia de proteínas incubando con seis mililitros del anticuerpo primario Syn-1 alfa-sinucleína diluido de uno a 750 en PBS-T durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, lave la membrana con 1X PBS-T tres veces durante cinco minutos cada vez. A continuación, incubar el blot con el anticuerpo secundario conjugado HRP adecuado diluido de uno a 2.000 en PBS-T durante 30 minutos.

Lave la membrana como antes con 1X PBS-T. Sumerja las manchas en una solución de quimioluminiscencia mejorada de acuerdo con las instrucciones del fabricante en una habitación oscura. Cubra las manchas con una película adhesiva y capture la señal mediante autorradiografía.

Después de la toma de imágenes, incube la transferencia occidental con seis mililitros de tampón de eliminación de Western blot durante 10 minutos con agitación constante para eliminar la señal de anticuerpos alfa-sinucleína de la transferencia. Repita el procedimiento de Western blot para sondear la membrana con el anticuerpo primario de beta-actina en una dilución de 1 a 8.000. Escanee y convierta la imagen final en una imagen Tiff y mida las densidades utilizando NIH ImageJ con fines de cuantificación.

Las siguientes imágenes son inmunotransferencias representativas de los niveles de alfa-sinucleína de la EP y controlan el tejido de los ganglios basales humanos. Las fracciones solubles de TBS, SDS y urea se analizaron para detectar la presencia de alfa-sinucleína mediante inmunotransferencia occidental. Se cargaron 10 miligramos de proteína en cada carril.

En la fracción TBS, los monómeros de alfa-sinucleína están presentes en todos los casos. El asterisco posiblemente representa una forma truncada C-terminal de alfa-sinucleína. En la fracción SDS, se observan algunos oligómeros de alfa-sinucleína junto con monómeros, indicados por la punta de flecha sólida en el tejido de la EP.

En la fracción de urea, los monómeros, oligómeros y alfa-sinucleína agregada se expresan de manera variable en los casos de EP, lo que refleja su respectiva carga de cuerpos de Lewy. Las muestras de control neurológicamente normales muestran la presencia de solo pequeñas cantidades de alfa-sinucleína monomérica. Una vez dominada, esta técnica de extracción de proteínas se puede realizar en un día laborable, seguida de inmunoblot occidental al día siguiente, si se realiza correctamente.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de los cuerpos de Lewy exploraran especies de alfa-sinucleína insolubles y agregadas en tejido humano patológico y en modelos animales in vivo. No olvide que trabajar con tejido humano no fijado requiere medidas de precaución, y se deben usar guantes y batas de laboratorio en todo momento para todos los procedimientos de manipulación.