Name: Extracción secuencial de soluble e insoluble alfa-sinucleína de cerebros parkinsonianos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprende a extraer alfa-sinucleína soluble e insoluble de cerebros parkinsonianos post-mortem mediante ultracentrifugación y detergentes. Este método permite analizar agregados proteicos en tejido humano patológico.

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Agradezco al Dr. Adamantios Mamais por extraer α-sinucleína del tejido humano y eliminar las manchas. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del MRC (MR/L010933/1) y en parte por el premio Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration (WT089698) al Consorcio de la Enfermedad de Parkinson del Reino Unido (UKPDC), cuyos miembros son del Instituto de Neurología de la UCL, la Universidad de Sheffield y la Unidad de Fosforilación de Proteínas del MRC de la Universidad de Dundee. RB recibió fondos de la fundación MJFox para este trabajo y también está financiado por el Reta Lila Weston Trust.

Tejido cerebral post-mortem fue donado a Queen Square Banco de Cerebros de los trastornos neurológicos, el University College de Londres, Instituto de Neurología utilizando protocolos y éticamente aprobados almacenado para la investigación bajo una licencia emitida por la autoridad de tejido humano (HTA) Reino Unido (n. ° 12198). Ver lista de casos utilizados para este protocolo (Tabla 1). 1. Preparación de Buffers <ol><li> Preparar 1X TBS (solución salina tamponada con Tris) tampón: <ol><li> Preparar 10X TBS como solución madre con NaCl 500 mM Tris-HCl pH 7,4 y 1,500 mM. <ol><li> Pesar 60,5 g de Tris-Cl pH 7,6 y 87,6 g de NaCl en 800 ml de agua de alta pureza. Ajustar el pH con HCl 1 M y hacer que el volumen de existencias al final de 1 L. </li></ol></li><li> Preparar la concentración final de 1X TBS diluyendo la solución madre 10 veces en agua destilada. </li><li> Añadir inhibidores de la proteasa (PI), (1 comprimido por cada 50 ml de tampón) y Phos-stop tabletas inhibidor de la fosfatasa (1 comprimido por cada 10 ml de tampón) aabrogar los efectos de las acciones enzimáticas no específicos de proteasas y fosfatasas. Nota: Aquí hemos utilizado la enzima inhibidor de las tabletas de la Roche pero igualmente otros inhibidores disponibles en el mercado puede ser utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Preparar tampón TBS-SDS mediante la adición de 5% w / v de sodio dodecil sulfato (SDS) a 1X TBS (pH 7,4) buffer. Calentar la solución a 60 ° C con agitación constante usando un agitador magnético para solubilizar SDS. </li><li> Preparar tampón TBS-SDS-urea mediante la adición de urea a una concentración final de 8 M w / v de tampón 1X TBS-SDS (pH 7,4). Calentar la solución a 60 ° C con agitación constante en un agitador magnético para disolver la urea. </li></ol> 2. La homogeneización de la muestra y ultracentrifugación diferencial Nota: La siguiente parte del trabajo consiste en la manipulación de tejido cerebral humano de acuerdo con las reglas de la HTA Reino Unido. Procedimientos operativos estándar locales se siguen en absoluto times. Muestras cerebrales se diseccionaron a partir de bloques de cerebro congeladas y material de tejido homogeneizado en un microcabinet mantenida a presión negativa. Batas desechables guantes, mascarillas, sobre-protectores de zapatos y gafas de seguridad se usan durante todo el procedimiento. Residuos de tejido humano se desecha después de tratamiento en autoclave a 121 ° C durante 20 min para la eliminación segura. Sharps (hojas de bisturí) están dispuestos en un contenedor de objetos punzantes apropiado para la contención y eliminación segura. <ol><li> Tome un trozo de tejido humano congelado (aproximadamente 0,5 g en el peso de la región de ganglios basales) y picar rápidamente en pequeños fragmentos (aproximadamente 1 mm 2) en hielo usando un pequeño plato petri y una hoja de bisturí estéril. Use un plato petri separado y hoja de bisturí para cada muestra. Recoger el tejido picado en un tubo de 15 ml y añadir 10 volúmenes de tampón enfriado con hielo 1XTBS al tubo. </li><li> Homogeneizar las muestras usando un homogeneizador mecánico a 20.000 rpm durante 10 seg. Enfriar en hielo durante 2 min. Repita este paso tres vecess. Nota: Esto se hace para que las muestras no se calientan mientras homogeneizar. </li><li> Aclarar por centrifugación a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Desechar pellet de material no homogeneizada. </li><li> Tome sobrenadante (homogeneizado crudo), añadir a tubos de centrífuga de policarbonato (tamaño del tubo depende del tamaño del rotor) y equilibrar cuidadosamente. Centrifugar a 100.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Conservar el sobrenadante ya que esto es la fracción soluble en TBS. </li><li> Lavar el pellet dos veces en cinco volúmenes de tampón 1X TBS y se centrifuga cada vez a 100.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Deseche los sobrenadantes. <ol><li> Resuspender el sedimento final sonicando el pellet de 10 segundos a 20 KHz en aproximadamente 5 volúmenes de 1X TBS-SDS a RT. Nota: Antes de la adición de las muestras de tampón que contienen SDS debe ser llevado a 10 ° C para evitar la precipitación SDS. </li><li> Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 30 min a 25 ° C. </li></ol></li><li> Conservar el sobrenadante ya que esto es THe SDS fracción soluble. <ol><li> Lavar el pellet dos veces en 5 volúmenes de tampón 1X TBS-SDS a RT. Centrifugar cada vez a 100.000 xg durante 15 min a 25 ° C. </li><li> Solubilizar el sedimento final en 50 l de 1X tampón TBS-SDS-UREA usando un sonicador fijado en 20 KHz durante 10 segundos para lograr la solubilización completa; esto se denomina la fracción soluble urea. </li></ol></li><li> Ensayo cada fracción para el contenido de proteína total usando un kit de ensayo de proteína comercial según el protocolo del fabricante. Diluir las muestras TBS-SDS-urea 1: 1 con tampón TBS 1X para permitir la compatibilidad con los reactivos de ensayo de proteínas. Muestras Freeze en pequeñas alícuotas (20 l) a -80 ° C para reducir los ciclos de congelación-descongelación. Nota: La adición de glicerol al 10% de las muestras se recomienda para el almacenamiento a largo plazo a -80 ° C. </li></ol> 3. inmunotransferencia de Muestras y Análisis de Resultados <ol><li> Muestras Ejecutar desde TBS, TBS-SDS y extractos TBS-SDS-urea en 10 pocillos 4-12% de gel Bis-Tris poliacrilamidacon MOPS como tampón utilizando técnicas estándar. Ver Gallagher y Chakravarti (2008) 29 para un protocolo de transferencia de Western detallada. </li><li> Cargar 10 g de proteína de cada muestra en cada carril junto con un marcador de peso molecular de TBS y SDS y las fracciones de urea. </li><li> Ejecutar gel a 200 V durante 1 hora o hasta que el colorante azul de tampón de carga ha alcanzado el fondo del gel. </li><li> Transferencia de proteínas a partir de geles de electroforesis a membranas de nylon 28, pre-humedecida primero en 100% de metanol y luego en tampón de transferencia que contiene 20% de metanol. Proporcionar una marca de identificación en el blot para determinar el lado de la proteína y la orientación de los marcadores de tamaño de peso molecular. <ol><li> Sandwich el gel junto con la membrana de papel de filtro húmedo. La correcta colocación de la membrana es crucial con la membrana entre el gel y el ánodo. Realizar la transferencia durante 2 horas a 40 V. </li><li> Invente 1X PBS-Tween (1X PBS-T) tampón: disolver 1 comprimido de PBS en 200 mlagua para dar tampón de fosfato 0,01 M, cloruro de potasio 0,0027 M y cloruro de sodio 0,137 M, pH 7,4. </li><li> Bloquear la membrana en solución de BSA al 5% en 1X PBS-T durante 30 min con agitación a 70 rpm. Esto evita que la unión no específica del anticuerpo primario a la membrana. </li></ol></li><li> Sondear el blot de proteínas con 6 ml de-α syn anticuerpo primario Syn-1 (BD Biosciences; anticuerpo monoclonal de ratón) a 1: 750 dilución (O / N a 4 ° C) seguido por una serie de lavados con 1X PBS-T ( 3 x 5 min cada vez) 28. </li><li> Incubar la blot con el HRP apropiado anticuerpo secundario conjugado a 1: 2000 dilución para 30 min. Realizar una serie de lavados (3 x 5 min cada vez) con 1X PBS-T. <ol><li> Sumergir manchas mejorada en solución de quimioluminiscencia durante 15 s en una habitación oscura. Borrones cubrir con una película transparente y lugar películas de autorradiografía contra la mancha con el lado de proteínas hasta en un cassette a prueba de luz para capturar las señales apropiadas (bandas de tamaño apropiado). </li><li> Desarrollar películas de autorradiografía en un desarrollador automatizado. Nota: Las transferencias también se puede desarrollar manualmente utilizando revelador y fijador de una fuente comercial en el caso de una máquina automatizada desarrollador no está disponible. </li></ol></li><li> Incubar el western blot con 6 ml de western blot despojar de amortiguación durante 10 minutos con agitación constante para despojar a la mancha de la señal de anticuerpo-α syn. Siga los pasos a través de 3.43 a 3.6.2 usando beta-actina anticuerpo primario (monoclonal de ratón) a 1: 8000 dilución. </li><li> Escanear y convertir la imagen final en un archivo TIFF de imagen y medir densidades utilizando NIH ImageJ para fines de cuantificación (un software de descarga gratuita). Nota: El software permite la lectura de las densidades de área relativa de interés (las bandas de tamaño apropiado) y los datos se puede expresar como una relación de α-syn densidad / β-actina (un gen de mantenimiento de la casa) como unidades arbitrarias o en su propio cuando un gen mantenimiento de la casa no es válido (como en el caso de muestras de urea-soluble). </li&gt; </ol>

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</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

En este artículo se describe un protocolo para la extracción bioquímica y examen de las propiedades de solubilidad diferencial de monómeros, oligómeros y agregados α-syn de cerebros enfermos utilizando condiciones de desnaturalización gel de funcionamiento. Esta es una técnica bien establecida para estudiar α-syn 17, 18, ​​20, 21 una proteína que normalmente es soluble en su forma nativa pero el aumento de propiedades de agregación amiloidogénicas o aumentó con la progresión de la enfermedad o con mutaciones genéticas agregada. No obstante, algunos grupos han utilizado pequeñas variaciones en las concentraciones de SDS en sus buffers (8% o 10% en lugar del 5%) 21,22, 30. El SDS es un detergente aniónico y solubiliza α-syn oligómeros que pueden incluir formas unidas a la membrana de α-syn, mientras que la urea, un reactivo caotrópico desnaturaliza las formas agregadas y fibrilares o amiloidogénicos insolubles de α-syn 20. En este sentido un estudio sistemático por Paleologou et al 31 examinaron la estabilidadde oligómeros y fibrillas con concentraciones variables de urea alfa-syn (6.5 - 8 M) o SDS (0,25 a 2%) e informó que los oligómeros estables en concentraciones de SDS pero no con altas concentraciones de urea. Su FILA 1-anticuerpo, específico para oligómeros y fibrillas de alfa-syn detecta mayores concentraciones de fibrillas en 6.5 M concentraciones de urea en condiciones no desnaturalizantes. Las concentraciones de tampón utilizados en este protocolo refleja fielmente lo que se ha descrito en Culvenor et al. (1999) 32. Las regiones cerebrales anatómicas para la extracción bioquímica de insolubles α-syn deben ser cuidadosamente seleccionados y esto debe reflejar la carga LB y LN-α syn dependiendo de progresión de la enfermedad 33,34. Los casos utilizados aquí son muestras de los ganglios basales de los subtipos neocorticales y límbicas del PD que reflejan etapas finales e intermedios de progresión de la EP según McKeith ctriteria 34. En el Banco Queen Square cerebro, una mitad del cerebro esrutinariamente fija en formalina para el análisis histoquímico y la otra mitad se diseca cuidadosamente en diferentes regiones anatómicas y flash congelaron y almacenaron a -80 C congeladores o para más bioquímicos y de ADN estudios de análisis / ARN. Tras la fijación en formol de los cerebros y la disección por neuropatólogos, inmunohistoquímica se realiza utilizando anticuerpos α-syn y los resultados archivados. También como un procedimiento de rutina, el pH del tejido cerebral se mide a la llegada como una medida del estado agónica del tejido cerebral. Esto forma una base firme para la calidad de la conservación de tejidos para análisis bioquímicos. Nuestros datos muestran que aquí hay más SDS soluble monómero α-syn en casos de DP en comparación con los controles; en particular los casos de PD neocorticales tiene mayor carga α-syn en comparación con la variedad PD límbico. Los casos neocorticales representan una mayor progresión de la EP patología α-syn en las regiones neocorticales como el CDR frontal y parietalTices 33,34. Los casos de PD límbicas tienen mayores puntajes LB en las áreas del cerebro anterior / regiones límbicas basales como la amígdala, transentorhinal y las regiones del cíngulo. Para los datos significativos y análisis estadístico, se debe ejecutar al menos 4 casos de cada cohorte. Del mismo modo que no hemos tratado el análisis estadístico de los datos de transferencia que se presentan aquí. También debe tenerse en cuenta que diferentes anticuerpos pueden reconocer diferentes formas / composición de orden superior alfa-syn oligómeros y cada uno puede tener su propia sensibilidad relativa y preferencia. Esto es evidente a partir de los resultados de Tong et al. 29 donde se muestran que 4 anticuerpos alfa-syn diferentes (Syn-1, SS, Onco y LB509) dan resultados cambiables por lo menos para alfa-syn oligómeros / agregados. Los monómeros α-syn fueron reconocidos en grados similares por los 4 anticuerpos aunque éstos pueden tener variación dependiendo de si el epítopo de anticuerpo α-syn se encuentra ya sea en el N-terminal o C-terminal 29. Del mismo modo, los anticuerpos específicos para fosfo-alfa sinucleína determinar el peso molecular de alta distinta α-sinucleína especies 20,21. En el protocolo descrito aquí, el anticuerpo altamente caracterizado Syn-1 se ha utilizado 19-21. Sin embargo, es importante tener en cuenta la validación de cualquier nuevo anticuerpo en transferencias Western a través de experimentos preabsorption de anticuerpos y también la sobreexpresión y desmontables de la proteína en las células. Es importante tener en cuenta otras variaciones que se han aplicado por los investigadores para determinar fragmentos más pequeños de formas alfa-syn y o inestables tetraméricas alfa-syn. Esto podría incluir leve fijación de membranas con 0,4% PFA en PBS para retener formas truncadas de α-syn 35 o el tratamiento de los homogeneizados de ejemplo con agentes de entrecruzamiento para estabilizar tetrámeros 36. Evaluación bioquímica precisa de proteínas utilizando ti post mortemDICIÓN requiere minimización de la degradación de la proteína enzimática y la modificación. Por tanto, es aconsejable el uso de tejidos con los cortos retrasos post mortem y / o seleccionar diferentes muestras dentro de las cohortes de casos. La inmunohistoquímica utilizando anticuerpos estándar para inmunohistoquímica α-syn se debe realizar antes de iniciar el protocolo de aislamiento. La extensión de la patología α-syn es muy variable y puede variar de acuerdo a las regiones seleccionadas. Es aconsejable seleccionar regiones con abundante patología como control positivo para el rendimiento óptimo con cada carrera. El uso de inhibidores de la proteasa y si inhibidores de la fosfatasa sea necesario para prevenir la degradación enzimática no deseado después de la liberación de las proteasas intracelulares o fosfatasas que ocurren durante la lisis celular y el mantenimiento de las muestras a 4 ° C es crucial. Es importante que todas las muestras dentro del lote de experimentos se manejan de manera uniforme y consistente para evitar variaciones intra-usuario; múltiple freciclos eze-descongelación se debe evitar ya que esto puede potencialmente retraer modificaciones postraduccionales como la fosforilación. Un punto crítico a tener en cuenta al examinar un gran número de muestras es que los datos de inmunotransferencias deben ser normalizados a una muestra, que debe ejecutarse en paralelo a todas las otras muestras en los geles, y todos los datos referenciados a esa muestra. Esto se hace para asegurar la normalización de los datos de inmunotransferencia entre varias manchas. Este es el método adoptado en nuestro estudio reciente 22. Cabe señalar que a fin de mantener el fondo bajo ECL, las manchas no se debe permitir que se seque en cualquier momento durante el protocolo de transferencia de western. Además, las exposiciones muy largas (&gt; 10 min) en películas de autorradiografía deben evitarse ya que esto dará lugar a la saturación de la señal de ECL y dará lugar a la cuantificación inexacta. Este protocolo anterior es una técnica relativamente sencilla utilizando reactivos de laboratorio comunes y eninstrumentos y pueden ser una herramienta valiosa para la investigación de la fisiopatología de la proteína α-syn en investigación PD. Esta metodología no sólo se puede ampliar con las modificaciones pertinentes al estudio de la biología de α-syn en animales transgénicos alfa-syn, sino también a otras enfermedades neurodegenerativas que ofrecen los depósitos anormales de proteínas agregadas, tales como AD, MSA, DLB, HD y frontotemporaldementias. Sin embargo los datos de Western blot descritos aquí también podrían ser validados utilizando ensayos inmunoenzimáticos utilizando anticuerpos para formas específicas de α-syn 31.

Una de las características patológicas principales comunes entre varias enfermedades neurodegenerativas es la formación de agregados de proteínas anormales que se produce en una proteína / enfermedad manera específica 1. Por lo tanto, hay las placas beta-amiloides y depósitos característicos extraneuronales tau hiperfosforilada agregados dentro de las neuronas en la enfermedad de Alzheimer (AD); los depósitos de alfa-syn agregados de cuerpos de Lewy (LBS), que son inclusiones intraneuronales, y también dentro de los procesos distróficos neuronal llamadas neuritas de Lewy (LNS) en PD, PD la demencia y la demencia con cuerpos de Lewy (DLBS) 2.4. Depósitos alfa-syn anormales también se observan en lesiones característicos de inclusiones citoplasmáticas gliales en MSA 5. En la enfermedad de Huntington, se encuentran los depósitos de Poli-Q característicos y de unión al ADN Tar anormal de proteína-43 y se fusionan en las proteínas de sarcoma (FUS) se depositan en las demencias frontotemporal. Es importante destacar que para la EP, las mutaciones del gen α-syn se han encontrado para cause autosómica dominante PD 06/11. Además, α-syn triplicación del gen 12 y duplicación 13 también causa PD familiar vinculando así el aumento de expresión α-syn de los mecanismos patogénicos de la EP. En particular, los casos de PD tanto esporádicos y familiares albergan depósitos anormales de la patología α-syn 14. Los tratamientos actuales disponibles para la EP sólo son paliativos y no tienen efecto en detener o retrasar la progresión de la enfermedad inexorable. α-syn se expresa abundantemente en el cerebro humano y representa aproximadamente el 1% de la proteína total del cerebro. Está presente más específicamente dentro de las neuronas, pero puede existir aunque en cantidades más bajas dentro de las células gliales. Un punto conflictivo es la estructura nativa de α-syn que puede existir como un monómero al azar 15 o como un tetrámero plegado 16. Durante la enfermedad, α-syn cambia su conformación que le permite llegar mal plegada y este proceso se cree que es la causa de la enfermedad pathogenesis. A pesar de varios años de investigaciones sobre los aspectos fisiopatológicos de α-syn y la enfermedad, las causas exactas de mecanismos de la enfermedad se han mantenido esquiva 14. Los estudios que utilizan el análisis post-mortem de cerebros parkinsonianos hasta ahora han proporcionado importantes pistas respecto a la biología normal y anormal de α-syn tanto en PD esporádicos y también PD asociado con mutaciones en el gen LRRK2 17-22. Aquí, un protocolo de extracción bioquímica (véase el esquema 1 presenta en la Figura) para los depósitos alfa-syn cada vez más insolubles a partir de tejido cerebral PD post-mortem humano que albergan agregados α-syn en diversos grados se ha descrito. Esta técnica también se puede adaptar con modificaciones en composiciones de amortiguamiento para estudiar las proteínas agregadas de otras enfermedades neurodegenerativas 23,24 y también de animal transgénico 25-27 de tejido cerebral. La consideración principal para las adaptaciones son las diferencias en solubidad y los importes totales de las respectivas proteínas algunos de los cuales son principalmente nuclear y pueden necesitar amortiguadores alto contenido de sal para la extracción óptima como se muestra para FUS 28.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos inhibidores de la proteasa&nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos inhibidores de la fosfatasa&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS tampón de ejecución</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE tampón de transferencia</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P membrana&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM papel de filtro</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris geles 4-12%&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>NP0322BOX</tr><tr><td>Sustrato quimioluminiscente Supersignal West Pico</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC kit de ensayo de proteínas&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de policarbonato Beckman de pared gruesa</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de eliminación de Western blot</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario Syn-1 (monoclonal de ratón)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo primario de beta-actina (monoclonal de ratón&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP cojugado cabra anti-anti-ratón anticuerpo secundario</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotor/ modelo no&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga de sobremesa Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sistemas de calor</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>Jenke y Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

extracción secuencial de soluble e insoluble alfa-sinucleína de cerebros parkinsonianos

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alfa-sinucleína proteína (α-syn) se expresa abundantemente sobre todo dentro de las neuronas, y existe en un número de diferentes formas - monómeros, tetrámeros, oligómeros y fibrillas. Durante la enfermedad, α-syn sufre cambios conformacionales para formar oligómeros y agregados de alto peso molecular que tienden a hacer la proteína más insoluble. Anormalmente agregada α-syn es un rasgo neuropatológico de la enfermedad de Parkinson (EP), la demencia con cuerpos de Lewy (DCL) y la atrofia multisistémica (MSA). Caracterización y análisis de buffers alfa-syn usando insolubles con el aumento de la fuerza de detergente y ultracentrifugación alta velocidad bioquímica proporciona una poderosa herramienta para determinar el desarrollo de la patología α-syn asociado con la progresión de la enfermedad. Este protocolo describe el aislamiento de cada vez insoluble / agregada α-syn partir de tejido cerebral humano post-mortem. Esta metodología se puede adaptar con modificaciones a los estudios de normal y anormal αbiología -syn en modelos de animales transgénicos que albergan mutaciones diferentes alfa-syn, así como en otras enfermedades neurodegenerativas que cuentan con depósitos fibrilares aberrantes de proteínas relacionadas con sus respectivas patologías.

TBS, SDS y urea proteínas solubles extraídas de los ganglios basales siguiendo el protocolo mostrado en la Figura 1 se corrieron en geles y a inmunotransferencia con el Syn-1 monoclonal de ratón α-syn anticuerpo primario. Las fracciones solubles TBS muestran la presencia de monómero α-syn (~ 14 especies kDa) en los casos de PD y de control examinados (Figura 2). Las fracciones solubles SDS también mostraron abundante monómero α-syn en los tres subtipos de casos estudiados como se muestra en la baja exposición blot (Figura 2C). Los casos de PD también mostraron peso molecular (MW) especies alfa-syn superiores como se ve en la parte alta de transferencia de la exposición, que es probable que sean oligómeros (Figura 2C). La urea fracciones solubles a partir de casos de EP mostraron cantidades elevadas de monómeros alfa-syn, oligómeros y agregados especies comparación con el control de los casos. Los casos con EP idiopática neocorticales demuestran una mayor cantidad de AGGREG<html> especies ATED α-syn, mientras que los casos límbicas muestran niveles intermedios de insolubles α-syn. Tanto los SDS y urea fracciones de casos EP idiopática muestran niveles variables de productos alfa-syn truncados a 12 kDa y 6 kDa como se describe 20. Por el contrario, los casos de control no mostraron ninguna α-syn insoluble o agregado (Figura 2E). Medidas Semi-cuantitativos de densidad reflejan la cantidad de carga LB como categoriesd mediante inmunohistoquímica α-syn demostrar la naturaleza insoluble agregada de α-syn (Figura 2B, 2D, 2F) en los casos PD neocorticales y límbicas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de α insoluble procedimiento de extracción -syn.rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> Figura 2. inmunoblots representativos de los niveles -syn alfa de PD y controlar el tejido humano. TBS, SDS y las fracciones solubles de urea de los ganglios basales (una región que alberga la patología α-syn en los casos de PD) de los casos con EP idiopática y neurológicamente normal (control) Se analizaron los cerebros para la presencia de α-syn usando inmunotransferencia occidental. 10 g de proteína se cargaron en cada carril. En TBS fracciones (A), principalmente monómeros α-syn están presentes en todos los casos. En SDS fracciones (C), algunos oligómeros de α-syn se ven junto con monómeros principalmente en el tejido PD. En fracciones de urea (C), monómeros, oligómeros y agregados α-syn se expresan de forma variable en el caso de DP reflecting su respectiva carga LB. Las muestras de control neurológicamente normales muestran la presencia de sólo pequeñas cantidades de monómero α-syn. Por favor, tenga en cuenta los posibles productos de degradación de α-syn se observan en algunos de los casos con alta carga LB. La cabeza de flecha sólida representa la forma monomérica de α-syn. El * posiblemente representa una forma C-terminal truncado de α-syn como se describió previamente 20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Caso </td><td> Sexo </td><td> edad en años de la muerte </td><td> retardo post-mortem (hrs) </td><td> pH de tejido </td></tr><tr><td> Neocortical 1 </td><td> METRO </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> Neocortical 2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35.3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> Límbico 1 </td><td> METRO </td><td> 81 </td><td> 28.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Límbico 2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Control 1 </td><td> METRO </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> Control 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32.5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. demografía limitadas de los casos utilizados

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez más insoluble/agregada a partir de tejido cerebral humano post-mortem. Mediante la utilización de tampones con una fuerza detergente creciente y técnicas de ultracentrifugación de alta velocidad, se pueden examinar las propiedades variables de la agregación α-syn en tejidos enfermos y no enfermos.

Extracción secuencial de soluble e insoluble alfa-sinucleína de cerebros parkinsonianos

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

El objetivo general de esta metodología es extraer alfa-sinucleína soluble e insoluble de cerebros post mortem de pacientes con Parkinson. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la enfermedad de Parkinson. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un procedimiento relativamente sencillo que utiliza reactivos e instrumentos de laboratorio comunes.Después de preparar las soluciones y los tampones necesarios, comience colocando una muestra de 0,5 gramos de tejido de ganglios basales congelado en un pequeño recipiente de Petri. Utilice una hoja de bisturí estéril para picar rápidamente en fragmentos cuadrados de un milímetro. Recopile el tejido picado en un tubo de 15 mililitros y agregue 10 volúmenes de TBS frío con hielo al 1X al tubo.Homogenice las muestras utilizando un homogenizador mecánico a 20.000 rpm durante 10 segundos. Luego enfríe en hielo durante dos minutos. Repita la homogenización tres veces, enfriando en hielo cada vez.Centrifugue el homogenato a 10,000 gs durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante crudo del homogenato a tubos de centrífuga de policarbonato y centrifugue a 100,000 gs durante una hora a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a tubos enfriados sobre hielo y conserve esta fracción como la soluble en TBS.Lave con cinco volúmenes de tampón TBS 1X y centrifugue a 100.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Aspire y deseche el sobrenadante. A continuación, repita el lavado.El lavado exhaustivo de los pellets entre los pasos de ultracentrifugación es fundamental para el éxito de este procedimiento. Después de permitir que las muestras alcancen una temperatura de 10 grados Celsius para evitar la precipitación de SDS, agregue cinco volúmenes de TBS-SDS 1X y resuspenda el pellet final mediante sonicación durante 10 segundos a 20 kilohercios a temperatura ambiente. Ultracentrifugue a 100.000 ×g durante 30 minutos a 25 grados Celsius.Después de la ultracentrifugación, transfiera el sobrenadante a tubos enfriados sobre hielo y conserve como la fracción soluble en SDS. Añada cinco volúmenes de tampón TBS-SDS 1X a temperatura ambiente al precipitado y centrifugue a 100.000 ×g durante 15 minutos a 25 grados Celsius. Deseche el tampón de lavado y repita el lavado.Después de desechar el sobrenadante, agregue 50 microlitros de TBS-SDS-Urea 1X y solubilice utilizando un sonicador ajustado a 20 kilohercios durante 10 segundos. Etiquete esta muestra como la fracción soluble en urea. Es esencial asegurar completamente que todas las proteínas insolubles se extraigan en el procedimiento.Diluya las muestras de TBS-SDS-Urea uno a uno con tampón TBS 1X para permitir la compatibilidad con los reactivos del ensayo de proteínas, y determine el contenido total de proteína en cada fracción utilizando un kit comercial de ensayo de proteínas según el protocolo del fabricante. Aliquote las muestras en alícuotas de 20 microlitros con glicerol al 10 % para reducir ciclos futuros de congelación-descongelación, y almacénelas a 80 grados Celsius negativos. Cargue 10 microlitros de los extractos TBS, TBS-SDS y TBS-SDS-Urea junto con un marcador de peso molecular en un gel de poliacrilamida Bis-Tris al cuatro a 12 % de 10 pocillos, utilizando MOPS como tampón de corrida y técnicas estándar.Corra el gel a 200 voltios durante una hora, o hasta que el colorante azul del tampón de carga haya alcanzado la parte inferior del gel. Humedezca una membrana de nailon en metanol al 100 % y luego sumérjala en tampón de transferencia que contenga metanol al 20 %. Haga una marca identificativa en el blot para determinar el lado de las proteínas y la orientación de los marcadores de peso molecular.Coloque el gel entre la membrana y papel de filtro húmedo. Realice la transferencia durante dos horas a 40 voltios. Bloquee la membrana en una solución de BSA al 5 % en PBS-T 1X durante 30 minutos con agitación a 70 rpm para evitar la unión no específica del anticuerpo primario a la membrana.Detecte la transferencia de proteínas incubando con seis mililitros del anticuerpo primario anti-alfa-sinucleína Syn-1 diluido 1:750 en PBS-T durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, lave la membrana con PBS-T 1X tres veces durante cinco minutos cada vez. A continuación, incube la transferencia con el anticuerpo secundario conjugado con HRP, diluido 1:2.000 en PBS-T, durante 30 minutos.Lave la membrana como antes con PBS-T 1X. Sumerja los blots en solución de quimioluminiscencia mejorada según las instrucciones del fabricante en una habitación oscura. Cubra los blots con película adhesiva y capture la señal utilizando autoradiografía.Después de la obtención de imágenes, incubar el blot de proteínas con seis mililitros de tampón de eliminación para blot de proteínas durante 10 minutos con agitación constante para eliminar la señal del anticuerpo contra la alfa-sinucleína. Repetir el procedimiento de blot de proteínas para detectar la membrana con el anticuerpo primario contra beta-actina en una dilución de uno a 8.000. Escanear y convertir la imagen final en una imagen Tiff y medir las densidades utilizando NIH ImageJ con fines de cuantificación.Las siguientes imágenes son inmunotransferencias representativas de los niveles de alfa-sinucleína en tejido del ganglio basal humano de PD y control. Las fracciones solubles en TBS, SDS y urea se analizaron para detectar la presencia de alfa-sinucleína mediante inmunotransferencia western. Se cargaron 10 miligramos de proteína en cada pozo.En la fracción TBS, los monómeros de alfa-sinucleína están presentes en todos los casos. El asterisco posiblemente representa una forma truncada en el extremo C-terminal de la alfa-sinucleína. En la fracción SDS, se observan algunos oligómeros de alfa-sinucleína junto con los monómeros, indicados por la flecha sólida en el tejido de enfermedad de Parkinson.En la fracción de urea, los monómeros, oligómeros y alfa-sinucleína agregada se expresan de forma variable en los casos de DP, reflejando su carga respectiva de cuerpos de Lewy. Las muestras de control neuroquímicamente normales muestran la presencia de solo pequeñas cantidades de alfa-sinucleína monomérica. Una vez dominada, esta técnica de extracción de proteínas puede realizarse dentro de un día laborable, seguida de inmunotransferencia western al día siguiente, si se realiza adecuadamente.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de los cuerpos de Lewy exploraran especies de alfa-sinucleína insolubles y agregadas en tejido humano patológico y en modelos animales in vivo. No olvide que trabajar con tejido humano no fijado requiere medidas de precaución, y se deben usar guantes y batas de laboratorio durante todos los procedimientos de manipulación.

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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