Name: Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Aprende el ensayo ChIP para identificar sitios de unión proteína-DNA en Arabidopsis in vivo. Este método permite estudiar interacciones cromatínicas y regulación génica en biología vegetal.

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Los autores desean agradecer a The Plant Cell por permitir el uso de algunos datos publicados en esta revista para elaborar los resultados representativos descritos aquí en la Figura 4. Este trabajo ha contado con el apoyo de la Red de Formación Inicial Marie Curie del 7PM de la UE EpiTRAITS (Acuerdo de Subvención 316965), y del Ministerio de Economía y Competitividad de España (subvenciones BIO2010-15589 y BIO2013-43098-R).

1. La reticulación del material vegetal (1 hora) <ol><li> Crecer las líneas de Arabidopsis utilizados en el experimento (de tipo salvaje - WT - frente a los mutantes, y / o líneas que expresan la versión etiquetada de su proteína de interés en comparación con las líneas que expresan la etiqueta no fusionados a cualquier proteína) durante 12-18 días en grandes placas de Petri (150 mm) con medio MS-agar (1 L: Sales de Murashige &amp; Skoog 1x, 10 g de sacarosa, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% de agar). Alternativamente, cultivar plantas en macetas que contenían 3: 1 mezcla de suelo y vermiculita. ¡ATENCIÓN! El formaldehído es tóxico por inhalación, contacto con la piel y por ingestión, y debe ser manejado en una campana química que use el equipo de protección personal adecuado. Los pasos 1.2 a 1.6 se debe realizar bajo la campana de humos. </li><li> Hacer pequeños agujeros en la tapa de los tubos de 50 ml con una aguja de quemador calienta laboratorio. Añadir 40 ml de 1x tampón PBS y 1,08 ml de formaldehído a una concentración final de 1% (acciones 37% solution). Recoger 1,5 g de material vegetal en los tubos de 50 ml. Mantener los tubos en hielo durante la reticulación. </li><li> Cerrar los tubos de 50 ml con la tapa. Colocar los tubos en un desecador y aplicar vacío. Vacío infiltran el tejido durante 10 minutos, a continuación, suelte el vacío con cuidado, para evitar la agitación hasta la solución. Mezclar la muestra. Repetir dos veces. Después de la infiltración, observar el material vegetal y confirme que se vuelve ligeramente translúcido y tienden a hundirse hasta el fondo del tubo (Figura 2). </li><li> Añadir 2,5 ml de 2 M de glicina para lograr una concentración final de 0,125 M. Aplicar vacío durante 5 min. La glicina actúa como un inhibidor competitivo de la reticulación de formaldehído. </li><li> Descartar la solución de PBS-formaldehído glicina invirtiendo el tubo 50 ml cerrado con agujeros en la tapa. </li><li> Enjuagar las plántulas dos veces con PBS 1x y una vez con agua descartando la solución de lavado como se ha descrito en el paso 1.5. Seque con una toalla de papel y congelar en nitroge líquidonorte. NOTA: El tejido congelado se puede mantener a -80 ° C durante semanas. </li></ol> 2. Preparación de los anticuerpos (1 día) NOTA: Para la inmunoprecipitación, se recomienda el uso de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos a través de una proteína G o proteína A enlazador con alta afinidad por el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo. Los complejos ADN-proteína pueden adjuntar inespecíficamente a la superficie de los conjugados anticuerpo-perlas. Por esa razón, es necesario realizar controles sin anticuerpos específicos para cuantificar el fondo unión no específica. <ol><li> Para cada inmunoprecipitación, preparar 15 l de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. La cantidad de perlas depende de la cantidad de la cromatina usado para la inmunoprecipitación y también en los anticuerpos. </li><li> Para lavar, añadir 1 ml de la cromatina Immunoprecipitation (CHIP) tampón de dilución a las perlas, mezclar por rotación y coloque la microcentrífuga de 1,5 ml maestar en una gradilla magnética. Espere alrededor de 1 minuto para que los granos se adhieren al imán. Con los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml fijas en el bastidor, eliminar el sobrenadante con la pipeta. Repetir dos veces. NOTA: Para cada línea de plantas se necesitan dos conjuntos de inmunoprecipitación: una con las perlas y el anticuerpo (Ab) y un segundo anticuerpo de control no (No-Ab) con perlas magnéticas solamente. </li><li> Resuspender las perlas en 200 l de tampón de dilución chip. Añadir la cantidad requerida de la Ab específico para uno de los dos tubos preparados para cada línea de plantas (la dilución exacta difiere para cada Ab y tiene que ser optimizado experimentalmente o, en el caso de los anticuerpos comerciales, siga las instrucciones del fabricante). Utilice esta muestra para la inmunoprecipitación. Añadir la misma cantidad de IgG no específica al otro tubo, que se utilizó como control negativo. </li><li> Incubar O / N en una rueda giratoria a 4 ° C para permitir que el anticuerpo se unen a las perlas. </li></ol> 3. Extracción de la cromatina (4 horas) </p&gt; <ol><li> Moler a fondo el material vegetal congelado en nitrógeno líquido utilizando mortero y mano hasta que el polvo se vuelve verde homogénea y la luz. Transferir el polvo a un nuevo tubo de 50 ml. </li><li> Para ver los pasos 3.2 - 3.6, el trabajo bajo la campana de humos. Añadir 30 ml de tampón de extracción (1 EXB 1), y mezclar bien para absorber el polvo del tejido. A partir de este paso en, mantener las muestras a 4 ° C en todo momento. El tejido congelado y las sobras de nitrógeno líquido hará que el tampón se congele. Asegúrese de descongelar el tejido congelado completamente invirtiendo los tubos 4-5 veces cada 2 min. </li><li> Desactive la suspensión haciéndola pasar a través de un tejido de filtración con tamaño de poro de 22-25 de micras en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y que a 1.000 xg durante 20 min a 4 ° C. NOTA: En este paso, los núcleos y todos los orgánulos se sedimenten. EXB 1 contiene suficiente sacarosa para proporcionar una alta densidad y prevenir la alteración de la estructura del orgánulo. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante por decantación. En este stage, observe una bolita verde de alrededor de 2 ml. </li><li> Resuspender el precipitado en 5 ml de EXB 2. resuspensión del sedimento será difícil en este punto. Centrifugar a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. NOTA: EXB 2 contiene 1% de Triton X-100 para ayudar a estallar los cloroplastos abierta y eliminar la clorofila. </li><li> Resuspender el precipitado en 300 l de tampón de extracción 3 (EXB 3). </li><li> En un tubo de microcentrífuga limpio, añadir 600 l de EXB 3. Tome el pellet resuspendido desde el paso 3.6 y cuidadosamente capa a la que en la parte superior de la limpieza EXB 3. </li><li> Centrifugado durante 1 hora a 16.000 xga 4 ° C. NOTA: Este paso ayuda a eliminar el detergente de la muestra. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración con una pipeta. Resuspender el botón nuclear en 300 l de tampón de sonicación por lentamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo para evitar la formación de burbujas, lo que puede afectar la eficiencia sonicación. Pipetear detenidamente toda la suspensión fuera y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. NOTA: Estetampón contiene SDS, para lisar los núcleos y suelte la cromatina. </li><li> Sonicar la suspensión para lisar los núcleos y al azar cizallar la cromatina en fragmentos pequeños. Utilice las condiciones de sonicación que hacen que la cromatina enriquecido en fragmentos de entre 200 a 800 pb (20-30 ciclos con los ajustes 30 segundos ON / OFF 30 seg a 4 ° C para el dispositivo disponible sonicación se describe en la Tabla de materiales / reactivos). Controlar la eficacia de la sonicación por separación electroforética de los fragmentos de ADN obtenidos en un gel de agarosa 13, la carga de 2 l de cromatina sonicado (Figura 3). PRECAUCIÓN Asegúrese de usar equipo de protección para los oídos durante la etapa de sonicación en caso de que el dispositivo de ultrasonido no está contenido en un gabinete a prueba de sonido. ! Paso crucial La fragmentación de la cromatina depende en gran medida del equipo de ultrasonidos. Las condiciones de sonicación deben ajustarse para lograr el enriquecimiento en los tamaños de ADN apropiadas. VerLa figura 3 para un ejemplo de cómo optimizar la fragmentación de la cromatina. </li><li> Haga girar la solución una vez a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante con la pipeta a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. Deseche la pastilla. Tome 1/10 del sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, marcarlo como entrada y congelación a -20 ° C. </li><li> Diluir la cromatina 10x con tampón de dilución para diluir ChIP SDS hasta una concentración final de 0,1%. Nota: Las muestras pueden ser congeladas y almacenadas a -20 ° C durante varias semanas. </li></ol> 4. La inmunoprecipitación de la proteína de interés y Rescate de ADN (1 día, 3 horas) <ol><li> Lavar las perlas recubiertas con el Ab desde el paso 2.4 tres veces con 1 ml de tampón de dilución ChIP para eliminar el exceso de anticuerpo como se describe en el paso 2.2. Resuspender en 200 l de tampón de dilución chip. Añadir 50 l de aislado de la cromatina. Incubar O / N en una rueda giratoria a 4 ° C. NOTA: Compruebe los concentratien la cromatina en de UV-Vis microvolumen espectrofotómetro. 50 l de aislado de la cromatina deben contener más de 10 g de ADN. </li><li> Para ver los pasos de trabajo 4,2 hasta 4,5 en 4 ° C. Lave las perlas dos veces en 1 ml de tampón de lavado Bajo en sal, como se describe en el paso 2.2. </li><li> Lávese las cuentas una vez en 1 ml de tampón de lavado de alta sal. </li><li> Se lavan las perlas una vez en 1 ml de tampón de lavado LiCl. </li><li> Lavar las perlas dos veces en 1 ml de tampón TE. Después del último lavado, asegúrese de eliminar por completo el tampón TE que queda en el tubo mediante aspiración con una pipeta. </li><li> Saque las muestras de entrada (paso 3.9). Transferencia de 5 l de la entrada a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y continúe como con las muestras de chip. Invertir la reticulación mediante la adición de 200 l de resina de intercambio iónico quelante 5%, y se incuba durante 10 min a 95 ° C agitando cada 2-3 min. Centrifugar a 16.000 xg durante 30 seg y transferir cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga mediante pipeteo. NOTA: Mientras que el tramétodo condicional para la reticulación de reversión implica un / O N incubación con NaCl, la incubación con una resina quelante de iones a 95 ° C permite decrosslinking y la elución del DNA en 10 min eficiente, por lo tanto haciendo que el protocolo de un días más corto. </li><li> Añadir 2 l de proteinasa K (10 mg / ml) y se incuba a 37 ° C durante 30 min para digerir las proteínas y liberar el ADN. </li><li> Detener la reacción mediante incubación a 95 ° C durante 10 min. </li><li> Girar rápidamente a 16.000 xg durante 30 segundos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo con la pipeta. </li><li> Limpie el ADN aislado utilizando un kit de purificación de fragmentos de ADN estándar. NOTA: Proceder de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Transferir la columna del kit de la unión de ADN a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluir el ADN purificado mediante la adición de 20 l de agua libre de DNasa al centro de la columna y girando a 16.000 xg durante 60 seg. Punto de parada: Las muestras pueden ser almacenadas a -80 ° C durante varias semanas. </li></ol&gt; 5. Medir la abundancia de sitios de unión en el ADN inmunoprecipitada por qPCR (4 horas) NOTA: ADN aislado de la cromatina precipitada tiene que ser analizado para determinar qué fragmentos de ADN se han chip-ed de la cromatina total debido a su unión a la proteína de interés. <ol><li> Cebadores de diseño para las regiones genómicas de interés con una temperatura de fusión (Tm) de 60 ° C y un contenido de GC de 30% -80%. Como la cromatina se fragmenta por sonicación, la longitud de secuencia amplificada no debería ser más largo que los nucleótidos 150-200 (Tabla 1). NOTA: Una herramienta útil para el diseño del cebador es Primer 3 del programa (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Directrices adicionales para primer diseño están disponibles en informes anteriores 8, 14,15. </li><li> Utilice un programa BLAST para asegurarse de que los cebadores son específicos (especialmente los promotores pueden compartir secuencias de unión TF similar) y probar el usin eficiencia imprimacióng diluciones 1:10 en el agua del ADN de entrada (paso 4.9). Ciertas regiones del genoma se purificarán mejor que otros. Por tanto, es importante diseñar cebadores de PCR y chequearlos en el ADN de entrada diluida. </li><li> Diluir el ADN purificado 1:10 con agua y pipeta de 5 l de la DNA diluido en un tubo de PCR para cada reacción. NOTA: Diluir solamente la cantidad necesaria, como el ADN se puede unir a las paredes de los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Ciclos de congelación descongelación múltiples aumentan el número de moléculas de ADN adjuntos. Para cada par de cebadores, la amplificación de la entrada, Ab-chip y No-Ab chip tiene que ser analizado. </li><li> Para completar la mezcla de PCR, añadir mezcla maestra SYBR Green PCR a una concentración final de 1x, y 0,5 M de cada cebador. Llenar hasta 20 l con agua libre de DNasa. </li><li> Realizar la reacción qPCR siguiendo las instrucciones del fabricante de mezcla maestra SYBR Green PCR. </li></ol> Análisis 6. Datos NOTA: Entre los existing formas de analizar los datos-chip, dos se utilizan con mayor frecuencia. El primero de ellos es el método de enriquecimiento veces, también nombrado como &quot;enriquecimiento relativo&quot;, &quot;señal de más de fondo&quot; o &quot;en relación con el control sin anticuerpo». El segundo método se denomina como &quot;% de entrada&quot;. <ol><li> Análisis de los datos por el método de enriquecimiento veces. <ol><li> Cree una hoja de cálculo con muestras nombres y valores de Ct primas que se han obtenido después de la reacción qPCR. </li><li> Para cada muestra, restar de su valor Ct prima el valor Ct prima obtenida para el correspondiente control de n-Ab. NOTA: Después de esta operación matemática, el valor Ct para la muestra n-Ab será igual a 0. </li><li> Calcular el enriquecimiento de pliegue por la operación de exponenciación con la base 2 y el exponente (potencia) igual al resto negativo obtenido en el paso 6.1.2 (Tabla 2). doblar el enriquecimiento = 2 - (Ct (muestra) - Ct (n-Ab)) NOTA: En este method la abundancia de un fragmento de ADN específico en la muestra de chip-ed se compara con la abundancia de este fragmento en el control de No-Ab. La asunción de este método es que el nivel de señal de fondo es reproducible entre diferentes conjuntos de cebadores, muestras, y replicar los experimentos. Sin embargo, esta&#39;noise&#39; niveles de señal varían entre los conjuntos de cebadores, muestras y experimentos. </li></ol></li><li> Análisis de los datos por% de método de entrada. <ol><li> Cree una hoja de cálculo con muestras nombres y valores de Ct primas que se han obtenido para ellos después de la reacción qPCR. </li><li> Ajuste los valores de Ct primas para muestras de entrada restando un valor de logaritmo en base 2 de la fracción de la cromatina total extraído que se tomó como una entrada. NOTA: En este protocolo el valor sustraído es igual 3,32, como un 10% del total de la cromatina se tomó como una entrada en este protocolo. Log 2 (10) es igual a 3,32. </li><li> Calcular% de la entrada multiplicando por 100 el valor de la operación de exponenciación con base 2 y el exponente (potencia) igual al resto de valores de entrada ajustados restados de los valores de Ct primas de la muestra (Tabla 3). % De entrada = 100 * 2 (entrada ajustada - Ct (muestra)) NOTA: Con este procedimiento, se calcula la relación entre la abundancia específica de ADN en la muestra chip-ed al aislado de la cromatina (muestra de entrada) en total. Más detalles sobre el análisis de datos ChIP se pueden encontrar en Haring et. Al 8. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El chip de protocolo descrito aquí es una técnica reproducible y potente para analizar las interacciones entre proteínas y secuencias específicas de ADN in vivo en plantas de Arabidopsis. Una identificación exitosa de sitios de unión para las proteínas de interés requiere una adecuada selección de órganos de la planta o etapas de desarrollo, donde las interacciones relevantes en realidad están teniendo lugar. Además, es crítico para obtener una fijación adecuada del material vegetal y un óptimo de corte de la c...

Durante los últimos años una amplia gama de herramientas genéticas, moleculares y genómicos se han desarrollado en la especie modelo Arabidopsis thaliana. Esta tecnología ha facilitado enormemente el progreso en la comprensión de cómo se regula el desarrollo de la planta. Entre los procesos de desarrollo estudiados usando Arabidopsis como modelo, el control genético de la época de floración ha sido ampliamente analizado. Estos estudios han demostrado que las plantas modulan de forma muy precisa el momento de la floración en respuesta a las señales endógenas como las hormonas y la edad de la planta, y también a las señales ambientales como el fotoperiodo y temperatura que sincronizar el tiempo de floración con el ciclo natural de las estaciones 1, 2. El aislamiento y caracterización de mutantes de Arabidopsis con alteraciones en el momento de la floración ha sido determinante en la revelación de una compleja red de genes que regulan el tiempo de floración en respuesta a factores endógenos y ambientales. Estos circuitos son genéticosintegrado a nivel de unos pocos genes maestros que actúan como interruptores de floración, y el momento exacto de la iniciación floral depende del equilibrio de la floración la promoción y la represión de las actividades que funcionan aguas arriba de los genes integradores florales 1,3. La caracterización funcional de los genes identificados por su papel en el control de la iniciación de la floración, ayudado por el uso reciente de enfoques genómicos, han puesto de manifiesto el papel central de la regulación transcripcional en la modulación del tiempo de floración. De hecho, muchos de los genes maestros de la transcripción codifican factores de floración 4. Además, un número de complejos de proteínas remodelación de la cromatina influye en la expresión de genes maestros de floración. Un número de los mutantes de Arabidopsis aislados por su tiempo de floración alterado resultó para llevar a mutaciones en genes que codifican una variedad de modificadores de la cromatina. Diferentes remodeladores de cromatina que introducen modificaciones postraduccionales en histone colas, reposicionar nucleosomas en relación con el ADN o el intercambio de histonas canónicos por variantes de histonas son necesarios para la adecuada regulación de la floración en Arabidopsis 5,6. Algunas de estas actividades de remodelación de la cromatina catalizan la deposición o eliminación de modificaciones covalentes tales como acetilación o metilación de residuos de histonas específicas. Estas marcas histonas son reconocidos específicamente por efectores especializados que reclutan a otros complejos de remodelación de la cromatina, factores de transcripción o componentes de la maquinaria de transcripción para regular la actividad transcripcional de los genes de floración. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) permite la identificación de sitios in vivo para proteínas de interés de unión a ADN (Figura 1). Este procedimiento se aprovecha de la capacidad de ciertos productos químicos para reticular las proteínas al ADN. Los complejos ADN-proteína resultantes pueden ser luego immunoprecipitated utilizando anticuerpos específicos agafactores inst transcripción, proteínas de unión a la cromatina, o modificaciones particulares y epítopos heterólogos (comúnmente conocidos como &quot;etiquetas&quot;) unidos a la proteína de elección. El ADN purificado a partir de estos inmunoprecipitados se puede utilizar como una plantilla en PCR (qPCR) para evaluar las reacciones cuantitativas para el enriquecimiento de secuencias particulares de interés. De esta manera, los sitios de unión de factores de transcripción o la distribución de marcas de histona en los genes particulares pueden establecerse 7,8. Además, combinado con Next Generation Sequencing (NGS), que permite la secuenciación masiva en paralelo, la tecnología chip ha hecho posible la identificación de todo el genoma de los sitios de unión de factores de transcripción, así como revelando paisajes epigenómicos de modificaciones de las histonas. Además, el análisis simultáneo de la expresión génica permite la monitorización cómo la unión de reguladores transcripcionales o la deposición de marcas de histona particulares se correlacionan con la transcripción activity de genes 9. El uso de protocolos de chip en Arabidopsis ha permitido evaluar el impacto que una variedad de reguladores de la transcripción tiene en la organización de la cromatina de los maestros genes de floración y cómo estos cambios estructurales influyen en la expresión de genes 5,6. Los resultados anteriores demostraron que el locus de Arabidopsis EMPERNADO TEMPRANO EN DÍAS CORTOS (EBS) actúa como un represor de la floración y los mutantes en este espectáculo gen una aceleración de la floración y la regulación positiva del gen maestro de FT floración. Además, la pérdida de función de las mutaciones en FT suprimen completamente el fenotipo de floración temprana de las plantas mutantes EBS, lo que indica que FT se requiere para la floración prematura de mutantes EBS y que EBS es necesario para la represión de este gen maestro de la floración 10 , 11. EBS codifica una proteína que contiene PHD-que pueden unirse específicamente di- histona H3 y trimetilada in the lisina 4 residuo (H3K4me2 / 3), lo que sugiere un papel para EBS en la represión de la cromatina mediada por FT 12. El uso del enfoque chip demostró que la Arabidopsis contiene PHD-proteína EBS 10,11 une regiones reguladoras del gen floral FT integrador para reprimir su expresión 12. Los datos adicionales obtenidos a través del uso de la tecnología chip demostraron que esta proteína es necesaria para mantener bajos niveles de acetilación de histonas, un sello distintivo de la transcripción activa, en la cromatina de este gen maestro de floración durante las etapas iniciales del desarrollo de Arabidopsis. Estas observaciones, junto con los datos de expresión genética y el gen, demostrar que esta proteína contiene PHD-Arabidopsis tiene un papel central en el ajuste fino del tiempo de floración mediante la modulación de la expresión del gen integrador floral FT 12. El trabajo presentado aquí proporciona un método optimizado útil no sólo para el análisis de las histonas, sino también para otrocromatina proteínas asociadas, y con el aumento de la eficiencia y reduce el tiempo de experimentación. Además, este informe muestra cómo el uso de protocolos de chip ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la relación entre los cambios en la cromatina modificaciones y los estados de la transcripción de genes de plantas, y cómo estos mecanismos cromatina mediada de impacto control de la expresión génica en el inicio de la floración en Arabidopsis.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (Mezcla de sales basales de Murashige y Skoog)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído 37%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td>Uso bajo la campana</td></tr><tr><td>extractora Mezcla de inhibidores de proteasa cOmplete ULTRA Comprimidos, Mini, sin EDTA, EASYpack</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Dispositivo de sonicación estándar</td><td>Diagenode</td><td>B01010002 (UCD200TO)</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Perlas magnéticas Dynabeads acopladas a proteína A o proteína G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D/10001D</td><td>Comprobar fabricante' s manual de afinidad de anticuerpos</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfact-Amps Detergente</td><td>Solution Life Technologies</td><td>85112</td><td></td></tr> <tr><td>(ratón, rata, conejo &hellip;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001, C15410206</td><td></td></tr><tr><td>Rack magnético - Anticuerpo policlonal DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac - Premium&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Resina</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Myc Tag, clon 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Verde I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la identificación de arabidopsis proteína-dna<em&gt; en vivo</em

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Las intrincadas redes reguladoras de genes orquestan los procesos biológicos y las transiciones de desarrollo en las plantas. La activación transcripcional selectiva y el silenciamiento de genes median la respuesta de las plantas a las señales ambientales y las señales de desarrollo. Por lo tanto, los conocimientos sobre los mecanismos que controlan la expresión génica de las plantas son esenciales para obtener una comprensión profunda de cómo se regulan los procesos biológicos en las plantas. La técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) descrita aquí es un procedimiento para identificar los sitios de unión al ADN de proteínas en genes o regiones genómicas de la especie modelo Arabidopsis thaliana. Las interacciones con el ADN de proteínas de interés como factores de transcripción, proteínas de cromatina o versiones postraduccionales modificadas de histonas pueden analizarse de manera eficiente con el protocolo ChIP. Este método se basa en la fijación de interacciones proteína-ADN in vivo, la fragmentación aleatoria de la cromatina, la inmunoprecipitación de complejos proteína-ADN con anticuerpos específicos y la cuantificación del ADN asociado a la proteína de interés mediante técnicas de PCR. El uso de esta metodología en Arabidopsis ha contribuido significativamente a revelar mecanismos reguladores transcripcionales que controlan una variedad de procesos biológicos de plantas. Este enfoque permitió la identificación de los sitios de unión de la proteína de cromatina EBS de Arabidopsis a las regiones reguladoras del gen maestro de la floración FT. El impacto de esta proteína en la acumulación de marcas de histonas particulares en la región genómica de FT también se reveló a través del análisis de ChIP.

Ocho pasos principales pueden señalarse en este protocolo chip para la identificación de in vivo proteína-DNA, incluyendo cultivo y la recolección de material vegetal, el entrecruzamiento de la cromatina, el aislamiento de la cromatina, la fragmentación de la cromatina, aislamiento selectivo de los complejos entre ADN y la proteína de interés mediante inmunoprecipitación, la digestión de proteínas, purificación de ADN, y análisis de qPCR (Figura 1). Un paso crucial en el chip de protocolo es la...

Inmunoprecipitación de la cromatina es una técnica poderosa para la identificación de ADN sitios de las proteínas de Arabidopsis unión in vivo. Este procedimiento incluye la cromatina entrecruzamiento y la fragmentación, inmunoprecipitación con anticuerpos selectivos contra la proteína de interés, y el análisis qPCR de ADN unido. Se describe un chip de ensayo sencilla optimizada para plantas de Arabidopsis.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em&gt; En Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

El objetivo general de este procedimiento es revelar las interacciones entre proteínas y ADN en la cromatina de células de arabidopsis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vegetal, como qué genes están regulados por un factor de transcripción determinado, o qué modificaciones del sistema se asocian con un estado transcripcional de los genes. La ventaja principal de esta técnica es que, mediante el paso de reticulación, es posible fijar y capturar los cambios en la organización de la cromatina que ocurren durante el desarrollo de la planta.Aunque este método puede proporcionar una idea sobre las interacciones proteicas en arabidopsis thaliana, también puede aplicarse a diferentes órdenes de plantas y adaptarse a otras especies vegetales. Esta técnica será demostrada por Dorota Komar y Alfonso Mouriz, dos estudiantes de doctorado en nuestro laboratorio. Después de cultivar arabidopsis según el protocolo descrito, recolecte 1,5 gramos de material vegetal en tubos de 50 mililitros y manténgalos en hielo durante la reticulación.Luego, utilice una aguja calentada con un mechero de laboratorio para hacer pequeños orificios en las tapas de los tubos. Añada 40 mililitros de PBS 1x y 1,08 mililitros de formaldehído a los tubos. Enrosque las tapas en los tubos y coloque los tubos en un desecador.Infiltra al vacío durante 10 minutos, luego libera cuidadosamente el vacío para evitar agitar la solución. Después de mezclar la muestra, repite los pasos de vacío y mezcla. Tras la infiltración, observa el material vegetal y verifica que se vuelva ligeramente translúcido y se hunda hasta el fondo del tubo.Añada 2,5 mililitros de glicina dos molar para obtener una concentración final de 0,125 molar y aplique el vacío durante cinco minutos. Después de liberar el vacío, deseche la solución invirtiendo los tubos y permitiendo que gotee a través de los orificios en las tapas. Use PBS para enjuagar los plantines dos veces y enjuáguelos con agua una vez.Luego, seque los plantones sobre una toalla de papel antes de congelarlos con nitrógeno líquido. Para cada inmunoprecipitación, prepare 15 microlitros de perlas magnéticas en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Añada un mililitro de tampón de dilución para inmunoprecipitación de cromatina, o tampón de dilución ChIP, a las perlas, mezcle mediante rotación y coloque el tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros en un soporte magnético.Después de permitir que las perlas se adhieran al imán durante aproximadamente un minuto, use un pipetman para eliminar el sobrenadante antes de repetir el lavado. Re-suspenda las perlas en 200 microlitros de tampón de dilución para chip. Para la inmunoprecipitación, agregue la cantidad requerida del anticuerpo específico a uno de los dos tubos preparados para cada muestra ciega de planta.Un factor clave en el éxito del experimento de chip es el anticuerpo elegido para la inmunoprecipitación de la proteína de interés. Los anticuerpos generados contra factores de transcripción vegetales pueden ser útiles para experimentos de chip, pero el suero debe probarse minuciosamente. Por ejemplo, los anticuerpos evaluados únicamente mediante análisis de Western blot no son necesariamente válidos para experimentos de chip.Como control negativo, agregue la misma cantidad de IgG no específica al segundo tubo. Incube los tubos a cuatro grados Celsius durante la noche en una rueda rotatoria para permitir que el anticuerpo se una a las perlas. Utilizando un mortero y un pistilo, muela completamente el material vegetal congelado en nitrógeno líquido hasta que el polvo se vuelva homogéneo y de color verde claro.Transfiera el polvo a un nuevo tubo de 50 mililitros. Bajo una campana extractora, agregue 30 mililitros del tampón de extracción uno y mezcle bien para humedecer completamente el polvo de tejido. A partir de este paso, mantenga las muestras a cuatro grados Celsius en todo momento y asegúrese de que el tejido esté completamente descongelado antes de continuar.Limpie el licuado pasándolo a través de un tejido de filtración con un tamaño de poro de 22 a 25 micrómetros hacia un nuevo tubo de 50 mililitros. Luego, centrifugue a 1.000 × g y 4 grados Celsius durante 20 minutos. Decante suavemente el sobrenadante del precipitado, que debería tener un volumen de aproximadamente dos mililitros.Con cinco mililitros de tampón de extracción dos, re suspenda el precipitado. Luego, centrifugue a 1.000 × g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Después de decantar el sobrenadante, re suspenda el precipitado en 300 microlitros de tampón de extracción tres.En un tubo aparte, agregue 600 microlitros del tampón de extracción tres y luego coloque cuidadosamente el precipitado re-suspendido encima del tampón limpio. Centrifugue el tubo durante una hora a 16.000 × g a cuatro grados Celsius, seguido de la aspiración del sobrenadante con una pipeta. A continuación, use 300 microlitros del tampón de sonicación para resuspender lentamente el precipitado nuclear, evitando la formación de burbujas, las cuales podrían afectar la eficiencia de la sonicación.Transfiera cuidadosamente la suspensión a un tubo limpio de 1,5 mililitros. Somete la suspensión a sonicación para lisar los núcleos y fragmentar aleatoriamente la cromatina en fragmentos de 200 a 600 pares de bases. Verifique los tamaños de los fragmentos de ADN en un gel de agarosa, luego centrifugue la solución a 12.000 ×g y 4 °C durante 10 minutos.Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y deseche el precipitado. Ali-cuote una décima parte del sobrenadante en un tubo nuevo y etiquételo como "input" antes de congelarlo a menos 20 grados Celsius. Finalmente, realice una dilución diez veces mayor del cromatina en tampón de dilución para inmunoprecipitación de cromatina para obtener una concentración final de SDS del 0,1 por ciento.Las muestras pueden entonces congelarse y almacenarse a menos 20 grados Celsius durante varias semanas. Después de incubar las perlas con anticuerpos durante la noche, use un mililitro de tampón de dilución para chip para lavar las perlas tres veces, luego re-suspenda las perlas en un mililitro de cromatina diluida e incube el tubo durante la noche en una rueda rotatoria a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, coloque las perlas en el soporte magnético a cuatro grados Celsius y, tras eliminar la solución, use un mililitro de tampón de lavado de baja salinidad para lavar las perlas dos veces, luego use tampón de lavado de alta salinidad para lavar las perlas una vez.Después de usar un mililitro de tampón de lavado de cloruro de litio para lavar las perlas una vez, utilice un mililitro de tampón TE para lavar las perlas dos veces. Aspire para eliminar completamente el tampón de lavado TE. Una vez que las muestras de entrada se hayan descongelado, transfiera cinco microlitros de cada una a nuevos tubos de 1,5 mililitros y, a partir de este momento, trátelas de manera similar a las muestras de chip.Invierta el entrecruzamiento añadiendo 200 microlitros de resina de intercambio iónico quelante al cinco por ciento e incube a 95 grados Celsius durante 10 minutos, agitando cada dos o tres minutos. Centrifugue a 16.000 ×g durante 30 segundos y transfiera cuidadosamente el sobrenadante a nuevos tubos microcéntrifugos. Añada dos microlitros de proteinasa K al 10 miligramos por mililitro y incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos para digerir las proteínas y liberar el ADN.Para detener la reacción, incubar a 95 grados Celsius durante 10 minutos, centrifugar rápidamente a 16.000 ×g durante 30 segundos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Después de purificar el ADN según el protocolo descrito en el texto, diluir de uno a diez con agua y utilizar cinco microlitros por reacción para medir la abundancia de sitios de unión mediante qPCR. Analizar los datos según el protocolo descrito en el texto.Las hojas de Aribidopsis están cubiertas con capas de cera y tricomas que favorecen la formación de burbujas de aire, lo cual dificulta la penetración de los reactivo de reticulación en el tejido vegetal. Aquí se muestran muestras de plántulas reticuladas que fueron sometidas a reticulación al vacío para aumentar la eficiencia de fijación. Esta figura demuestra que un mayor número de ciclos de sonicación reduce progresivamente el tamaño promedio del ADN en las muestras de chip, alcanzando el enriquecimiento óptimo en el rango de 200 a 600 pares de bases tras 20 a 30 ciclos, como se muestra aquí.Como se observa en esta figura, se han seleccionado cuatro regiones importantes para la regulación transcripcional del locus FT, un gen maestro de la floración, para el análisis. Los resultados de ChIP demuestran que la proteína EBS se combinó con una de las cuatro regiones analizadas, una secuencia reguladora cercana al sitio de inicio de la transcripción de FT. Finalmente, los ensayos ChIP realizados utilizando un anticuerpo dirigido contra la histona H3 acetilada en las lisinas nueve y 14, que se asocia con cromatina transcripcionalmente activa, revelaron una mayor abundancia de H3K9/14ac en plantas mutantes DBS en comparación con plantas silvestres en los cuatro fragmentos genómicos de FT analizados, lo cual es consistente con la sobreexpresión observada de este gen maestro de la floración en este mutante. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo correctamente.Después de seguir este procedimiento, junto con otras medidas como el análisis de expresión génica, se puede contribuir a responder otras preguntas, tales como: ¿Cuál es el papel biológico de la unión de la proteína al ADN? ¿Está implicado en la activación o represión transcripcional? ¿Y qué modificaciones de histonas están asociadas?Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética vegetal exploraran los estados de la cromatina en nuestras células reductoras. Y esto puede extenderse a otras especies vegetales. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo analizar la unión de tu proteína de interés de arábido a ADN in vivo.No olvide que trabajar con reactivos de 2-metoxietanol, formaldehído o sonicador, patógenos y mutaciones en células madre puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como ropa protectora, guantes o protección auditiva al utilizar este procedimiento.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

La impresión es un fenómeno en la planta y reproducción de los mamíferos. Metilación del ADN juega un papel importante en los mecanismos de impresión. Aislar endospermo y determinar el estado de metilación de los genes impresos...

Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo

Un enfoque confiable y útil para detectar modificaciones de las histonas en los genes específicos de la planta se describe. El enfoque combina la cromatina immunoprecipitation (CHIP) y en tiempo real PCR cuantitativa. Que permite la detección de modificaciones de las histonas en los genes específicos con un papel en diversos procesos fisiológicos.

La detección de modificaciones de las histonas en hojas de las plantas

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Este video describe el protocolo para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que es una técnica clásica para demostrar las interacciones proteína-ADN. Esta técnica se utiliza para identificar genes diana en células de leucemia linfocítica crónica humana.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina: una técnica para estudiar las interacciones proteína-ADN en células

En este video, demostramos la técnica de inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas en regiones específicas del ADN genómico de células precursoras de oligodendrocitos a través de la inmunoprecipitación selectiva de fragmentos de cromatina unidos a proteínas. Este método ayuda a estudiar la interacción de varias proteínas reguladoras, incluidos los factores de transcripción implicados en la regulación génica.

Inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas diana en el ADN genómico

Se presenta un método eficiente y simple para aislar embriones en las primeras etapas de desarrollo...

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

Ofrecemos aquí un protocolo eficiente y confiable para la inmunotinción, hibridación in situ fluorescente, la tinción de ADN seguido por cuantitativos, imágenes de alta resolución en óvulos de Arabidopsis thaliana todo el montaje. Este método fue utilizado con éxito para analizar modificaciones de la cromatina nuclear y de la arquitectura.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para realizar el experimento de marcaje de proximidad (PL) en pepino (Cucumis sativus L.) utilizando la proteína AT4G18020 (APRR2)-AirID como modelo. El método describe la construcción de un vector, la transformación de un constructo a través de la agroinfiltración, la infiltración de biotina, la extracción de proteínas y la purificación de proteínas marcadas con biotina a través de la técnica de purificación por afinidad.

Etiquetado de proximidad basado en AirID para la interacción proteína-proteína en plantas

Aprende el ensayo ChIP para identificar sitios de unión proteína-DNA en Arabidopsis in vivo. Este método permite estudiar interacciones cromatínicas y regulación génica en biología vegetal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA

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