Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

El objetivo general de este análisis de flujo extracelular es evaluar las características metabólicas de macrófagos derivados de médula ósea polarizados a fenotipos M1 y M2. Este método puede servir como marco para investigar cómo citocinas específicas, compuestos o códigos genéticos afectan el fenotipo metabólico de los macrófagos. La principal ventaja de esta técnica es que requiere únicamente una pequeña cantidad de macrófagos.

Además, mide todos los parámetros relevantes de la glucólisis y mitocondriales en un solo ensayo. Aunque este método proporciona información sobre el fenotipo metabólico de los macrófagos derivados de médula ósea, también puede aplicarse a todos los tipos de macrófagos o células inmunitarias. Tuvimos la idea de publicar este método en J ya que con frecuencia recibimos solicitudes de otros científicos para ayudarlos con sus ensayos de flujo celular metabólico. En el día ocho del cultivo, verifique la presencia de macrófagos maduros mediante inspección visual e incube los macrófagos maduros derivados de médula ósea en 10 mililitros de solución salina citrato durante cinco minutos.

37 grados Celsius cuando las células se hayan desprendido. Lave el cultivo con 10 mililitros de PBS y cuente el número de células viables. Luego siembre cinco veces 10 a la cuarta células por pocillo.

En una placa de cultivo celular XFE 96, con 100 microlitros de medio de cultivo por pocillo, mantenga la pipeta en un ángulo aproximadamente a la mitad del lado de cada pocillo. Para dispensar las células, agregue solo medio a los pocillos de corrección de fondo A1, A12, H1 y H12. Luego, permita que las células sedimenten a temperatura ambiente en una cabina de cultivo celular durante una hora.

Después de confirmar el cultivo de adherencia, incubar las células en un incubador con dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius. Tres horas después de la siembra, estimular entre cuatro y seis pocillos de células por condición según sea apropiado durante 24 horas. Para polarizar los macrófagos derivados de médula ósea el día anterior al ensayo de flujo extracelular, colocar el cartucho de sensores boca abajo junto a la placa de utilidad y llenar cada pocillo de la placa con 200 microlitros de solución crin.

A continuación, baje el cartucho del sensor sobre la placa de utilidad para sumergir los sensores en la solución de Cain y verifique que el nivel de la solución de Cain sea suficientemente alto para mantener el sensor sumergido. Luego, coloque el cartucho en un incubador no de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, retire suavemente el sobrenadante de los macrófagos polarizados y lave las células con 100 microlitros de ensayo recién preparado.

Medio por pocillo. Añada 180 microlitros de medio de ensayo a cada pocillo y utilice el microscopio para verificar que las células no se hayan desprendido. Si las células aún están adheridas, coloque la placa en el incubador de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono durante una hora antes de realizar el ensayo, mientras las células están en incubación.

Prepare 10 mezclas compuestas de inyección según lo indicado en la tabla y caliente las mezclas a 37 grados Celsius. Luego, cargue el cartucho del sensor con los volúmenes adecuados del compuesto y los puertos A, B, C y D utilizando las guías de carga proporcionadas para caracterizar la bioenergía de los macrófagos polarizados mediante un ensayo de flujo extracelular. Utilice el asistente de ensayo para crear una plantilla de ensayo con tiempos de mezcla de dos minutos y de medición de tres minutos, y al menos tres ciclos de mezcla y medición de velocidad antes de cada una de las cuatro inyecciones y después de la última inyección.

Luego, inicie el ensayo y siga las instrucciones indicadas por el aparato. Cargue la placa de cartucho con las sondas hidratadas para permitir la calibración por parte del aparato y la placa de células. Cuando se indique, al final del ensayo, deseche cuidadosamente todo el medio de ensayo y almacene la microplaca de cultivo celular analizada a menos 20 grados Celsius hasta la normalización.

Para normalizar las células utilizando el kit de ensayo de proliferación celular, descongele la placa e incube las células en 200 microlitros de tampón de lisis celular recién preparado por pocillo durante cinco minutos a temperatura ambiente. Finalmente, mida la fluorescencia con una excitación de aproximadamente 480 nanómetros y un máximo de emisión de aproximadamente 520 nanómetros. Utilice las mediciones de fluorescencia adquiridas para calcular la razón en la que el recuento promedio de células de todos los pocillos con macrófagos ingenuos se establece en uno, y luego exporte estas razones al software de análisis Seahorse Wave.

Para normalizar los datos, un ensayo de flujo extracelular generalmente produce tasas de acidificación extracelular o ECAR y tasas de consumo de oxígeno, o gráficas de OCR como se muestra en esta figura representativa tras la inyección de glucosa; el aumento observado en la ECAR representa la tasa de glucólisis. El incremento adicional observado en la ECAR tras la inhibición de la sintasa de TP con oligomicina proporciona información adicional sobre la reserva y la capacidad glucolítica. Al analizar los valores de OCR, la inyección de CIN facilita el cálculo del consumo de oxígeno utilizado para la síntesis mitocondrial de ATP, mientras que el FCCP desacopla la respiración mitocondrial.

Las mediciones correspondientes de OCR proporcionan datos sobre la capacidad respiratoria máxima y de reserva; sin embargo, la rotenona y la inyección de antimicina a bloquean los complejos mitocondriales uno y tres, dejando un OCR residual que representa el consumo de oxígeno no mitocondrial. La activación de macrófagos con LPS induce un aumento en el metabolismo glucolítico. Las diferencias entre los macrófagos tratados con LPS y con IL-4 se vuelven aún más evidentes al observar las tasas de consumo de oxígeno.

De hecho, aunque el metabolismo oxidativo máximo está altamente suprimido en macrófagos tratados con LPS, la IL-4 induce una respiración robusta en macrófagos M2. Una vez dominado, el ensayo de flujo extracelular puede completarse en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar inyectar ETF junto con FCCP para impulsar la respiración máxima tras el desacoplamiento.

Después de esta técnica, se pueden realizar ensayos adicionales como ELISA para evaluar la polarización eficiente de macrófagos. Esta técnica allanó el camino para que investigadores del campo de la inmunología exploraran las características metabólicas de una amplia variedad de células inmunitarias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis de flujo extracelular para evaluar el fenotipo metabólico de los macrófagos.