Name: Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende a caracterizar el metabolismo de macrófagos M1 y M2 derivados de médula ósea mediante análisis de flujo extracelular en tiempo real. Este método evalúa la glucólisis y función mitocondrial.

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Jan Van den Bossche recibió una beca de postdoctorado junior de la Fundación del Corazón de los Países Bajos (2013T003) y una beca VENI de ZonMW (91615052). Menno de Winther es un investigador establecido de la Fundación Holandesa del Corazón (2007T067), cuenta con el apoyo de una beca de la Fundación Holandesa del Corazón (2010B022) y tiene una beca AMC. También reconocemos el apoyo de la Iniciativa de Investigación Cardiovascular de los Países Bajos, la Federación Holandesa de Centros Médicos Universitarios, la Organización Holandesa para la Investigación y el Desarrollo de la Salud y la Real Academia de Ciencias de los Países Bajos para el proyecto GENIUS "Generación de los mejores objetivos farmacéuticos basados en la evidencia para la aterosclerosis" (CVON2011-19). Agradecemos a Seahorse Bioscience por hacer posible la publicación en acceso abierto. Los autores agradecen a Riekelt Houtkooper y Vincent de Boer (Laboratorio de Enfermedades Metabólicas Genéticas, Centro Médico Académico, Ámsterdam, Países Bajos) por toda la asistencia previa con el analizador Seahorse.

1. Los macrófagos derivados de médula ósea El cultivo y la polarización de hueso <ol><li> Día 0: Aislar fémur y la tibia huesos de 6-10 semanas de edad ratones de interés (C57BL / 6 en este ensayo). </li><li> Retire el tejido muscular de los huesos y colocar los huesos en un 9 cm petri plato lleno de helado de PBS. </li><li> La transferencia de los huesos a un plato de Petri de 9 cm llena de etanol al 70% y agitar suavemente la placa durante 30 segundos. </li><li> La transferencia de los huesos a un nuevo máximo 9 cm placa de Petri llena de PBS estéril enfriado con hielo. </li><li> Cortar el fémur y la tibia en ambos extremos con tijeras estériles. </li><li> Lavar los huesos con 10 ml de PBS estéril enfriado con hielo utilizando una jeringa de 10 ml y una aguja de 25 G. Recoger la médula ósea en un tubo de 50 ml. </li><li> Transferencia de las células de médula ósea a un nuevo tubo de 50 ml utilizando una aguja de 23 G. </li><li> Repita este paso con una aguja de 25 G. Nota: Se necesitan estos pasos para eliminar grupos de células y restos óseos. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Deseche el supernatant y resuspender las células en medio de 40 ml de células de cultivo (RPMI-1640 más 2 mM L-glutamina, 10% de FCS, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml) y 15% filtrada L-929 celular ( ATCC, CCL-1) medio -conditioned que contiene M-CSF (o alternativamente 10 ng ml M-CSF / recombinante en lugar de L-929 medio celular acondicionado). Nota: La generación de medio celular acondicionado L-929 se detalló anteriormente en esta revista en 2013. 11 </li><li> Cultura de las células de un ratón en dos 15 cm placas de Petri (no utilice placas de cultivo tratadas con células desde los macrófagos no se separará de este plástico) en 20 ml de medio de cultivo por la placa en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Añadir 10 ml medio de cultivo celular fresco en días 3, sin la eliminación de los 20 ml de medio de cultivo celular mayor. </li><li> Sustituir el viejo medio de cada placa con 20 ml de medio de cultivo fresco en el día 6. Hacer esto, también se eliminarán las células no adherentes. </li><li> Día 8: <ol><li> Separe las células incubándolas 5 men por lo 37 ° C en 10 ml de solución salina de citrato (cloruro de potasio 135 mM más citrato de sodio 15 mM en H 2 O, autoclave) y se lava con 10 ml de PBS. Cuente macrófagos óseas maduras derivadas de la médula (BMDM) el día 8 usando un contador de células. </li><li> Verificar la formación de maduro (CD11b + F4 / 80 +) BMDM mediante inspección visual o por citometría de flujo. Bloque 10 5 células con anti-CD16 centésima / CD32 en PBS durante 20 minutos en 100 l de PBS, se incuban con 1/200 anti-CD11b-FITC además 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 a TA, lavado y analizar por citometría de flujo. Nota: los macrófagos derivados de médula ósea de ratón El cultivo se ha publicado en detalle anteriormente en esta revista por Ying et al 11.. </li></ol></li><li> Sembrar las células 50.000 (recuentos de células óptimas necesitan ser optimizados) por pocillo en una microplaca de cultivo de células en 100 l de medio de cultivo. No sembrar células en los pozos de corrección de fondo (A1, A12, H1, H12) y poner medio solamente (sin células) en estos pozos. Sugerencia: Mantenga la pipeta en un ángulo uncombate de la mitad del lado de los pozos para la capa celular más homogénea. </li><li> Permita que las células se asienten a temperatura ambiente en una campana de cultivo de células durante 1 hora. Esto promoverá la distribución uniforme de células y reducir los efectos de borde. Supervisar el cumplimiento con un microscopio y la cultura en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Tres horas después de la siembra, estimular las células durante 24 horas con 10 ng / ml de LPS, o 20 ng / ml recombinante de ratón IL-4 para generar M1 o M2 macrófagos, respectivamente. Incluir los macrófagos no tratados naïve (M0) como control. Evaluar adecuada M1 y M2 macrófagos polarización mediante la medición de la secreción de IL-6, IL-12 inducida por LPS, TNF (ELISA) y IL-4 inducida por la arginasa-1 actividad y / o MMR (CD206) y MGL (CD301) expresión en la superficie (citometría de flujo) como se describió anteriormente 3,11. Nota: En este punto, las células pueden ser (pre) tratados con compuestos con farmacológicas de interés o macrófagos pueden ser estimulados con otros factores. Dado que, la variación entre pocillos separados podría ser substantial, es recomendable usar al menos 4 e idealmente 6 pocillos por condición. </li></ol> 2. Preparación del ensayo extracelular Flux <ol><li> Hidratar el cartucho del sensor un día antes de realizar el ensayo: <ol><li> Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de utilidad. </li><li> Llenar cada pocillo de la placa de utilidad con 200 l de solución de calibrante y bajar el cartucho del sensor sobre la placa de utilidad sumergiendo los sensores en la solución calibrante. </li><li> Verifique el nivel de solución calibrador es lo suficientemente alta para mantener los sensores sumergidos y lugar en un no-CO 2 incubadora a 37ºC O / N. </li></ol></li><li> Preparar medio de ensayo en el día del ensayo como sigue: <ol><li> Cálido medio 50 ml de base XF a 37 ° C. </li><li> Añadir 500 l 200 mM de L-glutamina para obtener una mM concentración final 2. </li><li> Ajustar el pH a 7,4 usando NaOH 1 N y esterilizar con un filtro de 0,2 M y mantener el medio de ensayo a 37 ° C. </li></ol></li><li> Retire con cuidado el medio de cultivo celular de los macrófagos polarizadas y almacenarla a -20 ° C para su uso futuro (por ejemplo, ELISA para examinar la polarización de macrófagos adecuada). Lavar las células con medio de ensayo 100 l, añadir 180 l de medio de ensayo por pocillo y verificar bajo el microscopio que las células no se lavaron de distancia. Coloque la placa de cultivo de células en una incubadora a 37ºC sin CO 2 durante 1 hora antes de realizar la prueba. </li><li> Prepare 10 x compuesto inyección de mezclas de A hasta D tal como se describe en la Tabla 1, se calienta a 37 ° C, ajustar el pH a 7,4 y esterilizar filtro. <ol><li> Hacer todos los compuestos en estas mezclas a 10x la concentración final en los pocillos de cultivo celular y optimizar estas concentraciones para cada tipo de célula. </li></ol></li><li> Cargue el cartucho del sensor usando las guías de carga provistos de volúmenes indicados (Tabla 1) de los preparados 10x mezclas de compuestos de la inyección en los puertos A, B, C y D, respectively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Mezcla / Inyección </td><td> Compuestos </td><td> El volumen agregado de conseguir 10x mezcla de (l) </td><td> Volumen medio de ensayo (ml) </td><td> Volumen inyectado durante la marcha (l) </td><td> La concentración final en el ensayo </td></tr><tr><td> LA </td><td> 2,5 M (45%) de glucosa </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> segundo </td><td> 5 mM oligomicina A (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1,5 M </td></tr><tr><td> do </td><td> 5 mM FCCP </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1,5 M </td></tr><tr><td></td><td> Solución 100 mM de piruvato sódico </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> re </td><td> 5 mM antimicina A (AA) </td&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2,5 M </td></tr><tr><td></td><td> Rotenona 5 mM (Rot) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1,25 M </td></tr></tbody></table> Tabla 1. mezclas de inyección. 3. Caracterización Bioenergético de polarizado M1 y M2 BMDM utilizando un extracelular Flux Analizador <ol><li> Crear una plantilla de ensayo con el asistente de ensayo con MIX 2 minutos y 3 veces minutos medir y (al menos) 3 mediciones de mezcla y de tipos de bucles antes de cada una de las 4 inyecciones (Tabla 1) y después de la última inyección. Nota: Estas concentraciones son válidos para los macrófagos derivados de médula ósea y RAW264.7 líneas celulares de macrófagos, pero deben ser optimizados para cada tipo de célula. Se necesita Adición de piruvato en la mezcla de FCCP para alimentar la respiración máxima. </li><li> Empieza la carrera empujando la parte inferior de inicio y siga las instrucciones del aparato. Primera carga el cocheplaca de cartucho con las sondas hidratados para permitir la calibración de aparatos y próxima carga la placa celular. </li><li> Después del ensayo, desechar cuidadosamente todo medio de ensayo y almacenar la cultura de microplacas celulares analizadas a -20 ° C para una futura normalización de células usando el kit de ensayo de proliferación celular como se describe en detalle por el proveedor. <ol><li> Brevemente, preparar un tampón de lisis celular 1x diluyendo el componente B de 20 veces en agua destilada y diluir el compuesto A 400 veces en el tampón de lisis celular 1x. Añadir 200 l por pocillo, incubar 5 minutos a temperatura ambiente y medir la fluorescencia con ~ 180 nm de excitación y de ~ 520 nm máximos de emisión. Nota: Cuando se trabaja con las células no adherentes o si la mala adherencia es una preocupación, el kit de proliferación celular directa se puede utilizar como una alternativa ya que este protocolo no requiere desechar todo medio de ensayo. Sin embargo, este protocolo directa es ligeramente menos sensible en comparación con el protocolo utilizado en este laboratorio. </li></ol></li><li> Después de la medición de la fluorescencia, normalizarel recuento de células en cada pocillo como una relación en la que el recuento de células promedio de todos los pocillos de macrófagos no tratados previamente se ha fijado en 1. Nota: La cuantificación de proteínas (por ejemplo, usando un ensayo de BCA) podría ser utilizado como una forma alternativa para normalizar los recuentos de células. Sin embargo, en nuestras manos este ensayo fue menos sensible en comparación con el kit de ensayo de proliferación celular. </li></ol>

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<li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN+gamma+Priming+of+Macrophages+Represses+a+Part+of+the+Inflammatory+Program+and+Attenuates+Neutrophil+Recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment.</a> J Immunol. , (2015).</li>
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</ol>

El libre acceso a este artículo es patrocinado por Seahorse Bioscience.

El objetivo de nuestro laboratorio es entender cómo la polarización y la función de los macrófagos pueden ser influenciados con el objetivo final de mejorar el resultado de la aterosclerosis y otras enfermedades inflamatorias 12. Para evaluar la polarización de macrófagos, se mide típicamente los LPS (+ IFN) inducida por IL-4 y-inducidos de expresión génica de los genes marcadores M1 y M2 (qPCR), determina IL-6, IL-12, TNF y secreción de NO (por ELISA y Griess reacción) y examina inducida por IL-4 CD71, CD206, CD273 y CD301 expresión en la superficie (por citometría de flujo) y la actividad arginasa 3,13. Adicionalmente, ensayos de apoptosis (por Anexina-V / tinción PI), ensayos de fagocitosis (con perlas fluorescentes de látex y / o pHrodo E. coli) y ensayos de formación de células espumosas (por captación de Dil-oxLDL, la tinción de lípido neutro LipidTOX) se pueden realizar para evaluar la funcionalidad de los macrófagos 14. Además, el análisis de flujo extracelular se puede realizar para medir la bioenergética perfiles de mac polarizadorophages como una lectura funcional nuevo y alternativo. Este manuscrito muestra que la polarización de macrófagos induce la reprogramación metabólica con macrófagos inducida por LPS de conmutación a un aumento de la glucólisis como su fuente de energía. Por el contrario, los macrófagos M2 inducida por IL-4 utilizan la fosforilación oxidativa mitocondrial como la principal fuente de ATP. Es importante destacar que la reprogramación metabólica no sólo proporciona la energía para las necesidades particulares de M1 y M2 macrófagos polarizadas. De hecho, los cambios metabólicos afectan las concentraciones de metabolitos que son reguladores directos del fenotipo de los macrófagos 10,15,16. Por lo tanto, el metabolismo de los macrófagos no sólo es una característica (como se muestra aquí en la Figura 2), sino también un conductor de distintos estados de polarización de macrófagos y este nuevo conocimiento apoya el rápido crecimiento del área de investigación immunometabolism durante el último par de años. Sin embargo, las mediciones robustas de perfiles metabólicos en macrofagos seguido siendo difícil y tenían sus limitaciones. En este estudio, un analizador de flujo extracelular se aplica para medir la firmeza glucólisis, reserva glucolítica, la capacidad glucolítica máxima, la acidificación no glucolítica, basal y la respiración máxima, la producción de ATP, la capacidad respiratoria repuesto, fuga de protones y la respiración no mitocondrial en tiempo real en una cantidad mínima de los macrófagos. Por lo tanto, hemos modificado y mejorado los protocolos del fabricante de la siguiente manera. La Prueba de Estrés Mito estándar (# 103015-100) sugiere el uso de medio con glucosa y piruvato y un protocolo con 3 inyecciones (OM, FCCP, AA / Rot). Optamos para iniciar el ensayo con glucosa / medio-piruvato libre, añadir la glucosa como una primera inyección en el puerto A (como en el glucólisis Estrés Prueba # 103020-100) y añadir piruvato junto con el desacoplador FCCP en el puerto C. De esta manera , todos los parámetros relevantes glucólisis se derivan de las mediciones ECAR 1-9 y toda la información relevante acerca de mitochondrial partir de mediciones de la función OCR 4-15. Tenga en cuenta que es fundamental para inyectar piruvato junto con FCCP para alimentar la respiración máxima sobre desacoplamiento. Antes de utilizar este protocolo combinado, también hay que verificar que 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) disminuye los niveles de ECAR después del ensayo a los valores basales (1-3) y que las tasas de ECAR grabadas 4-6 son de hecho debido a la glucólisis. Además, se debe comprender que las concentraciones de los productos y el número de células utilizadas en este manuscrito son válidos para los macrófagos derivados de médula ósea y RAW264.7 líneas celulares de macrófagos y deben ser optimizados para otros tipos de células. Por otra parte, hay que señalar que M-CSF que se usa para generar los macrófagos derivados de médula ósea promueve un fenotipo anti-inflamatoria M2-similares. Los resultados presentados a partir de macrófagos derivados de médula ósea pueden ser, por tanto, no ser totalmente comparables a las mediciones con los macrófagos residentes tejido primario o macrófagos líneas celulares que no requieren M-CSF durante Culturi celularng. En comparación con los métodos existentes, este protocolo requiere cantidades mínimas de los macrófagos y rápidamente ofrece prácticamente todas las características fundamentales de células metabólicas. Esto resulta en suficientes células excedentes para llevar a cabo otros ensayos inmunológicos e incluso las células usadas para la bioenergética de perfiles todavía podría ser utilizado para otros propuesto después del ensayo. Además, el formato de placa de 96 pozo en particular permite la evaluación de múltiples condiciones en tiempo real al mismo tiempo. Sin embargo, la variación entre los pozos individuales puede ser considerable y por lo tanto a menudo se desea el uso de al menos 4 pocillos por condición. Tomado en cuenta esta limitación, el análisis de flujo extracelular descrito todavía permite ejecutar más de 10 condiciones experimentales (n = 6) a la vez, lo que es mucho más que las técnicas tradicionales. En general, este artículo proporciona un ensayo funcional fácil y reproducible que permite medir toda la glucólisis relevante y param mitocondrialetros en subconjuntos de macrófagos polarizadas. Esta técnica puede servir como una aplicación futura para evaluar la función de los macrófagos y para evaluar el efecto de manipulaciones distintas (por ejemplo, genes derribar, nuevos productos farmacéuticos, etc.) en (metabólica) fenotipo de los macrófagos. Como tal, los datos de flujo extracelulares pueden ser utilizados en conjunción con otros ensayos para permitir la caracterización en profundidad de el estado de activación de los macrófagos.

Mientras que los macrófagos juegan un papel central en prácticamente todas las enfermedades, los mecanismos moleculares que regulan su fenotipo todavía no están totalmente desenredado. Los macrófagos muestran gran heterogeneidad y en respuesta a la microambiente adoptan diferentes fenotipos 1. LPS (+ IFN) inducida clásicamente activados M1 o M (LPS) macrófagos promueven la inflamación y protegen al huésped frente a diferentes tipos de amenazas microbianas 2. Otros utilizan IFN solo o en combinación con TNF como estímulos para provocar M1 polarización. IL-4 y / o IL-13 induce la activación de macrófagos alternativa y estos M2 o células M (IL-4) son potentes supresores y reguladores de la respuesta inmune en curso 3. Macrófagos polarizadas muestran una regulación distinta del metabolismo celular con macrófagos M1 activados con LPS de someterse a un cambio metabólico para mejorar la glucólisis 4-6. Oxidación de ácidos grasos contrario, mejorado (FAO) y oxidativ mitocondriale fosforilación (fosforilación oxidativa) proporciona energía sostenida en los macrófagos M2 inducidas por IL-4 7-9. Por lo tanto, el metabolismo alterado no sólo es una característica de los subconjuntos de macrófagos polarizadas, también es un requisito previo para la polarización adecuada y la regulación inflamatoria. Es importante destacar que la inhibición de la glicólisis o la fosforilación oxidativa / FAO se ha demostrado que la activación deteriorar M1 o M2, respectivamente 8,10. Como tal, la identificación de los cambios metabólicos en los macrófagos podrían aplicarse como una herramienta para evaluar su estado de polarización y potencial inflamatorio. Por consiguiente, un ensayo consistente que mide el metabolismo de macrófagos podría ser utilizado para predecir si un fármaco, gen derribar u otro tratamiento afecta a la polarización y la función de los macrófagos. En este video, un analizador de flujo extracelular se utiliza para caracterizar los perfiles bioenergética de ingenuos, M1 y M2 macrófagos. Este manuscrito detalla un protocolo optimizado que permite la mediciónde todos los parámetros relevantes glucólisis (glucólisis, glucólisis máxima y reserva glucolítica) y características de la función mitocondrial (respiración total, la respiración mitocondrial basal, la producción de ATP, de fugas de protones, la respiración máxima y capacidad respiratoria repuesto) en un solo ensayo. El uso de este sistema experimental, bioenergética se pueden comparar entre el control y &#39;alterado&#39; (por ejemplo, gen tumbar, la sobreexpresión transgénica o tratamiento farmacológico) células.

<table><tbody><tr><td>Agujas de 23G y 25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>#300800 y #300600</td><td>A la médula ósea lavada</td></tr><tr><td>Jeringas de 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>#307736</td><td>A la médula ósea enrojecida</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Greiner</td><td>#639161</td><td>Al cultivo de células de médula ósea</td></tr><tr><td>CyQUANT Cell Proliferation Assay kit&nbsp;</td><td>Sondas moleculares</td><td>#C7026</td><td>Para la cuantificación celular en un punto de tiempo posterior (funciona solo para células adherentes)</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proliferación celular directa CyQUANT&nbsp;</td><td>Sondas moleculares</td><td>#35011</td><td>Para la cuantificación celular inmediatamente después del ensayo (células no adherentes)</td></tr><tr><td>XFe96 microplaca de cultivo celular</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#101085-004 Placa de</td><td>96 pocillos en la que se cultivan las células y en la que se realiza el ensayo</td></tr><tr><td>Interleucina-4 de ratón recombinante (IL-4)</td><td>Peprotech</td><td>#214-14-B</td><td>Se utiliza para inducir la activación</td></tr> <tr><td>alternativa de macrófagoslipopolisacárido (LPS)</td><td>Sigma</td><td>#L2637</td> Cartucho <td>sensor de caballito de mar de estímulo proinflamatorio</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102416-100</td><td>Contiene las sondas para la medición de pH y O2</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#100840-000</td><td>Necesario para hidratar las sondas durante la noche&nbsp;</td></tr><tr><td>Base XF media&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102353-100</td><td>Medio libre de tampones que permite la medición eficiente de los cambios de pH</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>#G8769</td><td>Alimenta la glucólisis una vez añadida a las células</td></tr><tr><td>oligomicina A</td><td>Sigma</td><td>#75351</td><td>Inhibe la ATP sintasa mitocondrial</td></tr><tr><td>FCCP( Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona)</td><td>Sigma</td><td>#C2920</td><td>Desacopla la respiración mitocondrial</td></tr><tr><td>100 mM Solución de piruvato de sodio</td><td>Lonza</td><td>#BE13-115E</td><td>Permite la máxima respiración mitocondrial sin necesidad de glucólisis</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674</td><td>Inhibe el complejo III de las mitocondrias</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674R8875</td><td>Inhibe el complejo I de la mitocondrias</td></tr><tr><td>Contador de células de Casy</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#05 651 697 001</td><td>Instrumento para contar células</td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>eBioscience</td><td>#14-0161</td><td>Citometría de flujo de bloqueo de receptores Fc</td></tr><tr><td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>#47-4801</td><td>Anticuerpo para teñir macrófagos</td></tr><tr><td>anti-CD11b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>#11-0112</td><td>Anticuerpo para teñir macrófagos</td></tr></tbody></table>

caracterización metabólica de polarizado m1 y macrófagos derivados de médula ósea m2 uso del análisis extracelular flux en tiempo real

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Las vías metabólicas específicas se reconocen cada vez más como características críticas de los subconjuntos de macrófagos. Mientras que los macrófagos M1 o M (LPS) activados clásicamente inducidos por LPS son proinflamatorios, la IL-4 induce una activación alternativa de los macrófagos y estos llamados M2 o M (IL-4) favorecen la resolución de la inflamación y la cicatrización de heridas. La evidencia reciente muestra el papel crucial de la reprogramación metabólica en la regulación de la polarización de los macrófagos M1 y M2. 
En este manuscrito, se aplica un analizador de flujo extracelular para evaluar las características metabólicas de macrófagos derivados de médula ósea de ratón con polarización M1 y M2 naïve. Este instrumento utiliza sensores de pH y oxígeno para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR), que pueden estar relacionadas con el metabolismo oxidativo glucolítico y mitocondrial. Como tal, tanto la glucólisis como el metabolismo oxidativo mitocondrial se pueden medir en tiempo real en un solo ensayo.
Utilizando esta técnica, demostramos aquí que los macrófagos M1 inflamatorios muestran un metabolismo glucolítico mejorado y una actividad mitocondrial reducida. Por el contrario, los macrófagos M2 antiinflamatorios muestran una alta fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) y se caracterizan por una mayor capacidad respiratoria ociosa (SRC). 
El ensayo funcional presentado sirve como marco para investigar cómo citocinas particulares, compuestos farmacológicos, knock-outs de genes u otras intervenciones afectan el fenotipo metabólico y el estado inflamatorio del macrófago.

Después de terminar el ensayo y la cuantificación de células de flujo extracelular, los datos se pueden normalizar para el recuento de células y se analizaron. Normalmente, esto dará lugar a ECAR y OCR parcelas como se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B. Después de la inyección de glucosa (A), el aumento de ECAR representa la tasa de glucólisis. El aumento adicional de la ECAR después de la inhibición ATP sintasa con oligomicina (B) proporciona información acerca de la reserva glicolítica y la capacidad (Figura 1A). Al analizar los valores de OCR, oligomicina inyección (B) permite el cálculo del consumo de oxígeno utilizado para la síntesis de ATP mitocondrial. FCCP (C) desacopla la respiración mitocondrial y las mediciones de OCR correspondientes dió datos sobre la máxima y la capacidad respiratoria de repuesto. Por último, la inyección de rotenona (Rot) y antimicina A (AA) bloquean mitocondrial complejo I y III y el OCR residual representa los contras de oxígeno no mitocondrialesumption (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> Figura 1: Parámetros metabólicos derivados de un ensayo de flujo de XF extracelular. (A) A raíz de los parámetros de la glucólisis celular se calcula a partir de los valores ECAR (en MPH / min): glucólisis, la máxima capacidad glucolítica y reserva glucolítica. Mediciones (B) OCR (en pmoles / min) se utilizan para calcular los siguientes parámetros fundamentales de la función mitocondrial: respiración basal, la producción de ATP, la fuga de protones, la respiración y la máxima capacidad respiratoria de repuesto. Gluc = glucosa; OM = oligomicina A; FCCP = cianuro de carbonilo 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona; AA = antimicina A; Rot = rotenona <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Después de la carrera, ECAR y OCR mediciones 1 till 15 para cada pozo se puede exportar a Excel y los siguientes parámetros glucolíticas puede calcularse a partir de las mediciones ECAR de la siguiente manera: La acidificación no glucolítica = avg. ECAR (1,2,3) La glucólisis = avg. ECAR (4,5,6) - avg. ECAR (1,2,3) Máxima capacidad glucolítica = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (1,2,3) Reserva glucolítica = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (4,5,6) A partir de las tasas de OCR, los próximos características metabólicas se pueden determinar: La respiración para no mitocondrial = avg. OCR (13,14,15) Respiración basal = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (13,14,15) La producción de ATP = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (7,8,9) Protón fuga =avg. OCR (7,8,9) - avg. OCR (13,14,15) Respiración máxima = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (13,14,15) La capacidad respiratoria de repuesto (SRC) = promedio. OCR (10,11,12) - avg. OCR (4,5,6) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> Figura 2:. Características metabólicas de naïve (M0), LPS (M1) y la IL-4- (M2) macrófagos polarizadas Para cada medición, la media y el error estándar de la media (SEM) de 8 pocillos individuales se presenta. (A) las tasas de acidificación extracelular (ECAR, en mph / min) y (b) Las tasas de consumo de oxígeno (OCR, en pmoles / min) se miden de manera diferencial polarizado (M1 y M2) y macrófagos ingenuos (M0). Todas las mediciones se normalizaron para el recuento de células (tal como se mide con CyQUANT) y el recuento de células promedio de los macrófagos no tratados previamente se fijó en 1. Eninyección A = glucosa; B = oligomicina; C = FCCP; D = antimicina A + rotenona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Como se muestra en la Figura 2A, la activación de macrófagos con LPS induce aumento del metabolismo glicolítico. Las diferencias entre LPS y macrófagos tratados con IL-4 son aún más evidente cuando se mira en las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en la Figura 2B. En efecto, mientras que el metabolismo oxidativo máxima es altamente suprimida en M (LPS), IL-4 induce la respiración basal y especialmente máxima en los macrófagos M2. Hay que señalar que el aumento de glicolítica es bastante singular de M (LPS) macrófagos y no es necesariamente una característica de los macrófagos M1 desde M (IFN) macrófagos no se muestran a mejorar la glucólisis. En general, este análisis de flujo extracelular demuestra thainducida IL-4-t macrófagos M2 se caracterizan por el metabolismo oxidativo mejorado y sobre todo una gran capacidad respiratoria repuesto (SRC), mientras que la pantalla LPS-macrófagos activados mejora el metabolismo glucolítico y no posee ninguna capacidad respiratoria de repuesto.

La reprogramación metabólica es una característica y un requisito previo para la polarización de los macrófagos M1 y M2. Este manuscrito describe un ensayo para la medición de los parámetros fundamentales de la glucólisis y la función mitocondrial en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón. Esta herramienta se puede aplicar para investigar cómo factores particulares afectan el metabolismo y el fenotipo del macrófago.

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

El objetivo general de este análisis de flujo extracelular es evaluar las características metabólicas de macrófagos derivados de médula ósea polarizados a fenotipos M1 y M2. Este método puede servir como marco para investigar cómo citocinas específicas, compuestos o códigos genéticos afectan el fenotipo metabólico de los macrófagos. La principal ventaja de esta técnica es que requiere únicamente una pequeña cantidad de macrófagos.Además, mide todos los parámetros relevantes de la glucólisis y mitocondriales en un solo ensayo. Aunque este método proporciona información sobre el fenotipo metabólico de los macrófagos derivados de médula ósea, también puede aplicarse a todos los tipos de macrófagos o células inmunitarias. Tuvimos la idea de publicar este método en J ya que con frecuencia recibimos solicitudes de otros científicos para ayudarlos con sus ensayos de flujo celular metabólico. En el día ocho del cultivo, verifique la presencia de macrófagos maduros mediante inspección visual e incube los macrófagos maduros derivados de médula ósea en 10 mililitros de solución salina citrato durante cinco minutos.37 grados Celsius cuando las células se hayan desprendido. Lave el cultivo con 10 mililitros de PBS y cuente el número de células viables. Luego siembre cinco veces 10 a la cuarta células por pocillo.En una placa de cultivo celular XFE 96, con 100 microlitros de medio de cultivo por pocillo, mantenga la pipeta en un ángulo aproximadamente a la mitad del lado de cada pocillo. Para dispensar las células, agregue solo medio a los pocillos de corrección de fondo A1, A12, H1 y H12. Luego, permita que las células sedimenten a temperatura ambiente en una cabina de cultivo celular durante una hora.Después de confirmar el cultivo de adherencia, incubar las células en un incubador con dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius. Tres horas después de la siembra, estimular entre cuatro y seis pocillos de células por condición según sea apropiado durante 24 horas. Para polarizar los macrófagos derivados de médula ósea el día anterior al ensayo de flujo extracelular, colocar el cartucho de sensores boca abajo junto a la placa de utilidad y llenar cada pocillo de la placa con 200 microlitros de solución crin.A continuación, baje el cartucho del sensor sobre la placa de utilidad para sumergir los sensores en la solución de Cain y verifique que el nivel de la solución de Cain sea suficientemente alto para mantener el sensor sumergido. Luego, coloque el cartucho en un incubador no de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, retire suavemente el sobrenadante de los macrófagos polarizados y lave las células con 100 microlitros de ensayo recién preparado.Medio por pocillo. Añada 180 microlitros de medio de ensayo a cada pocillo y utilice el microscopio para verificar que las células no se hayan desprendido. Si las células aún están adheridas, coloque la placa en el incubador de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono durante una hora antes de realizar el ensayo, mientras las células están en incubación.Prepare 10 mezclas compuestas de inyección según lo indicado en la tabla y caliente las mezclas a 37 grados Celsius. Luego, cargue el cartucho del sensor con los volúmenes adecuados del compuesto y los puertos A, B, C y D utilizando las guías de carga proporcionadas para caracterizar la bioenergía de los macrófagos polarizados mediante un ensayo de flujo extracelular. Utilice el asistente de ensayo para crear una plantilla de ensayo con tiempos de mezcla de dos minutos y de medición de tres minutos, y al menos tres ciclos de mezcla y medición de velocidad antes de cada una de las cuatro inyecciones y después de la última inyección.Luego, inicie el ensayo y siga las instrucciones indicadas por el aparato. Cargue la placa de cartucho con las sondas hidratadas para permitir la calibración por parte del aparato y la placa de células. Cuando se indique, al final del ensayo, deseche cuidadosamente todo el medio de ensayo y almacene la microplaca de cultivo celular analizada a menos 20 grados Celsius hasta la normalización.Para normalizar las células utilizando el kit de ensayo de proliferación celular, descongele la placa e incube las células en 200 microlitros de tampón de lisis celular recién preparado por pocillo durante cinco minutos a temperatura ambiente. Finalmente, mida la fluorescencia con una excitación de aproximadamente 480 nanómetros y un máximo de emisión de aproximadamente 520 nanómetros. Utilice las mediciones de fluorescencia adquiridas para calcular la razón en la que el recuento promedio de células de todos los pocillos con macrófagos ingenuos se establece en uno, y luego exporte estas razones al software de análisis Seahorse Wave.Para normalizar los datos, un ensayo de flujo extracelular generalmente produce tasas de acidificación extracelular o ECAR y tasas de consumo de oxígeno, o gráficas de OCR como se muestra en esta figura representativa tras la inyección de glucosa; el aumento observado en la ECAR representa la tasa de glucólisis. El incremento adicional observado en la ECAR tras la inhibición de la sintasa de TP con oligomicina proporciona información adicional sobre la reserva y la capacidad glucolítica. Al analizar los valores de OCR, la inyección de CIN facilita el cálculo del consumo de oxígeno utilizado para la síntesis mitocondrial de ATP, mientras que el FCCP desacopla la respiración mitocondrial.Las mediciones correspondientes de OCR proporcionan datos sobre la capacidad respiratoria máxima y de reserva; sin embargo, la rotenona y la inyección de antimicina a bloquean los complejos mitocondriales uno y tres, dejando un OCR residual que representa el consumo de oxígeno no mitocondrial. La activación de macrófagos con LPS induce un aumento en el metabolismo glucolítico. Las diferencias entre los macrófagos tratados con LPS y con IL-4 se vuelven aún más evidentes al observar las tasas de consumo de oxígeno.De hecho, aunque el metabolismo oxidativo máximo está altamente suprimido en macrófagos tratados con LPS, la IL-4 induce una respiración robusta en macrófagos M2. Una vez dominado, el ensayo de flujo extracelular puede completarse en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar inyectar ETF junto con FCCP para impulsar la respiración máxima tras el desacoplamiento.Después de esta técnica, se pueden realizar ensayos adicionales como ELISA para evaluar la polarización eficiente de macrófagos. Esta técnica allanó el camino para que investigadores del campo de la inmunología exploraran las características metabólicas de una amplia variedad de células inmunitarias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis de flujo extracelular para evaluar el fenotipo metabólico de los macrófagos.

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Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real (Video) | JoVE Journal

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

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