Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

El objetivo general de este análisis de flujo extracelular es evaluar las características metabólicas de los macrófagos M1 y M dos derivados de la médula ósea polarizados sin previo análisis. Este método puede servir como marco para investigar cómo determinadas citocinas, compuestos o códigos genéticos afectan al fenotipo metabólico de los macrófagos. La principal ventaja de esta técnica es que solo requiere una pequeña cantidad de macrófagos.

Además, mide todos los parámetros mitocondriales y de glucólisis relevantes en un solo ensayo. Aunque este método proporciona información sobre el fenotipo metabólico de los macrófagos derivados de la médula ósea, también se puede aplicar a todos los tipos de macrófagos o células inmunitarias. Tuvimos la idea de publicar este método en J ya que frecuentemente recibimos solicitudes de otros científicos para ayudarlos con sus ensayos de flujo celular de acceso metabólico. En el octavo día de cultivo, verificar la presencia de macrófagos maduros mediante inspección visual e incubar los macrófagos maduros derivados de la médula ósea en 10 mililitros de solución salina de citrato durante cinco minutos.

A 37 grados centígrados cuando las células se han desprendido. Lave el cultivo con 10 mililitros de PBS y cuente el número de células viables. A continuación, siembre cinco veces 10 hasta la cuarta celdilla por pocillo.

En un cultivo celular XFE 96, microplaca en 100 microlitros de medio de cultivo por pocillo, sosteniendo la pipeta en un ángulo aproximadamente a la mitad del costado de cada pocillo. Para dispensar las celdas, agregue medio solo a los pocillos de corrección de fondo A uno, A 12, H uno y H 12. A continuación, deje que las células se asienten a temperatura ambiente en una campana de cultivo celular durante una hora.

Después de confirmar el cultivo de adherencia, las células en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius. Tres horas después de la siembra, estimule entre cuatro y seis pocillos de células por condición, según corresponda, durante 24 horas. Para polarizar los macrófagos derivados de la médula ósea el día antes del ensayo de flujo extracelular, coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de utilidad y llene bien cada placa con 200 microlitros de solución de crin.

A continuación, baje el cartucho del sensor sobre la placa de utilidad para sumergir los sensores en la solución de Cain y verifique que el nivel de la solución de Cain sea lo suficientemente alto como para mantener el sensor sumergido. A continuación, coloque el cartucho en una incubadora sin dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, retire suavemente el sobrenadante de los macrófagos polarizados y lave las células con 100 microlitros de ensayo recién preparado.

Medio por pocillo. Agregue 180 microlitros de medio de ensayo a cada pocillo y use el microscopio para verificar que las células no se hayan lavado. Si las células aún están unidas, coloque la placa en la incubadora de dióxido de carbono sin dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una hora antes de la ejecución del ensayo mientras las células están incubando.

Prepare 10 mezclas de compuestos de inyección como se indica en la tabla y caliente las mezclas a 37 grados centígrados. A continuación, cargue el cartucho del sensor con los volúmenes adecuados de compuesto y los puertos A, B, C y D utilizando las guías de carga proporcionadas para caracterizar la bioenergía de los macrófagos polarizados mediante un ensayo de flujo extracelular. Utilice el asistente de ensayo para crear una plantilla de ensayo con tiempos de mezcla de dos minutos y de medición de tres minutos, y al menos tres bucles de medición de mezcla y velocidad antes de cada una de las cuatro inyecciones y después de la última inyección.

A continuación, inicie el ensayo y siga las instrucciones indicadas por el aparato. Carga de la placa del cartucho con las sondas hidratadas para permitir la calibración por el aparato y la placa de la célula. Cuando se le indique, al final del ensayo, deseche cuidadosamente todo el medio de ensayo y almacene la microplaca de cultivo celular analizada a menos 20 grados Celsius hasta la normalización.

Para normalizar las células utilizando el kit de ensayo de proliferación celular, descongele la placa e incube las células en 200 microlitros de tampón de lisis celular recién preparado por pocillo durante cinco minutos a temperatura ambiente. Por último, mida la fluorescencia con una excitación de unos 480 nanómetros y unos máximos de emisión de 520 nanómetros. Utilizando las mediciones de fluorescencia adquiridas para calcular la proporción en la que el recuento medio de células de todos los pocillos de macrófagos ingenuos se establece en uno, luego exporte estas proporciones al software de análisis de olas de caballito de mar.

Para normalizar los datos, un ensayo de flujo extracelular generalmente arrojará la tasa de acidificación extracelular o ECAR y la tasa de consumo de oxígeno, o gráficos OCR como se muestra en esta figura representativa después de la inyección de glucosa, el aumento observado en ECAR representa la tasa de glucólisis. El aumento adicional observado en el ECAR después de una inhibición de la TP sintasa con toda la micina de liga proporciona más información sobre la reserva y la capacidad glucolítica. Al analizar los valores de OCR, la inyección de CIN facilita el cálculo del consumo de oxígeno utilizado para la síntesis de TP A mitocondrial, FCCP desacopla la respiración mitocondrial.

Las mediciones de OCR correspondientes proporcionan datos sobre la capacidad respiratoria máxima y ociosa conocida y antimicina una inyección, sin embargo, bloquean los complejos mitocondriales uno y tres con el OCR residual que representa el consumo de oxígeno no mitocondrial. La activación de los macrófagos con LPS induce un aumento del metabolismo glucolítico. Con las diferencias entre LPS e IL, cuatro macrófagos tratados se hacen aún más evidentes cuando se observan las tasas de consumo de oxígeno.

De hecho, mientras que el metabolismo oxidativo máximo está altamente suprimido en los macrófagos tratados con LPS, IL 4 induce una respiración robusta en M dos macrófagos. Una vez dominado, el ensayo de gripe extracelular puede completarse en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar inyectar veterinario junto con FCCP para alimentar la respiración máxima al desacoplarse.

Después de esta técnica, se pueden realizar ensayos adicionales como Eliza para evaluar la polarización eficiente de los macrófagos. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la inmunología exploraran las características metabólicas de una amplia gama de células inmunitarias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis de flujo extracelular para evaluar el fenotipo metabólico de los macrófagos.