Mejora de la generación de cardiomiocitos inducida uso de un constructo Polycistronic Expresando relación óptima de Gata4, MEF2C y Tbx5

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo generar de manera eficiente cardiomiocitos inducidos a partir de fibroblastos cardíacos con una construcción de MGT policónica, que expresa una proporción óptima de gata cuatro, F dos C y TBX cinco. Este método proporciona una plataforma valiosa para la investigación de cardiomiocitos inducidos y facilitará estudios mecanicistas y de detección posterior de la programación de cardiomiocitos inducidos, al tiempo que avanza el campo hacia aplicaciones clínicas. La principal ventaja de esta técnica es que, utilizando una sola construcción retroviral, los fibroblastos cardio se pueden convertir de manera eficiente en cardiomiocitos.

Limpie el ratón transgénico GFP de cadena pesada alfa miosina neonatal con un 75% de volumen a volumen. Etanol realizar la eutanasia. A continuación, abra la cavidad corporal haciendo una incisión horizontal desde debajo de una axila hasta la otra con pinzas estériles, romas y dobladas.

Disecciona el corazón y colócalo en un pocillo de un plato de 24 pocillos que contiene hielo. Las PBS frías observan la expresión de GFP en todo el corazón mediante microscopía de fluorescencia. Coloque de tres a 4 g de corazones positivos FP en un plato de cultivo de pozo central de 60 milímetros con pinzas y tijeras estériles, pique los corazones en trozos pequeños de menos de un milímetro cúbico.

Transfiera los corazones picados a un plato de 10 centímetros y cubra con dos mililitros de fiberblast o medio FB. Deje las placas sin tocar durante al menos tres horas en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue lentamente ocho mililitros de medio FB precalentado al plato que contiene el tejido cardíaco picado.

A continuación, incubar el tejido sin perturbaciones, excepto para cambiar el medio cada tres días. En el séptimo día, aspire el medio de cultivo y lave las células con DPBS. Añadir tres mililitros de 0,05%trips en EDTA a cada placa e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Agregue cinco mililitros de medio FB para desactivar la tripsina y luego separe suavemente las células con un raspador de células. A continuación, recoja las células y filtre a través de filtros de células de 40 micras para evitar la contaminación con fragmentos de tejido cardíaco. Granular las células por centrifugación a 200 veces G durante cinco minutos, comenzando con corazones de ratón neonatos aislados.

Corta cada corazón en cuatro pedazos que aún estén conectados sin apretar. Transfiera los corazones a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga ocho mililitros de 0,05% de EDTA tibio e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de la incubación, deseche los viajes con EDTA y agregue cinco mililitros de vórtice de colagenasa tipo dos caliente durante un minuto a velocidad media, y luego incube el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos.

A continuación, vuelva a vórtice el tubo durante un minuto. Deje que los trozos de tejido se asienten y recojan el sobrenadante en un nuevo tubo que contenga cinco mililitros de medio FB frío. Agregue cinco mililitros de colagenasa fresca tipo dos a las piezas de tejido y repita los pasos de vórtice e incubación.

Combine todas las células que contienen sobrenadantes filtrándolas a través de un filtro de células de 40 micras. Centrifugar estas células a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Siguiendo cualquiera de los métodos de aislamiento de fibroblastos cardíacos.

Lave el pellet de celda final una vez en 10 mililitros de clasificación de celdas activadas magnéticamente o tampón máximo. Retire 10 microlitros para el recuento de células vivas y centrifuga las células restantes a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius durante menos de uno por 10 hasta la séptima celda. Vuelva a suspender el pellet celular con 10 microlitros de microperlas magnéticas conjugadas en el muslo, 1.2 en 90 microlitros de tampón máximo enfriado y mezcle.

Incubar bien las perlas a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Para granular las células, agregue 10 mililitros de tampón máximo y centrifugue las muestras a 200 veces G durante cinco minutos. Lavar una vez con 10 mililitros de tampón máximo y volver a suspender el pellet celular en un volumen total de dos mililitros en una campana de cultivo celular.

Configure un separador máximo y agregue una columna LS. Equilibre la columna con tres mililitros de tampón máximo. Pase la suspensión celular a través de la columna LS y lave tres veces con dos mililitros de tampón máximo.

A continuación, retire la columna LS del separador y eluya tres veces con dos mililitros de tampón máximo. Recogida del EIT en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el EIT a 200 veces G durante cinco minutos.

Vuelva a suspender los fibroblastos aislados en 10 mililitros de medio FB y cuente las células, siembre las células en placas de cultivo de tejidos a densidades adecuadas en una placa de gelatina precodificada de 24 pocillos para reprogramar los fibroblastos cardíacos. Agregue 500 microlitros de cardiomiocitos inducidos o medio ICM que contenga policerebro a cada pocillo de las 24 placas de pocillos asentadas con células. Agregue 10 microlitros del retrovirus a cada pocillo de fibroblastos aislados.

Incubar la placa con partículas retrovirales durante 24 a 48 horas en una incubadora de cultivo celular. Luego, reemplace el medio que contiene virus con 500 microlitros de medio ICM fresco, cambiando el medio cada dos o tres días. Comience la selección positiva de las células virales transducidas suplementando el medio ICM con dos microgramos por mililitro de purmicina.

Después de tres días de selección, cambie el medio a una dosis de mantenimiento de un microgramo por mililitro de micina para visualizar la conversión de fibroblastos cardíacos en cardiomiocitos. Observe las placas seleccionadas de purmicina para la expresión de GFP utilizando un microscopio invertido. Finalmente, 14 días después del tratamiento viral, reemplace el medio ICM por B 27.

Los loci de células latantes espontáneas medianas pueden aparecer a las tres o cuatro semanas después de la transducción viral de la expresión de marcadores cardíacos, incluyendo troponina t y alfa cardíacas. La actinina se puede detectar por inmunoquímica entre los días 10 y 14. Aquí, la expresión de troponina T cardíaca se observa en el CMS I convertido a partir de fibroblastos, que expresan la expresión de alfa actinina GFP en los ICM.

El análisis por citometría de flujo muestra aumentos similares en la expresión de troponina T cardíaca, especialmente después de la selección purmicina de los cardiomiocitos inducidos. La mitología descrita aquí permite la generación eficiente de cardiomiocitos inducidos basados en la administración retroviral de factores de transcripción NGT en un solo constructo.