Mejora de la generación de cardiomiocitos inducida uso de un constructo Polycistronic Expresando relación óptima de Gata4, MEF2C y Tbx5

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo generar de manera eficiente cardiomiocitos inducidos a partir de fibroblastos cardíacos mediante un constructo retroviral poligénico MGT que expresa una proporción óptima de GATA4, F2C y TBX5. Este método proporciona una plataforma valiosa para la investigación de cardiomiocitos inducidos y facilitará ensayos de alto rendimiento y estudios mecanicistas sobre la programación de cardiomiocitos inducidos, además de impulsar el avance del campo hacia aplicaciones clínicas. La principal ventaja de esta técnica radica en que, utilizando únicamente un solo constructo retroviral, los fibroblastos cardíacos pueden convertirse eficientemente en cardiomiocitos.

Limpie el ratón transgénico GFP para la cadena pesada de la alfa miosina neonatal con etanol al 75 % volumen a volumen. Realice la eutanasia. A continuación, abra la cavidad corporal realizando una incisión horizontal desde debajo de una axila hasta la otra utilizando fórceps estériles, romos y curvos.

Extraiga el corazón y colóquelo en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga hielo. Añada PBS frío y observe la expresión de GFP en todo el corazón mediante microscopía de fluorescencia. Coloque tres a cuatro corazones positivos para FP en un recipiente de cultivo de 60 milímetros usando pinzas y tijeras estériles, y corte los corazones en trozos pequeños de menos de un milímetro cúbico.

Transfiera los corazones picados a una placa de 10 centímetros y cúbralos con dos mililitros de medio de fibroblastos o medio FB. Deje las placas sin perturbar durante al menos tres horas en un incubador a 37 grados Celsius. Tras la incubación, agregue lentamente ocho mililitros de medio FB precalentado a la placa que contiene el tejido cardíaco picado.

Luego, incubar el tejido sin perturbarlo, excepto para cambiar el medio cada tres días. En el día siete, aspirar el medio de cultivo y lavar las células con DPBS. Añadir tres mililitros de tripsina al 0,05 % en EDTA a cada placa e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos.

Añada cinco mililitros de medio FB para desactivar la tripsina y luego desprenda suavemente las células con un raspador celular. A continuación, recoja las células y filtre a través de tamices celulares de 40 micrones para evitar la contaminación con fragmentos de tejido cardíaco. Pelote las células mediante centrifugación a 200 veces G durante cinco minutos, comenzando con corazones de ratón neonatal aislados.

Corte cada corazón en cuatro piezas que aún estén ligeramente conectadas. Transfiera los corazones a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga ocho mililitros de tripsina EDTA 0,05% caliente e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Tras la incubación, deseche la tripsina EDTA y agregue cinco mililitros de colagenasa tipo dos caliente; vortexee durante un minuto a velocidad media y luego incube el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos.

Luego, agite el tubo nuevamente mediante vórtex durante un minuto. Deje asentar los fragmentos de tejido y recoja el sobrenadante en un tubo nuevo que contenga cinco mililitros de medio FB frío. Añada cinco mililitros de colagenasa tipo II fresca a los fragmentos de tejido y repita los pasos de agitación por vórtex e incubación.

Combine todos los sobrenadantes que contienen células filtrándolos a través de un filtro celular de 40 micrones. Centrifugue estas células a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Tras cualquiera de los métodos de aislamiento de fibroblastos cardíacos.

Lave el pellet celular final una vez con 10 mililitros de tampón de clasificación magnética de células activadas o tampón máx. Retire 10 microlitros para el recuento de células viables y centrifugue las células restantes a 200 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, para menos de una vez 10 a la séptima células. Reuspenda el pellet celular con 10 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas con Tfh 1.2 en 90 microlitros de tampón máx frío y mezcle.

Incube bien las perlas a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Para pelotar las células, agregue 10 mililitros de tampón max y centrifugue las muestras a 200 veces G durante cinco minutos. Lave una vez con 10 mililitros de tampón max y resuspenda el pellet celular en un volumen total de dos mililitros en una cabina de cultivo celular.

Configure un separador máx y agregue una columna LS. Equilibre la columna con tres mililitros de tampón máx. Pase la suspensión celular a través de la columna LS y lave tres veces con dos mililitros de tampón máx.

Luego retire la columna LS del separador y eluya tres veces con dos mililitros de tampón max. Recoja el EIT en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugue el EIT a 200 veces G durante cinco minutos.

Re-suspenda los fibroblastos aislados en 10 mililitros de medio FB y cuente las células; siembre las células en placas de cultivo de tejidos a densidades adecuadas en una placa de 24 pocillos previamente recubierta con gelatina para reprogramar fibroblastos cardíacos. Añada 500 microlitros de medio de cardiomiocito inducido o medio ICM que contenga poli cerebro a cada pocillo de las placas de 24 pocillos sembradas con células. Añada 10 microlitros del retrovirus a cada pocillo que contenga fibroblastos aislados.

Incube la placa con partículas retrovirales durante 24 a 48 horas en un incubador de cultivo celular. Luego, reemplace el medio que contiene el virus con 500 microlitros de medio ICM fresco, cambiando el medio cada dos o tres días. Inicie la selección positiva de las células transducidas con el virus suplementando el medio ICM con dos microgramos por mililitro de puromicina.

Después de tres días de selección, cambie el medio a una dosis de mantenimiento de un microgramo por mililitro de puromicina para visualizar la conversión de fibroblastos cardíacos a cardiomiocitos. Observe las placas seleccionadas con puromicina en busca de expresión de GFP utilizando un microscopio invertido. Finalmente, 14 días después del tratamiento viral, reemplace el medio ICM con B 27.

Pueden aparecer focos de células con latidos espontáneos de tamaño medio entre las tres y cuatro semanas posteriores a la transducción viral, con expresión de marcadores cardíacos, incluyendo troponina T cardíaca y alfa. La alfa actinina puede detectarse mediante inmunoquímica entre los días 10 y 14. Aquí se observa la expresión de troponina T cardíaca en las CIM convertidas a partir de fibroblastos, que expresan GFP. La expresión de alfa actinina en las CIM se puede ver aquí.

El análisis mediante citometría de flujo muestra aumentos similares en la expresión de troponina T cardíaca, especialmente tras la selección con puromicina de los cardiomiocitos inducidos. La metodología descrita aquí permite la generación eficiente de cardiomiocitos inducidos basada en la entrega retroviral de factores de transcripción NGT mediante un solo constructo.