Name: Mejora de la generación de cardiomiocitos inducida uso de un constructo Polycistronic Expresando relación óptima de Gata4, MEF2C y Tbx5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a generar cardiomiocitos inducidos de fibroblastos cardíacos mediante un constructo policistrónico con Gata4, MEF2C y Tbx5. Este método mejora la eficiencia y homogeneidad celular para estudios de regeneración cardíaca.

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Estamos agradecidos por la asistencia técnica experta del Núcleo de Citometría de Flujo de la UNC y el Núcleo de Microscopía de la UNC. Agradecemos a los miembros del laboratorio Qian y del laboratorio Liu por sus útiles discusiones y revisiones críticas del manuscrito. Este estudio contó con el apoyo de la subvención R00 R0 HL109079 0 de los NIH/NHLBI al Dr. Liu y la Subvención para el Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón (AHA) 13SDG17060010 y la Subvención para Nuevos Becarios de la Fundación Médica Ellison (EMF) AG-NS-1064-13 al Dr. Qian.

El protocolo descrito aquí utiliza ratones recién nacidos. Cuidado de los animales y los experimentos se realizan de acuerdo con los lineamientos establecidos por la División de Laboratorio de Medicina Animal (DLAM) en la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill. 1. Preparación de tampones y Medios de Comunicación <ol><li> Preparar fibroblastos (FB) medio: Suplemento de 500 ml de medio IMDM con 100 ml de suero fetal bovino (FBS) y 6 ml de penicilina / estreptomicina. </li><li> Prepare medio iCM: Suplemento de 400 ml de medio DMEM con 100 ml de medio M199 y 50 ml de FBS. </li><li> Preparar medio B27: Suplemento 490 ml RPMI 1640 los medios de comunicación con 10 ml B27 medios. </li><li> Preparar medio de cultivo Plat-E: Suplemento 500 ml DMEM medios con 50 ml de FBS, 5 ml de penicilina / estreptomicina y 5 ml aminoácidos no esenciales. </li><li> Preparar medio de transfección Plat-E: Suplemento 500 ml de DMEM los medios de comunicación con 50 ml de FBS y 5 ml de aminoácidos no esenciales. </li><li> Prepare gelatina revestido placa de 24 pocillos: Añadir solución de gelatina 0,5 ml 0,1% a un pocillo de placa de 24 pocillos, se incuba a 37 ° C durante al menos 10 minutos y aspirado de la derecha antes de su uso. </li><li> Preparar tampón FACS etiquetado: Suplemento 500 ml de DPBS con 10 ml de FBS y 2 ml de EDTA (0,5 M) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Pasar a través de un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C. </li><li> Preparar tampón MACS de clasificación: Suplemento 500 ml de DPBS con 2,5 g de BSA y 2 ml de EDTA (0,5 M) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Pasar a través de un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C. </li><li> Preparar tampón HBS 2x para la transfección: Suplemento 500 ml de tampón HEPES (50 mM) con NaCl 280 mM (8,1816 g), mM KCl 10 (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM de glucosa (1,08096 g ). Añadir alrededor de 650 l 10 N NaOH para ajustar el pH a 7.5 a 7.12. Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras de poro y se almacena a 4 ° C. </li><li> Preparar M CaCl solución 2,5 2 para la transfección: Agregar 18,376 g de CaCl 2 a 50 ml ddH2O Filtrar a través de un filtro de 0,22 micras de poro y se almacena a 4 ° C. </li><li> Preparar ICC (inmunocitoquímica) Tampón de fijación: Añadir 5 ml de paraformaldehído (PFA, 32%) a 35 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 4%. </li><li> Preparar tampón de permeabilización ICC: Añadir 0,1 ml de Triton 100 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 0,1%. </li><li> Preparar tampón de bloqueo ICC: Añadir 5 g de albúmina de suero bovino (BSA) a 100 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 5%. </li><li> Preparar tampón de tinción ICC: Añadir 1 g de BSA a 100 ml de DPBS para llegar a una concentración final de 1%. </li></ol> 2. Generación de neonatales mouse cardíacos fibroblastos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Generar fibroblastos cardíacos de método de cultivo de explante <ol><li> Clean neonatal αMHC-GFP ratón transgénico (P1 a P2) con etanol 75%. Corta la cabeza con unas tijeras estériles. A continuación, hacer una incisión horizontal desde debajo de una axila a la otra. Use un estérilfórceps romos y se inclinó para diseccionar el corazón y la colocan en un pocillo de la placa de 24 pocillos que contiene tampón PBS helado. <ol><li> Alternativamente, exprimir el corazón después de la incisión horizontal. </li></ol></li><li> Compruebe la expresión de GFP en el corazón por el microscopio de fluorescencia. Dado que la expresión de GFP es impulsado por el promotor αMHC que es un promotor específico cardíaco, el corazón de ratón transgénico debe estar en verde 15, mientras que el corazón negativo es tenue en cualquiera de fluorescencia. </li><li> Tome 3-4 GFP corazones positivos en un pozo central placa de cultivo de 60 mm y picar en trozos pequeños de menos de 1 mm 3 en el tamaño de tijeras y pinzas estériles. </li><li> Coloca 3-4 corazones picados en una sola placa de 10 cm con 2 ml de medio de FB. Deje que los tejidos se establecen durante 3 horas. </li><li> Agregue lentamente 8 ml precalentado medios FB a los platos que contienen los tejidos del corazón. No moleste a los tejidos durante tres días. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación cada tres días. </li><li> El día 7, aspircomió el medio de cultivo y lavar las células con DPBS. Añadir 3 ml 0,05% de tripsina a cada placa y digerir a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Añadir 5 ml de medio de FB para saciar la tripsina. Separar suavemente las células con un raspador de células. Pipetear los medios de comunicación de arriba a abajo para disociar más mecánicamente el tejido. </li><li> Recoger las células y filtrar a través de 40 micras coladores celulares para evitar la contaminación de fragmentos de tejido del corazón, y luego sedimentar las células mediante centrifugación a 200 xg durante 5 min. </li><li> Lavar las células una vez con tampón MACS y las células están listas para la clasificación. </li></ol></li><li> Generar fibroblastos cardíacos de método de digestión enzimática <ol><li> Cosecha GFP corazones positivos como 2.1.1. Transferir todos los corazones en un plato de 10 cm con 10 ml de DPBS enfriado con hielo. </li><li> Apriete ventrículos con pinzas estériles para quitar la sangre y enjuagar una vez con DPBS enfriado con hielo. </li><li> Recorte los corazones de estar libre de otros tejidos y grasa. </li><li> Corte cada corazón en aproximadamente 4 piezas que todavía están conectados vagamente. </li><li> Si menos de 20 corazones, transfiera los corazones en un tubo cónico de 15 ml con 8 ml cálida 0,05% de tripsina-EDTA, y se incuba a 37 ° C durante 15 min. <ol><li> Si hay 20-30 corazones, transferir los corazones en un tubo cónico de 50 ml con 10 ml cálida 0,05% de tripsina-EDTA, y se incuba a 37 ° C durante 15 min. </li></ol></li><li> Deseche la tripsina y añadir 5 ml (por menos de 20 corazones) o 10 ml (para 20-30 corazones) cálida colagenasa tipo II (0,5 mg / ml) en HBSS. </li><li> Vortex el tubo de vórtice durante 1 minuto a un nivel de velocidad alrededor de 4 a 6 (si el líquido no se levante a la tapa, entonces la velocidad está muy bien). </li><li> Incubar el tubo en 37 ° C baño de agua durante 3-5 minutos. </li><li> Vortex el tubo durante 1 min. </li><li> Sedimentos durante 1 minuto por gravedad hasta que los trozos de tejido se calmen, recoger el líquido en un nuevo tubo que contiene 5 ml de medio FB frío. </li><li> Repita los pasos 2.2.6-2.2.10 3-5 veces. </li><li> Combinar todas las colecciones mediante la filtración a través de filtro de células de 40 micrashacer suspensión de células individuales. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de tampón MACS, y centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Opcional: Si hay una gran cantidad de células sanguíneas, Resuspender las células con 1 ml de RBC tampón de lisis (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, y EDTA 0,1 mM), mantener en hielo durante 1 min, luego se diluye con 10 ml MACS tampón y se centrifuga a 200 xg durante 5 min. Lavar una vez más con tampón MACS. </li></ol></li><li> Aislamiento de Thy1.2 + fibroblastos por MACS (magnético clasificación de células activadas) <ol><li> Determinar el número de células viables mediante tinción con azul de tripano. <ol><li> Tomar 10 células mu l a partir de la suspensión de células de 10 ml en el paso 2.2.14. Mezclar con solución de azul de 10 l 0,4% de tripano. </li><li> Añadir la mezcla a un hemocitómetro. Deje reposar durante 3-5 minutos y luego examinar de inmediato con un microscopio. Las células muertas se tiñen en las células azules y viables son sin mancha. </li><li&gt; contar todas las células viables en cuatro cuadrados de 1 mm de esquina del hemocitómetro. Determinar el número de células viables: el recuento medio por metro cuadrado x 2 (factor de dilución) x 10 4 x 10 (volumen total de la suspensión celular). </li></ol></li><li> Por menos de 1 x 10 7 células, las células volver a suspender las microesferas con 10 l Thy1.2 en 90 l enfriaron tampón MACS. Añadir más cuentas proporcionalmente si hay más de 1 x 10 7 células. Mezclar bien e incubar en nevera (2-8 ° C) durante 30 minutos. </li><li> Añadir 10 ml de tampón MACS y muestras giran a 200 xg durante 5 min; lavar una vez con tampón MACS 10 ml y centrifugar de nuevo. </li><li> Traiga volumen de 2 ml en tampón MACS. </li><li> Establecer un separador de MACS en el capó. Inserte una columna LS al separador. Aplicar 3 ml MACS buffer para la columna que se equilibren. </li><li> Pasar la suspensión celular a través de la columna LS equilibrada. </li><li> Lavar 3 veces con 2 ml de tampón MACS cada vez. </li><li> Tome la columna de la LS fuera tque Separador y eluir 3 veces con 2 ml MACS amortiguan en un nuevo tubo de 50 ml. </li><li> Girar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de medio FB, cuentan las células y se siembran en placas a una densidad adecuada. Para fibroblastos generados por el método de cultivo de explante, la densidad de células de siembra podría ser alrededor de 2.3 x 10 4 células / pocillo de placa de 24 pocillos. Para fibroblastos generados por método de digestión enzimática, la densidad de las células podría ser alrededor de 5.4 x 10 4 células / pocillo de placa de 24 pocillos. </li></ol></li></ol> 3. Generación de retrovirus para iCM Reprogramación Nota: Realice los siguientes pasos en un Gabinete de Seguridad Biológica BSL2 en condiciones estériles. Se recomienda la eliminación adecuada de las células transfectadas, puntas de pipeta y tubos para evitar el riesgo de los riesgos ambientales y de salud. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mantener células Plat-E en Plat-E medio suplementado con 1 mg / ml de puromicina y 10 mg / ml blasticidin a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> El día 2, sustituir el medio por el medio de cultivo Plat-E carente puromicina y blasticidina. </li><li> En el día 0, dividir celdas Plat-E en placas de 10 cm el día antes de la transfección en aproximadamente 4-5 x 10 6 células por placa. Las células deben ser ~ 80-90% de confluencia en el día de la transfección. </li><li> El día 1, los medios de comunicación el cambio de cultura a los medios de transfección de las células dentro de 1 hora antes de la transfección. Procedimiento de transfección es la siguiente: <ol><li> La transfección utilizando kits comerciales <ol><li> Mezclar 20 l de reactivo de transfección (Lipofectamine por ejemplo) y 500 l de suero reducido medios de comunicación (por ejemplo, Opti-MEM). Añadir 10 g del plásmido retroviral a otros 500 l reducidos medio de suero. Incubar cada mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. </li><li> Poco a poco agregue la mezcla de plásmido a la mezcla de transfección. Este paso puede tardar 15-30 seg. Incubar la mezcla durante 20 min a RT (solución puede aparecer turbia). </li&gt; <li> Añadir gota sabia mezcla de las células. </li><li> Incubar toda la noche en una incubadora a 37 °. </li></ol></li><li> La transfección utilizando fosfato de calcio. <ol><li> Mezclar 40 l 2,5 M CaCl2 y 440 l ddH2O, a continuación, añadir 20 g de plásmido retroviral (ajustar la cantidad de ddH2O de manera que el volumen total es de 500 l). </li><li> Añadir 500 l 2x HBS a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Vortex la HBS y añada su parte la mezcla de ADN de calcio a la HBS gota a gota. Este paso lleva alrededor de 30 segundos para cada muestra. Así máximamente hacer 3-4 muestras simultáneamente. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 3 min de incubación durante más tiempo lleva al precipitado más grande y menos células asumirá el precipitado. </li><li> Añadir la mezcla gota a gota a las células y observar bajo el microscopio 20X. Precipitados finos (un montón de pequeñas son buenas pero algunas grandes no son buenos) deben ser vistos. </li><li> Incubar durante la noche a 37 ° C incubadora. </li&gt; </ol></li></ol></li><li> El día 2, cambiar el medio sobre las células con 8 ml precalentada medios de cultivo. Incubar durante 24 horas. </li><li> El día 3 y el día 4, recoger el sobrenadante del cultivo de las placas mediante el uso de una jeringa desechable de 10 ml estéril, filtrándola a través de un filtro de acetato de celulosa de tamaño de poro 0,45 micras, y transferir a un tubo de 50 ml. Añadir 2 ml de solución de precipitación retrovirus a cada sobrenadante que contiene virus-8 ml. Suavemente mezclar e incubar durante la noche a 4 ° C. </li><li> El día 5, girar la mezcla viral a 1500 × g a 4 ° C durante 30 min. Las partículas virales deben aparecer en pellet blanco en la parte inferior del tubo. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Centrifugar la solución residual por centrifugación a 1500 xg durante 5 min. Quite todos los rastros de líquido por aspiración, teniendo mucho cuidado de no molestar a las partículas retrovirales precipitados en tabletas. </li><li> Resuspender gránulos retrovirales con tampón DPBS 100 l por cada 8 ml de sobrenadante viral. Alícuotael virus en hielo. Utilice inmediatamente o almacenar a -80 ° C. </li></ol> 4. La reprogramación de fibroblastos cardíacos <ol><li> Añadir 4 l de solución de polibreno 10 mg / ml en el medio de iCM 10 ml, y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo. La concentración final de polibreno es 4 mg / ml. </li><li> Añadir 500 l medios iCM que contiene polibreno a cada pocillo de placa de 24 pocillos sembrada con fibroblastos. </li><li> Añadir 10 l retrovirus a cada pocillo que contienen ya sea 2-3 x 10 4 células de cultivo de explantes o 4-5 x 10 4 células de método de digestión enzimática. La cantidad de virus se debe aumentar proporcionalmente con el aumento de número de células en diferentes placas o placas de cultivo. Poner la placa en una incubadora a 37ºC durante 24 a 48 horas para permitir que la infección viral. La línea de tiempo para la reprogramación cardiaca se muestra en la Figura 1. </li><li> Después de la transducción viral, reemplace virus medios que contienen con 500 l de medios regulares iCM. </li><li> Cambie los medios de comunicación cada 2-3 días. Para la selección positiva de células transducidas virales, añadir medios ICM suplementados con puromicina a 2 mg / ml a las células diana. Manténgalo durante tres días. Después de eso, mantener la puromicina en el medio iCM a la concentración de 1 mg / ml. </li><li> Tres días después de la infección viral, tomar la placa hacia fuera de la incubadora y colocarlo bajo un microscopio de fluorescencia invertida (20X) para observar la expresión de GFP. Nota: Diez días después de la infección viral, las células pueden ser cosechadas para el análisis FACS y análisis de la CPI para determinar la eficiencia de reprogramación (en el paso 5 y 6). </li><li> Catorce días después de la infección viral, reemplace medios iCM con medios B27. Cambie los medios de comunicación cada tres días. Espontánea loci celular latido puede aparecer a partir de tres (células de método de digestión enzimática) o cuatro (células de método de cultivo de explante) semanas después de la transducción viral. </li></ol> 5. Inmunocitoquímico Análisis de Eficiencia Reprogramación <ol><li> Enjuague las célulascon el hielo frío PBS tres veces; eliminar el exceso de solución. </li><li> Añadir tampón de fijación 0,5 ml de la CPI a cada pocillo de placas de 24 pocillos. Fijar las células a temperatura ambiente durante 15-20 min. </li><li> Enjuagar las células con PBS tres veces. </li><li> Añadir 0,5 ml de tampón de permeabilización ICC a cada pocillo de las placas de 24 pocillos. Permeabilizar las células a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Enjuagar las células con PBS tres veces. </li><li> Añadir 0,5 ml de la CPI tampón de bloqueo a cada pocillo de placa de 24 pocillos, se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Anticuerpos primarios diluidos con tampón de tinción ICC. Añadir 200 l soluciones de anticuerpo a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 ° C. Los factores de dilución de anticuerpo se enumeran en Materiales. </li><li> En el día siguiente, lavar las células con PBS tres veces. </li><li> Añadir 200 soluciones de anticuerpos secundarios mu l a las células y se incuba durante 1 hora a TA en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con PBS tres veces. </li><li> Añadir 150 l solución que contiene DAPI a cada pocillo de montaje. Permitir a manchar núcleos durante 1 min. entoncescubrir cada pocillo con hoja de la cubierta de cristal redondo y presione suavemente el deslizamiento contra la superficie inferior con unas pinzas para quitar las burbujas de aire. </li><li> Aspirar el exceso de solución y las muestras están listas para la imagen. Las imágenes representativas que muestran las células reprogramadas que expresan marcadores cardíacos cTnT y αActinin en d14 se muestran en la Figura 2B. </li></ol> 6. FACS análisis de la eficiencia de reprogramación <ol><li> Lave las células una vez con DPBS. Añadir 0,3 ml de tripsina (0,05%) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Golpee suavemente la placa para facilitar el levantamiento de las células. Compruebe el desprendimiento de células bajo el microscopio. Añadir 1 ml de tampón FACS a cada pocillo cuando se disocian mayoría de las células. Pipetear hacia arriba y abajo para disociar más mecánicamente las células. </li><li> Transferir las células de la placa de 24 pocillos de una placa de 96 pozos profundos bien a bien. Centrifugado a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para recoger las células. </li><li> Lavar las células una vez conTampón FACS. </li><li> Añadir 100 soluciones de fijación / permeabilización mu l para resuspender las células durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células dos veces con solución de lavado 1x, pellets, y retirar el sobrenadante. </li><li> Prepare la solución de anticuerpo primario contra la GFP y cTnT en tampón de lavado 1x. Resuspender a fondo cada muestra con una solución de anticuerpo 50 l y se incuba a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Lave las células una vez en solución de lavado 1x, pellets, y retirar el sobrenadante. </li><li> Añadir 50 solución de anticuerpo secundario que contiene l Alexa Fluor 488 burro conjugado IgG anti-conejo y Alexa Fluor 647 burro conjugado anti-IgG de ratón a cada muestra. Se incuba a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad. </li><li> Lave las células una vez en solución de lavado 1x, pellets, y retirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 400 l de tampón de fijación (DPBS con 1% PFA). La transferencia de células en el tubo de FACS con el casquillo de filtro de células. Las muestras están listas para la detección FACS. El análisis FACS representante de una eficiencia de reprogramacióny usando pMxs-puromicina-MGT construir con o sin selección puromicina se muestra en la Figura 2A. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para exitosa generación iCM al utilizar este protocolo, hay varios factores importantes que tienen un impacto en la eficiencia global. Particularmente las condiciones de fibroblastos de partida y la calidad de codificación retrovirus MGT pueden afectar en gran medida la eficiencia de la reprogramación. Es importante generar fibroblastos tan fresco y saludable posible. Para el método de cultivo de explantes, los fibroblastos se pueden utilizar antes de siete días después de los explantes se s...

Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de muerte en todo el mundo, con 17,3 millones de muertes al año1. La pérdida de cardiomiocitos como consecuencia de un infarto de miocardio (IM) o de una insuficiencia cardíaca progresiva es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad2. Debido a la limitada capacidad regenerativa, los corazones de los mamíferos adultos suelen sufrir un deterioro de la función de la bomba e insuficiencia cardíaca después de una lesión3-6. Como tal, la (re)generación eficiente de cardiomiocitos in vivo e in vitro para el tratamiento de enfermedades cardíacas y para el modelado de enfermedades es un tema crítico que debe abordarse.
El reciente desarrollo de la reprogramación directa, que reprograma directamente las células de un fenotipo diferenciado a otro sin pasar por el estado pluripotente, ofrece un enfoque alternativo prometedor para la medicina regenerativa. El corazón de los mamíferos contiene abundantes fibroblastos cardíacos (FQ), que representan aproximadamente la mitad de las células del corazón y proliferan masivamente tras una lesión7-9. Por lo tanto, el vasto conjunto de FQ podría servir como una fuente endógena de nuevas MC para la terapia regenerativa si pudieran reprogramarse directamente en MC funcionales. Se ha demostrado que una combinación de factores de transcripción, como Gata4 (G), Mef2c (M) y Tbx5 (T), con o sin microRNAs o moléculas pequeñas puede reprogramar fibroblastos en iCMs10-26. Es importante destacar que esta conversión también puede ser inducida in vivo, y resulta en una mejora de la función cardíaca y una reducción del tamaño de la cicatriz en un corazón infartado16,27-29. Estos estudios indican que la reprogramación cardíaca directa puede ser una vía potencial para curar un corazón lesionado. Sin embargo, la baja eficiencia de la reprogramación de iCM se ha convertido en un obstáculo importante para futuros estudios mecanicistas. Además, la reproducibilidad de la reprogramación cardíaca es otro tema controvertido de esta tecnología11,30,31. 
Muy recientemente, generamos un conjunto completo de construcciones policistrónicas que codifican G,M,T en todos los órdenes de empalme posibles con secuencias 2A idénticas en un solo ARNm. Estas construcciones policistrónicas produjeron niveles variados de expresión de proteínas G, M y T, lo que condujo a una eficiencia de reprogramación significativamente diferente25. El constructo más eficiente, denominado MGT, que mostró una Mef2c relativamente alta y una baja expresión de Gata4 y Tbx5, mejoró significativamente la eficiencia de la reprogramación y produjo grandes cantidades de iCMs con expresión de marcadores de CM, oscilación robusta de calcio y latidos espontáneos25. Además, mediante el uso de la construcción policistrónica MGT, nuestro estudio evitó el uso de múltiples vectores y generó células con una relación de expresión homogénea de G,M,T, proporcionando así una plataforma mejorada para la investigación de la reprogramación cardíaca. Para aumentar la reproducibilidad experimental, aquí describimos en detalle cómo aislar fibroblastos, producir retrovirus portadores de casete MGT, generar iCMs y evaluar la eficiencia de la reprogramación.

<table><tbody><tr><td>troponina T cardíaca Thermo</td><td>Scientific</td><td>MS-295-PO</td><td>1:200 para FACS y 1:400 para ICC</td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A11122</td><td>1:500 para FACS e ICC</td></tr><tr><td>anti-aActinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td>1:500 para FACS e ICC</td></tr><tr><td>anti-Connexin43</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6219</td><td>1:500 para&nbsp; ICC</td></tr><tr><td>anit-Mef2c</td><td>Abcam</td><td>ab64644</td><td>1:1,000 para ICC&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-Gata4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1237</td><td>1:200 para ICC</td></tr><tr><td>anti-Tbx5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17866</td><td>1:200 para ICC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash; burro conjugado anti-conejo IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-545-152</td><td>1:500 para FACS e ICC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&ndash; burro conjugado anti-ratón IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>715-605-150</td><td>1:500 para FACS e ICC</td></tr><tr><td>Kit Cytofix/Cytoperm para tinción intracelular</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-3 Kit de imágenes de calcio</td><td>Life Technologies</td><td>R10145</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas Thy1.2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-101</td><td></td></tr><tr><td>Solución Vectashield con DAPI</td><td>Laboratorios vectoriales</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.05%)</td><td>Corning</td><td>25-052</td><td></td></tr><tr><td>medio PRMI1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Suero reducido Medio Life</td><td>Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>M199 medio</td><td>Life Technologies</td><td>10-060</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta</td><td>Life Technologies</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Life Technologies</td><td>11130-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668500</td><td></td></tr><tr><td>blasticidina</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td></td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>polibreno</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Fisher</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Solución de precipitación de retrovirus</td><td>ALSTEM</td><td>VC-200</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Solución de azul de tripán</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco sin CaCl2 y MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Solución salina equilibrada de Hanks)</td><td>Corning</td><td>21022</td><td></td></tr><tr><td>LS columna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtro de acetato de celulosa&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placas de cultivo de tejidos&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>172958</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo de pozo central de 60 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear V-Bottom 2 ml Placa de pocillo profundo de polipropileno</td><td>Denville Scientific</td><td>P9639</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fondo redondo de poliestireno con tapa de filtro de celdas&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer MINI</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Sistema de imagen de células automáticas</td><td>Life Technologies AMAFD1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separador MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio redondos</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>72195-15</td><td></td></tr></tbody></table>

mejora de la generación de cardiomiocitos inducida uso de un constructo polycistronic expresando relación óptima de gata4, mef2c y tbx5

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

La conversión directa de los fibroblastos cardíacos (CFS) en cardiomiocitos inducidos (ICMS) tiene un gran potencial para la medicina regenerativa al ofrecer estrategias alternativas para el tratamiento de enfermedades del corazón. Esta conversión se ha logrado mediante la expresión forzada de los factores definidos, tales como Gata4 (G), MEF2C (M) y Tbx5 (T). Tradicionalmente, los ICMs son generados por un cóctel de virus que expresan estos factores individuales. Sin embargo, la reprogramación de la eficiencia es relativamente baja y la mayor parte de la in vitro G, M, T-transduced fibroblastos no se vuelven totalmente reprogramados, lo que dificulta el estudio de los mecanismos de reprogramación. Recientemente hemos demostrado que la estequiometría de G, M, T es crucial para una eficiente reprogramación iCM. Una estequiometría óptima de G, M, T con un alto nivel relativo de M y bajos niveles de G y T obtenidos mediante el uso de nuestro vector policistrónico MGT (en lo sucesivo referido como MGT) aumentó significativamente la eficiencia de reprogramación y mejora de la calidad iCM in vitro. Aquí le ofrecemos una descripción detallada de la metodología utilizada para generar ICMS con constructo MGT de fibroblastos cardíacos. El aislamiento de los fibroblastos cardíacos, generación de virus para la reprogramación y la evaluación del proceso de reprogramación también se incluyen para proporcionar una plataforma para la generación eficiente y reproducible de ICMS.

Los pasos de reprogramación se resumen por esquema de la Figura 1. Después de la transducción de MGT, la expresión de GFP en la reprogramación de células podrían ser detectados tan pronto como día 3. puromicina selección de células transducidas comienza a partir de 3 días y se mantiene durante las dos primeras semanas si PMX-puro se utiliza constructo -MGT. Por día 10 a día 14, la expresión de los marcadores cardíacos como cTnT y αActinin podría ser detectada tanto por ICC (Figu...

Describimos aquí un protocolo para la generación de iCMs utilizando la entrega mediada por retrovirus de Gata4, Tbx5 y Mef2c en una construcción policistrónica. Este protocolo produce una población relativamente homogénea de células reprogramadas con mayor eficiencia y calidad, y es valioso para futuros estudios de reprogramación de iCM.

Mejora de la generación de cardiomiocitos inducida uso de un constructo Polycistronic Expresando relación óptima de Gata4, MEF2C y Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo generar de manera eficiente cardiomiocitos inducidos a partir de fibroblastos cardíacos mediante un constructo retroviral poligénico MGT que expresa una proporción óptima de GATA4, F2C y TBX5. Este método proporciona una plataforma valiosa para la investigación de cardiomiocitos inducidos y facilitará ensayos de alto rendimiento y estudios mecanicistas sobre la programación de cardiomiocitos inducidos, además de impulsar el avance del campo hacia aplicaciones clínicas. La principal ventaja de esta técnica radica en que, utilizando únicamente un solo constructo retroviral, los fibroblastos cardíacos pueden convertirse eficientemente en cardiomiocitos.Limpie el ratón transgénico GFP para la cadena pesada de la alfa miosina neonatal con etanol al 75 % volumen a volumen. Realice la eutanasia. A continuación, abra la cavidad corporal realizando una incisión horizontal desde debajo de una axila hasta la otra utilizando fórceps estériles, romos y curvos.Extraiga el corazón y colóquelo en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga hielo. Añada PBS frío y observe la expresión de GFP en todo el corazón mediante microscopía de fluorescencia. Coloque tres a cuatro corazones positivos para FP en un recipiente de cultivo de 60 milímetros usando pinzas y tijeras estériles, y corte los corazones en trozos pequeños de menos de un milímetro cúbico.Transfiera los corazones picados a una placa de 10 centímetros y cúbralos con dos mililitros de medio de fibroblastos o medio FB. Deje las placas sin perturbar durante al menos tres horas en un incubador a 37 grados Celsius. Tras la incubación, agregue lentamente ocho mililitros de medio FB precalentado a la placa que contiene el tejido cardíaco picado.Luego, incubar el tejido sin perturbarlo, excepto para cambiar el medio cada tres días. En el día siete, aspirar el medio de cultivo y lavar las células con DPBS. Añadir tres mililitros de tripsina al 0,05 % en EDTA a cada placa e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos.Añada cinco mililitros de medio FB para desactivar la tripsina y luego desprenda suavemente las células con un raspador celular. A continuación, recoja las células y filtre a través de tamices celulares de 40 micrones para evitar la contaminación con fragmentos de tejido cardíaco. Pelote las células mediante centrifugación a 200 veces G durante cinco minutos, comenzando con corazones de ratón neonatal aislados.Corte cada corazón en cuatro piezas que aún estén ligeramente conectadas. Transfiera los corazones a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga ocho mililitros de tripsina EDTA 0,05% caliente e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Tras la incubación, deseche la tripsina EDTA y agregue cinco mililitros de colagenasa tipo dos caliente; vortexee durante un minuto a velocidad media y luego incube el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos.Luego, agite el tubo nuevamente mediante vórtex durante un minuto. Deje asentar los fragmentos de tejido y recoja el sobrenadante en un tubo nuevo que contenga cinco mililitros de medio FB frío. Añada cinco mililitros de colagenasa tipo II fresca a los fragmentos de tejido y repita los pasos de agitación por vórtex e incubación.Combine todos los sobrenadantes que contienen células filtrándolos a través de un filtro celular de 40 micrones. Centrifugue estas células a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Tras cualquiera de los métodos de aislamiento de fibroblastos cardíacos.Lave el pellet celular final una vez con 10 mililitros de tampón de clasificación magnética de células activadas o tampón máx. Retire 10 microlitros para el recuento de células viables y centrifugue las células restantes a 200 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, para menos de una vez 10 a la séptima células. Reuspenda el pellet celular con 10 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas con Tfh 1.2 en 90 microlitros de tampón máx frío y mezcle.Incube bien las perlas a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Para pelotar las células, agregue 10 mililitros de tampón max y centrifugue las muestras a 200 veces G durante cinco minutos. Lave una vez con 10 mililitros de tampón max y resuspenda el pellet celular en un volumen total de dos mililitros en una cabina de cultivo celular.Configure un separador máx y agregue una columna LS. Equilibre la columna con tres mililitros de tampón máx. Pase la suspensión celular a través de la columna LS y lave tres veces con dos mililitros de tampón máx.Luego retire la columna LS del separador y eluya tres veces con dos mililitros de tampón max. Recoja el EIT en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugue el EIT a 200 veces G durante cinco minutos.Re-suspenda los fibroblastos aislados en 10 mililitros de medio FB y cuente las células; siembre las células en placas de cultivo de tejidos a densidades adecuadas en una placa de 24 pocillos previamente recubierta con gelatina para reprogramar fibroblastos cardíacos. Añada 500 microlitros de medio de cardiomiocito inducido o medio ICM que contenga poli cerebro a cada pocillo de las placas de 24 pocillos sembradas con células. Añada 10 microlitros del retrovirus a cada pocillo que contenga fibroblastos aislados.Incube la placa con partículas retrovirales durante 24 a 48 horas en un incubador de cultivo celular. Luego, reemplace el medio que contiene el virus con 500 microlitros de medio ICM fresco, cambiando el medio cada dos o tres días. Inicie la selección positiva de las células transducidas con el virus suplementando el medio ICM con dos microgramos por mililitro de puromicina.Después de tres días de selección, cambie el medio a una dosis de mantenimiento de un microgramo por mililitro de puromicina para visualizar la conversión de fibroblastos cardíacos a cardiomiocitos. Observe las placas seleccionadas con puromicina en busca de expresión de GFP utilizando un microscopio invertido. Finalmente, 14 días después del tratamiento viral, reemplace el medio ICM con B 27.Pueden aparecer focos de células con latidos espontáneos de tamaño medio entre las tres y cuatro semanas posteriores a la transducción viral, con expresión de marcadores cardíacos, incluyendo troponina T cardíaca y alfa. La alfa actinina puede detectarse mediante inmunoquímica entre los días 10 y 14. Aquí se observa la expresión de troponina T cardíaca en las CIM convertidas a partir de fibroblastos, que expresan GFP. La expresión de alfa actinina en las CIM se puede ver aquí.El análisis mediante citometría de flujo muestra aumentos similares en la expresión de troponina T cardíaca, especialmente tras la selección con puromicina de los cardiomiocitos inducidos. La metodología descrita aquí permite la generación eficiente de cardiomiocitos inducidos basada en la entrega retroviral de factores de transcripción NGT mediante un solo constructo.

improved-generation-induced-cardiomyocytes-using-polycistronic

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

Este protocolo describe cómo producir seno tejido ganglionar funcional a partir de células madre pluripotentes murinos (PSC). T-Caja3 (TBX3) sobreexpresión plus-cadena-miosina pesada cardiaca (MYH6) selección antibiótico promotor conduce a agregados de células marcapasos de alta pureza. Estos "inducida sinoauricular-cuerpos" ("iSABs") contienen más de 80 células marcapasos%, muestran altamente aumento de las tasas de latir y se puede regular el ritmo miocardio ex vivo.

Generación de murino cardíaca marcapasos celulares Agregados Basado en ES-Cell-Programación en combinación con MYH6-promotor-Selección

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la generación y cuantificación de diversos subtipos cardíacos reprogramados utilizando una administración mediada por retrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c y Tbx5.

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.

Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida

Aquí describimos un método escalable, con una simple combinación de activina A y mediada por el lentivirus Id1-sobreexpresión, para generar progenitores cardiacos primera de corazón como campo y ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes.

Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes

Aquí presentamos un protocolo para la formación de una población celular mediante estímulos eléctricos y mecánicos, emulando la fisiología cardiaca. Esta estimulación electromecánica realza el potencial cardiomiogenético de las células tratadas y es una estrategia prometedora para la terapia celular más, modelado de la enfermedad y drogas.

Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético

El propósito de este método es generar células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco in vitro con el fin de estudiar la especificación de la célula progenitora y las propiedades funcionales, y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades del corazón.

In Vitro Generación de Células Progenitoras Cardíacas específicas de Mouse Field

Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de...

Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

Este protocolo presenta un marco metodológico detallado para la transgénesis de células cardíacas basada en electroporación en corazones de ratón en desarrollo. Los recursos de video que se proporcionan aquí facilitarán el aprendizaje de esta técnica versátil.

Un enfoque eficiente de transgénesis para la entrega de genes en el corazón embrionario de ratón

Aprende a generar cardiomiocitos inducidos de fibroblastos cardíacos mediante un constructo policistrónico con Gata4, MEF2C y Tbx5. Este método mejora la eficiencia y homogeneidad celular para estudios de regeneración cardíaca.

Mejora de la generación de cardiomiocitos inducida uso de un constructo Polycistronic Expresando relación óptima de Gata4, MEF2C y Tbx5 (Video) | JoVE Journal

Mejora de la generación de cardiomiocitos inducida uso de un constructo Polycistronic Expresando relación óptima de Gata4, MEF2C y Tbx5

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