Análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de ADN

El objetivo general de este procedimiento es describir cómo analizar con precisión el contenido de endotoxinas y ADN de partículas suspendidas en el aire extraídas y muestreadas en filtros. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación de aerosoles biológicos en interiores y al aire libre, como comprender las razones de salud. Quien demostrará el procedimiento de muestreo con filtros será Yinon Mazar, un estudiante de posgrado de mi laboratorio.

Para muestreos de alto volumen, utilice filtros hechos de fibra de cuarzo. O elija el tipo específico de filtro, así como el tamaño de corte del filtro, que mejor se adapte a las necesidades de la investigación. Precaliente los filtros destinados al muestreo de compuestos orgánicos y biológicos envolviéndolos primero individualmente en papel de aluminio.

Y luego hornearlos en un horno de laboratorio a 450 grados Celsius durante al menos cinco horas. Esto destruirá cualquier residuo orgánico preexistente. Almacene los filtros horneados a 20 grados Celsius hasta que se utilicen para el muestreo.

A continuación, limpie y desinfecte el muestreador de alto volumen, como el descrito en el protocolo de texto adjunto. Luego, coloque el filtro precalcinado en la cápsula del filtro y haga funcionar el muestreador de acuerdo con las instrucciones del fabricante para recolectar una muestra adecuada. En una cabina de seguridad biológica de clase dos, corte 22 piezas circulares de material de filtro limpio y precalcinado utilizando un sacabocados limpio de 1,12 centímetros de diámetro.

Utilice estos fragmentos para preparar una serie de filtros con endotoxinas agregadas que se utilizarán como controles. A continuación, corte los filtros que contienen la muestra recolectada usando un sacabocados limpio de 1,12 centímetros de diámetro y coloque cada muestra en un tubo estéril libre de pirógenos de dos mililitros. Asimismo, transfiera los filtros secos con endotoxinas agregadas a tubos estériles libres de pirógenos de dos mililitros separados.

Añada un mililitro de agua libre de pirógenos a cada tubo y agítelos durante 60 minutos a temperatura ambiente utilizando un agitador de laboratorio. A continuación, centrifugue los tubos de muestra en una microcentrífuga a 375 × g durante 10 minutos.

Luego, transfiera el sobrenadante que contiene los endotoxinas a un nuevo tubo de dos mililitros libre de pirogénos. Prepare una microplaca de 96 pocillos con fondo plano, libre de pirogénos y con tapa, para la prueba de endotoxinas, determinando primero la ubicación de las muestras.

A continuación, encienda el lector de microplacas y configúrelo para una reacción cinética a 37 grados Celsius con agitación cada cinco minutos, seguida de mediciones a 405 nanómetros. Repita la agitación de cinco minutos y la lectura de la placa 18 veces.

Cargue las muestras en el acate colocando 50 microlitros de las soluciones estándar de endotoxinas utilizadas previamente para inocular los filtros en las filas A1 a A10 y B1 a B10. Coloque las muestras en blanco en A11, A12, B11 y B12. A continuación, agregue el sobrenadante del extracto del filtro inoculado centrifugado y sus controles en blanco en las filas C y D. Luego, agregue los sobrenadantes de las muestras experimentales y sus controles en blanco en los pocillos restantes según sea necesario.

Para activar la prueba, agregue rápidamente 50 microlitros de la solución de glicato de amebocito de Limulus a cada pocillo. Agite suavemente la placa en forma horizontal. Antes de colocarla en el lector de placas e iniciar la corrida experimental.

Una vez finalizado, retire la placa del lector de placas. Determine el nivel de endotoxinas en cada muestra utilizando la curva estándar, y también calcule la eficiencia con la que se extraen las endotoxinas de los filtros de muestra. Primero, prepare los filtros con ADN agregado según se describe en el protocolo de texto adjunto.

Para cada muestra de filtro, prepare una mezcla de perlas de vidrio lavadas con ácido en tubos estériles de 0,5 mililitros con 0,1 gramos de perlas que tengan un diámetro de 425 a 600 micrómetros y 0,3 gramos de perlas con un diámetro menor o igual a 106 micrómetros. A continuación, corte tres piezas circulares de ubicaciones seleccionadas al azar en cada muestra de filtro utilizando un sacabocados desinfectado de 1,12 centímetros de diámetro. Coloque las muestras de filtro en tubos individuales de dos mililitros con tapa roscada.

Luego, agregue la mezcla de perlas de vidrio a cada tubo junto con 60 microlitros del tampón de lisis celular suministrado con el kit de extracción de ADN. Cierre los tubos y coloque las muestras en el agitador de perlas. Utilice el agitador de perlas para romper mecánicamente las células filtradas durante un minuto y luego enfríe las muestras colocándolas sobre hielo durante un minuto adicional.

Repita este ciclo cinco veces. Continúe siguiendo el protocolo del proveedor del kit y extraiga el ADN de las células lisadas. Después de la elución, vuelva a cargar la muestra eluida a través de la columna de extracción una segunda vez para mejorar el rendimiento de ADN.

Encienda con anticipación el instrumento de PCR cuantitativa para permitirle tiempo de calentamiento. En un archivo de programa nuevo, ingrese los detalles para la corrida de PCR cuantitativa en el software de operación del instrumento. A continuación, desinfecte la superficie de trabajo con un descontaminante de ADN para superficies y trabaje únicamente con tubos, puntas y reactivos estériles.

Además, coloque un recipiente con hielo junto al banco de trabajo y ponga la mezcla de tac polemoraris en el recipiente. Prepare la mezcla de reacción de PCR cuantitativa según se describe en la tabla cuatro del protocolo de texto adjunto. Y almacene la mezcla de reacción en la oscuridad y sobre hielo hasta su uso.

A continuación, coloque una microplaca limpia en un soporte para placas para evitar que entre en contacto con la superficie de trabajo y mantenerla limpia. Añada un microlitro de ADN patrón, ADN de muestra o agua libre de nucleasas en los pocillos de la microplaca de PCR cuantitativa por triplicado. Luego, añada nueve microlitros de la mezcla maestra de reacción en cada pocillo de reacción.

Una vez finalizado, cubra la placa con una película adhesiva óptica y séllela firmemente por todos los lados. Centrifugue la placa en una centrífuga equipada con cubetas para placas durante un minuto a 1000 ×g antes de colocarla en el termociclador. Finalmente, active y ejecute el programa de PCR cuantitativa preparado.

Durante la extracción de endotoxinas, las muestras filtradas se centrifugan para extraer la endotoxina del filtro. Diferentes velocidades de centrifugación producen diversas eficiencias de extracción, especialmente a concentraciones más altas de endotoxinas.

Debe realizarse una prueba preliminar de eficiencia de extracción para el filtro específico elegido y el protocolo llevado a cabo. Se obtienen mayores eficiencias de extracción al agregar estándares a filtros limpios en comparación con filtros de cuarzo ya muestreados, y ambas eficiencias son menores que la alcanzada mediante la detección directa de la solución estándar. Una vez dominado, el análisis de endotoxinas puede realizarse en tres horas y media si se lleva a cabo correctamente.

Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de ADN para responder preguntas adicionales sobre el transporte de organismos en la atmósfera. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo extraer de forma eficiente endotoxinas y ADN de filtros de muestras de aire y analizarlos con precisión.