Name: Análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a analizar endotoxinas y ADN en partículas aéreas usando filtros de fibra de cuarzo. Este método permite estudiar aerosoles biológicos en ambientes interiores y exteriores con aplicaciones en salud pública.

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Los autores agradecen al Dr. Yoav Barak de la Facultad de Química del Instituto Weizmann, por su apoyo y consejo. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias de Israel (subvención # 913/12), y por la Fundación Minerva con fondos del Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo describe los métodos de extracción y detección para cuantificar tanto las endotoxinas y ADN presente en las muestras recogidas en los filtros de aerosol. Los métodos requieren rutinas precisos y se pueden realizar fácilmente, siempre que el experimentador se adhiere a algunos puntos esenciales e importantes discutidos aquí. Para la etapa de detección de endotoxinas, tenga en cuenta que la solución de lisado es bastante viscoso y tiende a producir burbujas en la pipeta. Es difíci...

El muestreo del aire en los filtros es una herramienta básica en la investigación de los aerosoles atmosféricos. 1 Los filtros de la muestra son el punto de partida para diversos productos químicos, físicos y caracterizaciones biológicas de las partículas ambientales recogidos. 2-11 La ventaja de este enfoque es que varios análisis pueden ser realizado fuera de línea en la misma muestra. La compilación de los datos de todos los diferentes análisis permite al investigador para obtener una buena comprensión de las características de las partículas y las ayudas recogidas en la resolución de cuestiones complejas en las ciencias de la atmósfera 12,13. Por ejemplo, los acondicionadores de muestras marinas y continentales tomadas durante el mismo período puede compararse con respecto a la toxicidad de las partículas en la muestra y la composición biológica. 14 para este estudio, los lipopolisacáridos (LPS), componentes de paredes celulares bacterianas gram-negativas, también conocidos como endotoxinas, se extrajeron de los filtros en la muestra en tierra y en un sitio en el interior, y se evaluaron utilizando elamebocitos de Limulus lisado (LAL). En paralelo, una evaluación genómica del contenido bacteriano (total de bacterias, gram negativo, y cianobacterias) se realizó en la misma muestra usando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR). La prueba de LAL se basa en mediciones de turbidez formados después de la adición de un extracto acuoso de amebocitos del cangrejo de herradura, Limulus polyphemus, a una solución acuosa que contiene las endotoxinas. Cuanto mayor sea la concentración de endotoxina en la muestra, la turbidez más rápido se desarrolla. 15 El análisis q-PCR se basa en una señal de fluorescencia emitida como un fragmento de ADN específico se amplifica. 16 Por la monitorización en tiempo real de la señal durante la fase exponencial de la PCR reacción y de calibración con una curva estándar, la cantidad inicial de ADN se pueden cuantificar. La combinación de estos dos análisis junto con otros, como se detalla en otro lugar, 14 puede proporcionar una buena estimación de los niveles de endotoxina y de lacantidad de las bacterias de origen en las muestras. El propósito del método presentado aquí es obtener un análisis muy preciso y fiable del contenido de endotoxina y ADN de bio-aerosoles extraídos de filtros. Si bien los métodos de muestreo de las características físicas y químicas inorgánicas de aerosoles son bien conocidos y, más recientemente, se han desarrollado métodos para investigar su componente de materia orgánica, 17 no ha sido escasa la investigación sobre el componente biológico de aerosoles. 18 La razón de la corriente método consiste en llenar este vacío mediante la presentación en detalle un método robusto para la extracción, el análisis y la identificación de la fracción biológica de los aerosoles en el aire. 14 Se espera que el método detallado aquí para encontrar amplio uso en proyectos de investigación en aerosol interiores y exteriores biológicos que implican análisis de filtro. 20-24

<table><tbody><tr><td>Filter sampling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiVol 3000 - Muestreador de Aire de Alto Volumen</td><td>Ecotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Microfibra de Cuarzo</td><td>Whatman</td><td>1851-865</td><td>203 mm x 254 mm</td></tr><tr><td>ELF - Hornos de Cámara de Laboratorio</td><td>Carbolite</td><td>ELF 11series</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Opal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Endotoxina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16368&nbsp;</td><td>Reactivo de laboratorio, 96%</td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica Airstream Clase II AC-4E1</td><td>ESCO</td><td>10011712</td><td></td></tr><tr><td>Pyrotell -T</td><td>Associates de Cape Cod, Inc.</td><td>T0051</td><td></td></tr><tr><td>Estándar de Control de Endotoxinas Asociados</td><td>de Cape Cod, Inc.</td><td>E0005-1</td><td>Escherichia coli&nbsp; O113: H10, 0.5 y micro; g/vial 1 paquete de</td></tr><tr><td>reactivo LAL Water</td><td>Associates de Cape Cod, Inc.</td><td>W0051</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa estéril de 10 ml con punta Luer-Lok</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td></td><td></td>309605</tr><tr><td>Aguja de jeringa BD Precisionglide</td><td>Becton-Dickinson & Co.</td><td>305129</td><td>Estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>Cinta de sellado Parafilm-M</td><td>Parafilm</td><td>P7543</td><td>Sigma Número de catálogo</td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>Axigen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 ml, sin pirógenos</td></tr><tr><td>1,12 cm de diámetro Barrenador de corcho</td><td>Boekel Scientific</td><td>1601 BD Series - Acero</td><td>Parte de un juego de barrenadores de corcho que contiene barrenadores de varios diámetros.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 50 mm</td><td>Miniplast Ein-Shemer</td><td>72050-01</td><td>Aséptico</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2&nbsp;</td><td>Industrias Científicas, Inc.</td><td>SI-0297</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5415</td><td>D Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>TC MicroWell 96 F SI con tapa</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Pocillos de fondo plano (con tapa (envueltos individualmente)), estéril, libre de pirógenos</td></tr><tr><td>Synergy HT Lector de Microplacas Multi-Detección</td><td>Biotek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>ADN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA de distancia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>ADN estándar de las especies microbianas de interés</td><td>ATCC u otra colección</td><td></td> de cultivo <td>Ya sea la cepa microbiana adecuada para la extracción de ADN o el ADN</td></tr> <tr><td>extraídoTampón</td><td>TE de hemocitómetro Marienfeld</td><td>640030</td><td></td>mejorado por</tr><tr><td>Neubauer, Low EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)&nbsp; 0,1 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Agua de grado PCR libre de nucleasas&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3315959001</td><td></td></tr><tr><td>cebadores de PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Se dirige a las especies microbianas de interés</td></tr><tr><td>Sigma</td><td>Aldrich</td><td></td> se <td>dirige a las especies microbianas de interés</td></tr><tr><td>Tubos con tapón de rosca</td><td>Axigen</td><td>ST-200-SS</td><td>2 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de extracción de ADN PowerSoil&nbsp;</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de vidrio, lavadas con ácido 425-600 y micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772-100G</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de vidrio, lavadas con ácido < 106 y micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4649-100G</td><td></td></tr><tr><td>PowerSoil Solution C1</td><td>Mo Bio Laboratories</td><td>12888-100-1</td><td>Tampón de lisis celular , Power soil Kit</td></tr><tr><td>Cubitera Magic Touch</td><td>Bel-Art</td><td>18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607EUR</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems 4385612</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Mezcla Maestra de Expresión Génica Applied</td><td>Biosystems</td><td>4370048</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos con código de barras, 0,1 ml</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Base de 96 pocillos sin salpicaduras MicroAmp</td> Base <td>Applied Biosystems</td><td>4312063</td><td></td></tr><tr><td>Película</td> <td>adhesiva óptica MicroAmpCentrífuga</td><td>4311971</td><td></td>Applied Biosystems</tr><tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td>Rotor A-4-62 con cucharas MTP&nbsp;</td></tr></tbody></table>

análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de adn

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

la investigación de aerosol al aire libre comúnmente utiliza partículas muestreada en los filtros. Este procedimiento permite diversas caracterizaciones de las partículas recogidas que se realizan en paralelo. El propósito del método presentado aquí es obtener un análisis muy preciso y fiable del contenido de endotoxina y ADN de bio-aerosoles extraídos de filtros. La extracción de las moléculas de alto peso molecular orgánicos, tales como lipopolisacáridos, de los filtros de la muestra implica agitando la muestra en un medio a base de agua libre de pirógenos. El posterior análisis se basa en una reacción enzimática que puede detectarse utilizando una medición turbidimétrico. Como resultado de la alto contenido orgánico en los filtros en la muestra, la extracción de ADN de las muestras se realiza usando un kit de extracción de ADN comercial que fue diseñado originalmente para suelos y modificado para mejorar el rendimiento de ADN. La detección y cuantificación de especies microbianas específicas utilizando Reacti cadena de la polimerasa cuantitativaen el análisis (q-PCR) se describen y se comparan con otros métodos disponibles.

Es común para estudiar los aerosoles atmosféricos utilizando &quot;off-line&quot; los análisis de los filtros incluidos en la muestra (véase la Figura 2). Analiza 32 Química de la incluirá orgánica (por ejemplo, proteínas, moléculas de hidrocarburos, sacáridos) e inorgánicos (por ejemplo, metales, sales) contenido en la muestra cuestión . análisis biológicos incluyen contenido viable y no viable de microorganismos, la identificación de especi...

En este trabajo se describen dos análisis complementarios de partículas biológicas atmosféricas a partir de filtros muestreados en aire: la extracción y detección de endotoxinas y de ADN.

Análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de ADN

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

El objetivo general de este procedimiento es describir cómo analizar con precisión el contenido de endotoxinas y ADN de partículas suspendidas en el aire extraídas y muestreadas en filtros. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación de aerosoles biológicos en interiores y al aire libre, como comprender las razones de salud. Quien demostrará el procedimiento de muestreo con filtros será Yinon Mazar, un estudiante de posgrado de mi laboratorio.Para muestreos de alto volumen, utilice filtros hechos de fibra de cuarzo. O elija el tipo específico de filtro, así como el tamaño de corte del filtro, que mejor se adapte a las necesidades de la investigación. Precaliente los filtros destinados al muestreo de compuestos orgánicos y biológicos envolviéndolos primero individualmente en papel de aluminio.Y luego hornearlos en un horno de laboratorio a 450 grados Celsius durante al menos cinco horas. Esto destruirá cualquier residuo orgánico preexistente. Almacene los filtros horneados a 20 grados Celsius hasta que se utilicen para el muestreo.A continuación, limpie y desinfecte el muestreador de alto volumen, como el descrito en el protocolo de texto adjunto. Luego, coloque el filtro precalcinado en la cápsula del filtro y haga funcionar el muestreador de acuerdo con las instrucciones del fabricante para recolectar una muestra adecuada. En una cabina de seguridad biológica de clase dos, corte 22 piezas circulares de material de filtro limpio y precalcinado utilizando un sacabocados limpio de 1,12 centímetros de diámetro.Utilice estos fragmentos para preparar una serie de filtros con endotoxinas agregadas que se utilizarán como controles. A continuación, corte los filtros que contienen la muestra recolectada usando un sacabocados limpio de 1,12 centímetros de diámetro y coloque cada muestra en un tubo estéril libre de pirógenos de dos mililitros. Asimismo, transfiera los filtros secos con endotoxinas agregadas a tubos estériles libres de pirógenos de dos mililitros separados.Añada un mililitro de agua libre de pirógenos a cada tubo y agítelos durante 60 minutos a temperatura ambiente utilizando un agitador de laboratorio. A continuación, centrifugue los tubos de muestra en una microcentrífuga a 375 × g durante 10 minutos.Luego, transfiera el sobrenadante que contiene los endotoxinas a un nuevo tubo de dos mililitros libre de pirogénos. Prepare una microplaca de 96 pocillos con fondo plano, libre de pirogénos y con tapa, para la prueba de endotoxinas, determinando primero la ubicación de las muestras.A continuación, encienda el lector de microplacas y configúrelo para una reacción cinética a 37 grados Celsius con agitación cada cinco minutos, seguida de mediciones a 405 nanómetros. Repita la agitación de cinco minutos y la lectura de la placa 18 veces.Cargue las muestras en el acate colocando 50 microlitros de las soluciones estándar de endotoxinas utilizadas previamente para inocular los filtros en las filas A1 a A10 y B1 a B10. Coloque las muestras en blanco en A11, A12, B11 y B12. A continuación, agregue el sobrenadante del extracto del filtro inoculado centrifugado y sus controles en blanco en las filas C y D. Luego, agregue los sobrenadantes de las muestras experimentales y sus controles en blanco en los pocillos restantes según sea necesario.Para activar la prueba, agregue rápidamente 50 microlitros de la solución de glicato de amebocito de Limulus a cada pocillo. Agite suavemente la placa en forma horizontal. Antes de colocarla en el lector de placas e iniciar la corrida experimental.Una vez finalizado, retire la placa del lector de placas. Determine el nivel de endotoxinas en cada muestra utilizando la curva estándar, y también calcule la eficiencia con la que se extraen las endotoxinas de los filtros de muestra. Primero, prepare los filtros con ADN agregado según se describe en el protocolo de texto adjunto.Para cada muestra de filtro, prepare una mezcla de perlas de vidrio lavadas con ácido en tubos estériles de 0,5 mililitros con 0,1 gramos de perlas que tengan un diámetro de 425 a 600 micrómetros y 0,3 gramos de perlas con un diámetro menor o igual a 106 micrómetros. A continuación, corte tres piezas circulares de ubicaciones seleccionadas al azar en cada muestra de filtro utilizando un sacabocados desinfectado de 1,12 centímetros de diámetro. Coloque las muestras de filtro en tubos individuales de dos mililitros con tapa roscada.Luego, agregue la mezcla de perlas de vidrio a cada tubo junto con 60 microlitros del tampón de lisis celular suministrado con el kit de extracción de ADN. Cierre los tubos y coloque las muestras en el agitador de perlas. Utilice el agitador de perlas para romper mecánicamente las células filtradas durante un minuto y luego enfríe las muestras colocándolas sobre hielo durante un minuto adicional.Repita este ciclo cinco veces. Continúe siguiendo el protocolo del proveedor del kit y extraiga el ADN de las células lisadas. Después de la elución, vuelva a cargar la muestra eluida a través de la columna de extracción una segunda vez para mejorar el rendimiento de ADN.Encienda con anticipación el instrumento de PCR cuantitativa para permitirle tiempo de calentamiento. En un archivo de programa nuevo, ingrese los detalles para la corrida de PCR cuantitativa en el software de operación del instrumento. A continuación, desinfecte la superficie de trabajo con un descontaminante de ADN para superficies y trabaje únicamente con tubos, puntas y reactivos estériles.Además, coloque un recipiente con hielo junto al banco de trabajo y ponga la mezcla de tac polemoraris en el recipiente. Prepare la mezcla de reacción de PCR cuantitativa según se describe en la tabla cuatro del protocolo de texto adjunto. Y almacene la mezcla de reacción en la oscuridad y sobre hielo hasta su uso.A continuación, coloque una microplaca limpia en un soporte para placas para evitar que entre en contacto con la superficie de trabajo y mantenerla limpia. Añada un microlitro de ADN patrón, ADN de muestra o agua libre de nucleasas en los pocillos de la microplaca de PCR cuantitativa por triplicado. Luego, añada nueve microlitros de la mezcla maestra de reacción en cada pocillo de reacción.Una vez finalizado, cubra la placa con una película adhesiva óptica y séllela firmemente por todos los lados. Centrifugue la placa en una centrífuga equipada con cubetas para placas durante un minuto a 1000 ×g antes de colocarla en el termociclador. Finalmente, active y ejecute el programa de PCR cuantitativa preparado.Durante la extracción de endotoxinas, las muestras filtradas se centrifugan para extraer la endotoxina del filtro. Diferentes velocidades de centrifugación producen diversas eficiencias de extracción, especialmente a concentraciones más altas de endotoxinas.Debe realizarse una prueba preliminar de eficiencia de extracción para el filtro específico elegido y el protocolo llevado a cabo. Se obtienen mayores eficiencias de extracción al agregar estándares a filtros limpios en comparación con filtros de cuarzo ya muestreados, y ambas eficiencias son menores que la alcanzada mediante la detección directa de la solución estándar. Una vez dominado, el análisis de endotoxinas puede realizarse en tres horas y media si se lleva a cabo correctamente.Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de ADN para responder preguntas adicionales sobre el transporte de organismos en la atmósfera. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo extraer de forma eficiente endotoxinas y ADN de filtros de muestras de aire y analizarlos con precisión.

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Ensayo de actividad de endotoxinas: un bioensayo basado en quimioluminiscencia para investigar la actividad de endotoxinas en muestras de sangre

Este video describe el formato turbidimétrico del ensayo de lisado de amebocitos Limulus, o LAL, para estimar la contaminación por endotoxinas en nanoformulaciones de doxorrubicina liposomal pegilada. La turbidez de la solución después de la reacción de la endotoxina con el reactivo LAL ayuda a estimar la endotoxina en la muestra.

Ensayo de lisado de amebocitos de Limulus turbidimétrico: una técnica para detectar y cuantificar la contaminación por endotoxinas en fármacos nanoformulados

Este video describe un ensayo de coágulos de gel para determinar la presencia de endotoxinas bacterianas en nanoformulaciones utilizando el lisado de amebocitos de Limulus derivado de las células sanguíneas de cangrejos herradura. El ensayo ayuda a analizar la contaminación por endotoxinas de los productos farmacéuticos, incluidas las formulaciones basadas en nanotoxinas.

Ensayo de lisado de amebocitos de Limulus con coágulo de gel: un método para la detección de endotoxinas bacterianas en formulaciones de nanopartículas

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