Name: Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprende a transformar Saccharomyces boulardii para expresar proteínas heterólogas en el tracto gastrointestinal murino. Estas técnicas permiten generar cepas auxotróficas sin selección antibiótica y verificar su adherencia a parches de Peyer.

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Los autores reconocen la financiación a través del Centro Infantil de Inmunología y Vacunas y un premio Innovador Nueva NIH (1DP2AI112242-01) adjudicado a Tracey J. Cordero. Los autores también agradecen a Natalya P. Degtyareva por la generosa contribución de rad1 S. cerevisiae.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Juntos, los protocolos en este documento se describen los pasos esenciales necesarios para el desarrollo y prueba de cepas de levadura auxotróficos probióticos para la entrega de la proteína terapéutica heteróloga al intestino. Esta manipulación y el ensayo de levadura viva recombinante requiere técnicas y recursos con los que cualquier laboratorio individuo puede no estar familiarizado actualmente. Por lo tanto, a pesar de numerosos estudios anteriores han descrito los protocolos anteriores para múltiples cepas de leva...

Los microorganismos probióticos son un medio potenciales interesantes de la entrega de manera eficiente y económica proteínas heterólogas en el tracto gastrointestinal. Estos organismos son capaces de sobrevivir el paso a través del tracto gastrointestinal sin embargo no colonizarlo 1, lo que permite la dosificación controlada y limitar la exposición a la droga expresó. Además, la capacidad de diseñar fácilmente estos organismos para producir la proteína heteróloga a gran escala las hace una alternativa económica a las partículas de entrega sintéticos. Sin embargo, el desarrollo de un enfoque de este tipo, como se ha demostrado recientemente el uso de una cepa auxotrófica de la levadura Saccharomyces probióticas boulardii 2, requiere el conocimiento de las técnicas de laboratorio sin combinar tradicionalmente en un estudio dado, que van desde la levadura y la biología molecular de las técnicas de manipulación de los animales y métodos inmunológicos. Así, aunque los procedimientos individuales descritos en este documento no son en sí mismos novelaprotocolos de laboratorio, el objetivo de este manuscrito es presentar una introducción a las técnicas unificada necesarios para las pruebas experimentales de la levadura probiótica como vehículos de administración de fármacos en el tracto gastrointestinal murino. Proporcionada es una compilación de los protocolos esenciales para: 1) la generación de cepas mutantes auxotróficos de levadura que pueden ser fácilmente manipulados genéticamente; 2) la transformación de cultivos de levaduras para expresar la proteína heteróloga; 3) la administración de levadura recombinante al intestino a través de una sonda nasogástrica; y 4) la recuperación de la levadura recombinante probiótico viable desde el intestino murino y evaluación de su expresión de la proteína heteróloga. En primer lugar, si bien existen numerosos métodos de selección positivos y negativos para la manipulación de especies de levadura, selección negativa tal como mediante el uso de marcadores auxotróficos aumenta tanto la eficiencia y la facilidad con la que la levadura puede ser transformada y seleccionado. La selección positiva de los transformantes usando antibióticos, en contrast, aumenta significativamente el coste de la manipulación de la levadura. Por otra parte, la selección de la levadura en medio sólido que contiene los antibióticos puede permitir un mayor crecimiento de las colonias transformadas fondo relativos a la selección de la levadura auxotrófico en caída sintética a cabo los medios sólidos (observaciones no publicadas). levadura auxotrófico es cepas que carecen de enzimas críticas para la síntesis de los aminoácidos esenciales o uracilo. Tal levadura puede crecer solamente si se complementa con el metabolito falta o genes metabólicos, lo que permite que la selección negativa cuando la levadura se cultivó en placas sobre gota sintética a cabo los medios de comunicación que carece del metabolito esencial. Muchos Saccharomyces comúnmente usados ​​son cepas de laboratorio cerevisiae, de hecho, ya mutantes auxotróficos 3. Industrial, clínica, y las cepas de levadura probióticas, sin embargo, son típicamente prototrophic con la capacidad de sintetizar todos los nutrientes requeridos. Para permitir la manipulación genética más eficiente de tal levadura, genes auxotróficos pueden ser dirigidos selectivamentepara generar cepas que se pueden seleccionar sin antibióticos. La orientación específica de los genes marcadores auxotróficos se puede lograr a través de la interrupción de genes mediada por PCR basándose en la recombinación homóloga o más recientemente a través de CRISPR / Cas9 orientación 4-6. Como alternativa, la mutagénesis UV puede generar rápidamente los mutantes auxotróficos incluso en cepas de levadura para las que la transformación con múltiples plásmidos es técnicamente difícil 7. Si bien la orientación CRISPR PCR y / Cas9 han sido ampliamente descritos en otras partes, presentado en la primera parte de este manuscrito es un protocolo detallado que describe un enfoque de mutagénesis UV para crear cepas auxotróficas que permitan la selección negativa en lugar de los antibióticos de selección positiva de los transformantes de levadura. El siguiente paso necesario en el uso de tales cepas auxotróficas para la administración oral de la proteína heteróloga es la transformación de levadura con ADN de plásmido. Desde la primera transformación con éxito de síest esferoplastos reportados para Saccharomyces cerevisiae en 1978 8, numerosas modificaciones se han caracterizado para aumentar la eficiencia y la facilidad con la que las especies de levadura se pueden modificar genéticamente. El uso de electroporación para la transformación exitosa de ADN en S. cerevisiae fue descrita por primera vez en 1985 9 y desde entonces ha sido mejorada mediante la adición de incubación de 1 M de sorbitol al 10 osmóticamente células de apoyo. Eficiencia electroporación Además, se ha demostrado que dependen de la especie de levadura y cepa, el número de células y la fase de crecimiento, el volumen de la electroporación, la intensidad de campo, y tampones específicos 11. La transformación de litio de etilo (LiOAc), originalmente descrita por Ito et al. 12, es uno de los protocolos de transformación más comúnmente utilizados, ya que no requiere ningún equipo especial. Análisis adicionales mostraron que la eficiencia de transformación de levadura LiOAc aumenta en gran medida cuando las células se recogen en fase semilogarítmicade crecimiento y se sorprendió de calor en presencia de polietilenglicol (PEG) y el ADN a 42 ° C 12. La incubación de la levadura intacta entera con PEG es esencial para la transformación eficiente, posiblemente a través de la mejora de la unión de ADN a la membrana celular, así como a través de otros efectos sobre la membrana 13. Sí litio también aumenta la permeabilidad de las células intactas 14. Aunque la mayor parte de laboratorio S. cepas cerevisiae pueden ser fácilmente transformado mediante LiOAc transformación 3, otras especies de levaduras pueden ser transformadas de manera más eficiente a través de protocolos alternativos. Pichia pastoris, por ejemplo, es más eficiente transformado a través de la electroporación en lugar de transformación LiOAc 13. Es crucial, por lo tanto, para probar múltiples métodos de transformación y para optimizar los periodos de incubación y las concentraciones de reactivos cuando se trata de modificar genéticamente una cepa de levadura sin caracterizar. Por tanto, este manuscrito describe tanto LiOAc transformation y electroporación como técnicas para la transformación del mutante auxotrófico y de tipo salvaje S. boulardii. Los lectores interesados ​​pueden dirigirse a las recientes revisiones para descripciones exhaustivas de la evolución de la transformación de levadura, protocolos alternativos, y más discusiones de posibles mecanismos de acción 13,15. Transformación de levadura con el plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable es, además, esencial para las pruebas de aguas abajo con el fin de asegurar la expresión y función de la proteína heteróloga adecuada. proteínas Myriad diferentes pueden seleccionarse en función del objetivo final del estudio terapéutico y los anticuerpos disponibles para la detección de proteínas por inmunotransferencia, ELISA, y otras técnicas. Los protocolos para estas técnicas se han descrito a fondo en otra parte 16,17, y se pueden utilizar para determinar los niveles de producción de proteínas heterólogas a partir de levadura transformada por comparación con las curvas de calibración. Para los propósitos de demostración y para mostrarproducción exitosa de una proteína muy utilizado comúnmente en la biología de la levadura, este manuscrito presenta transformación con plásmido que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), que permite la posterior detección mediante microscopía de fluorescencia. Igualmente importante para la producción de organismos probióticos que expresan la proteína heteróloga es la adecuada administración y detección de estos microorganismos dentro de los tejidos gastrointestinales, como se describe en partes tres y cuatro. La administración de levadura recombinante a través de una sonda oral permite la entrega de cantidades controladas de levadura directamente en el estómago, de la que C57BL / 6 ratones son naturalmente incapaz de vómitos 18. Sin embargo, el manejo de animales inadecuada y alimentación forzada puede conducir a daño esofágico y perforación, perforación gástrica, administración traqueal, y neumonía por aspiración 19,20. Una técnica deficiente y la falta de experiencia, además, pueden aumentar la variabilidad en la respuesta inmune murina experimental y results, que han sido atribuidos a estrés de los animales sobre una sonda oral 21,22. La práctica en la técnica apropiada de este modo no sólo puede atenuar las molestias animal, pero también puede aumentar la precisión de los resultados experimentales. Este manuscrito describe y demuestra la manipulación de animales y una sonda nasogástrica para la administración de dosis controladas de levadura recombinante. Por último, es vital para confirmar la entrega exitosa de levadura recombinante mediante el análisis de tejidos linfoides para la presencia de la levadura y la proteína heteróloga. Los tejidos inmunes gastrointestinales que pueden más fácilmente y de manera previsible ser examinados para la presencia de la levadura son las placas de Peyer. Placas de Peyer son órganos linfoides secundarios a lo largo del intestino delgado que son sitios clave de la mucosa inducción respuesta inmune 23. Antígenos de los lumen se transfieren transcelular a través de micropliegues células (M) en el epitelio y se liberan en las placas de Peyer, exponiendo así encerrard antígeno de células presentadoras de contenido luminal intestinal. Aunque la absorción de partículas a través del epitelio intestinal también se puede lograr por las células caliciformes, estas células se ha demostrado que sólo ocupan partículas de menos de 0,02 m de diámetro 24. Dendritas transepiteliales extendieron a partir de células dendríticas CD103 + (DC) también ocupan pequeñas partículas desde el lumen intestinal 25; Sin embargo, actualmente no existen informes que demuestran que CD103 + DC ocupan las partículas más grandes que las bacterias. Por lo tanto, la levadura probiótica intacto, de tamaño medio de entre 3 a 6 m de diámetro, son más propensos a ser absorbidos por las células M y se transfirió a las placas de Peyer. Descrito aquí es un protocolo de recogida y selección de las placas de Peyer para levadura recombinante viable, aunque este procedimiento también se puede adaptar fácilmente para la evaluación de la absorción de bacterias probióticas. En resumen, la evaluación de la levadura recombinante probiótico para la entrega de larapeutic proteínas en el intestino requiere el dominio de las técnicas de laboratorio que abarcan la biología molecular para el manejo de animales e inmunología. Aquí se presentan son los protocolos para 1) la generación y selección de cepas de levadura auxotróficos que puede ser fácilmente seleccionado negativamente sin antibióticos, 2) protocolos alternativos para transformar la levadura y permiten la expresión de la proteína heteróloga, 3) demostraciones de técnicas de manejo de animales adecuados y sonda oral durante intragástrico la entrega de la levadura recombinante, y 4) protocolos para la disección de las placas de Peyer y la detección de levadura recombinante viable y funcional proteína heteróloga. Combinados, estos protocolos permitirán la generación y prueba de una cepa de levadura probiótico capaz de entregar proteína terapéutica heterólogo en el tracto gastrointestinal.

<table><tbody><tr><td>Espectrofotómetro SmartSpec 3000</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Ejemplo de espectrofotómetro para determinar la concentración celular y el diámetro exterior 600 de cultivos de levadura</td></tr><tr><td>New Brunswick Tambor de rodillos</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Ejemplo de tambor de rodillos para la incubación de cultivos de levadura</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Ejemplo de stratalinker</td></tr><tr><td>Contador de colonias Stuart SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher</td><td>Scientific Plate soporte con registros de aumento recuento de colonias al detectar la presión de la pluma</td></tr><tr><td>Contador de colonias Scienceware&nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware Bolígrafo de</td><td>mano para contadores de colonias</td></tr><tr><td>Réplica de dispositivo de recubrimiento</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Ejemplo de réplica de soporte y almohadillas de recubrimiento&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuadrados de terciopelo</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>Esparcidores de células estériles en forma de L&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Ácido desoxirribonucleico, monocatenario de testículos de salmón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Ejemplo de ADN portador para levadura Transformación de LiOAc</td></tr><tr><td>Agujas de sonda nasogástrica</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp; 002</td><td>Para ratones de 15 a 20 g, la aguja sugerida es una aguja de sonda nasogástrica reutilizable de calibre 22 (1,25 mm), recta y de 1 pulgada de largo. Para ratones que pesen más de 20 &nbsp; g, se pueden usar agujas de sonda nasogástrica rectas o curvas de calibre 20 o más grandes</td></tr> 1 <tr><td>ml estéril de punta deslizante jeringa de tuberculina desechable</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas romas como Electrónica Microscopy Sciences Punta dentada de 7" (178 mm), pinzas de agarre amplio</td> Ciencias de la <td>Microscopía Electrónica</td><td>77937-28</td><td>Ejemplo de pinzas romas necesarias para la disección&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras de disección rectas y curvas</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>72966-02 y 72966-03</td><td>Ejemplos de tijeras necesarias para la disección</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

El desarrollo de la terapia oral recombinante permitiría dirigirse más directamente al sistema inmunitario de la mucosa y mejorar la capacidad de combatir los trastornos gastrointestinales. La adaptación de la levadura probiótica en particular para este enfoque conlleva varias ventajas. Estas cepas no solo tienen el potencial de sintetizar una amplia variedad de proteínas heterólogas complejas, sino que también son capaces de sobrevivir y proteger esas proteínas durante el tránsito a través del intestino. Sin embargo, este enfoque requiere experiencia en muchas técnicas de laboratorio diversas que no suelen utilizarse en conjunto. Además, aunque los protocolos individuales para la transformación de la levadura están bien caracterizados para las cepas de laboratorio de uso común, aquí se hace hincapié en los enfoques alternativos y en la importancia de optimizar la transformación para las cepas probióticas menos caracterizadas. Detallar estos métodos ayudará a facilitar el debate sobre los mejores enfoques para probar la levadura probiótica como vehículos de administración de fármacos orales y, de hecho, servirá para avanzar en el desarrollo de esta nueva estrategia para la terapia gastrointestinal.

Generación de una curva de supervivencia después de la irradiación UV requiere placas de células de levadura diluidas de tal manera que unidades formadoras de colonias (CFU) distintos son capaces de formar. Cada muestra de 500 l recogida como se ha descrito anteriormente contiene aproximadamente 5 x 10 6 células; Sin embargo, más de 100 colonias por placa son difíciles de distinguir con precisión. Revestimiento de la muestra sin diluir así como de serie diluciones 1:10 de las ...

Se presenta aquí una descripción unificada de las técnicas que se pueden utilizar para desarrollar, transformar, administrar y poner a prueba la expresión de proteínas heterólogas de la levadura probiótica Saccharomyces boulardii.

Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

El objetivo general de estos procedimientos es desarrollar una cepa de levadura probiótica que pueda transformarse fácilmente para expresar y entregar proteínas heterólogas al tracto gastrointestinal de ratón. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten la generación rápida de cepas oxitróficas de levadura probiótica. Estas levaduras mutantes luego pueden manipularse genéticamente sin depender de la selección con antibióticos.La administración oral por gavaje en ratones y la obtención de las placas de Peyer también permiten verificar la adherencia de levaduras mutantes a los tejidos inmunitarios gastrointestinales. Estos métodos ayudarán a responder preguntas clave en el campo de la vacunación oral y facilitarán experimentos para evaluar probióticos en la administración de terapéuticos gastrointestinales. Después de preparar el medio YPD y cultivar las levaduras durante la noche hasta alcanzar la saturación, diluya las células uno a diez en agua en una cubeta de plástico.Luego, conecte un espectrofotómetro y determine la densidad óptica del cultivo nocturno. Diluya las células con 20 mililitros de agua destilada estéril hasta una concentración de 10 a la séptima células por mililitro. A continuación, vierta las células diluidas en una placa de Petri plástica estéril y, con la tapa retirada, coloque la placa en un cruzador de UV.A continuación, exponga la solución celular a dosis acumulativas e incrementales de irradiación UV, extrayendo alícuotas de 500 microlitros tras cada incremento para establecer una curva de letalidad e identificar el porcentaje óptimo de supervivencia para el cribado. Utilice agua estéril para diluir seriamente las células en incrementos de uno a diez. Luego, haga un pellet de las células de cada dilución mediante centrifugación a velocidad máxima durante un minuto.Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en un volumen de 100 microlitros de agua estéril adecuada para la siembra de células de levadura. Luego, pipetee el volumen completo de células resuspendidas sobre placas que contengan medio sólido YPD y utilice un espátula estéril para distribuir uniformemente las células en cada placa. Trace una curva de supervivencia y determine la dosis de irradiación UV a utilizar para el cribado según el protocolo descrito en el texto.Después de exponer la levadura a la dosis de irradiación UV seleccionada para el cribado, centrifugue todo el volumen de células irradiadas y utilice 100 microlitros de agua estéril para resuspender el sedimento. Siembre en medio mínimo que contenga 5-FOA según el protocolo descrito en el texto, con el fin de seleccionar sus tres newtons tróficos negativos. Confirme el fenotipo negativo para URA3 utilizando la punta de un palillo estéril para recoger parte de una colonia individual en la placa de 5-FOA, y repase nuevamente en placas de YPD, 5-FOA y sin uracilo.Envuelva las placas e incube boca abajo a 30 grados Celsius durante dos a cuatro días. Confirme el estado oxitrofico verificando el crecimiento de colonias en YPD y 5-FOA, pero no en placas sin uracilo. Después de confirmar el estado negativo para URA-3 de la levadura irradiada, prepare un filtro nocturno para la transformación con acetato de litio, inoculando 10 mililitros de YPD con una colonia mutante individual e incube en un cuarto cálido a 30 grados Celsius.Al día siguiente, utilice 50 mililitros de YPD fresco y tibio para diluir los cultivos nocturnos hasta una DO600 de 0,16 a 0,2, e incube las células en un agitador orbital ajustado a 200 RPM, hasta que el cultivo alcance aproximadamente uno por diez a la séptima células por mililitro, lo cual suele tardar alrededor de cuatro horas. Después de lavar las células con agua y acetato de litio según el protocolo, añada 50 microlitros de células resuspendidas a una mezcla de transformación de ADN plasmídico y ADN vehículo. Luego, añada 300 microlitros de PEG, TE y acetato de litio y vortexee.Incube las preparaciones a 30 grados Celsius en un agitador orbital a 200 RPM durante 30 minutos. Continúe con la transformación según se describe en el protocolo escrito. Después de preparar los cultivos de levadura según el protocolo escrito, utilice un hemocitómetro para determinar la concentración celular y ajústela a 10 a la novena células por mililitro.Centrifugar las células a 2500 veces G durante tres minutos para obtener el sedimento. A continuación, desechar el sobrenadante y resuspender las células agregando el volumen apropiado de agua estéril, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Colocar una aguja de sonda del calibre adecuado en una jeringa estéril de un mililitro y cargar la muestra de levadura, eliminando cualquier burbuja de aire.Cargue una jeringa adicional con agua estéril para administrarla por gavaje a los ratones de control. Con la mano no dominante, tome el ratón al que se administrará el gavaje y, con el dedo índice y el pulgar, sujete firmemente la piel alrededor del cuello. Coloque la cola debajo del dedo meñique.Asegúrese de que el agarre sea firme y evite que el ratón mueva la cabeza. A continuación, inserte suavemente la aguja de gavaje en el esófago del ratón inclinando la aguja a lo largo del paladar y la parte posterior de la garganta, manteniéndola ligeramente a la izquierda del centro. Espere a que el ratón trague la ampolla de la aguja.Si se siente resistencia o el ratón jadea, retire suavemente la aguja e intente nuevamente localizar el esófago. Una vez que el ratón haya tragado la ampolla de la aguja de gavaje, presione suavemente el émbolo de la jeringa para administrar la levadura directamente en el estómago del ratón. Retire suavemente la aguja de gavaje del estómago y el esófago del ratón y devuélvalo a la jaula.Verifique que el ratón respire y se mueva normalmente para asegurar que la administración por gavaje se realizó correctamente. Después de sacrificar al ratón según el protocolo descrito, colóquelo con el abdomen completamente expuesto y use etanol al 70% para rociar la zona abdominal. Con tijeras, realice una incisión transversal a través del pelaje y la piel.Luego, abra manualmente la incisión para exponer aún más el peritoneo, el delgado revestimiento seroso que cubre los órganos abdominales. Levante suavemente el peritoneo y realice una incisión transversal para exponer los intestinos. A continuación, use pinzas romas para separar cuidadosamente el intestino delgado de las arterias mesentéricas, la grasa y otros tejidos.Exponga el intestino delgado desde el estómago en el cuadrante superior izquierdo del abdomen del ratón hasta el ciego, la bolsa grande de tejido intestinal al inicio del intestino grueso. A continuación, aísle las placas de Peyer buscando parches de tejido opaco, aproximadamente circulares, de uno a dos milímetros de tamaño a lo largo del intestino delgado. Luego, utilizando tijeras de disección curvas, corte la cúpula de la placa de Peyer, dejando márgenes para asegurar que no se recoja ningún tejido circundante.Transfiera las placas de Peyer disecadas al IMDM completo. A continuación, vierta la solución con las placas de Peyer suspendidas sobre un filtro celular de 40 micrómetros. Después de lavar las placas de Peyer con IMDM completo, utilice el émbolo de una jeringa de un mililitro para deshacer suavemente el tejido y recolecte las células en un tubo de 50 mililitros.Centrifugar las células filtradas a 1800 RPM durante siete minutos. A continuación, sembrar y analizar las células según el protocolo descrito en el texto. Esta figura muestra un cultivo procedente de una dilución en serie de células de S. boulardii irradiadas.La dilución seriada asegura que las UFC pudieran ser enumeradas en cada dosis de UV. A partir de estas imágenes de placas de levadura, el crecimiento constante de colonias mutantes en placas YPD y 5-FOA, pero no en placas sin uracilo, indica un fenotipo oxitrófico menos uracilo. Este gráfico ilustra la eficiencia de transformación para el tipo silvestre S. boulardii, en comparación con S. cerevisiae, utilizando ambas técnicas: acetato de litio y electrotransformación.Aunque la transformación con acetato de litio es muy eficiente para S. cerevisiae, la eficiencia de transformación para S. boulardii mejora considerablemente utilizando electroforesis. En estas imágenes de campo brillante y fluorescencia, S. cerevisiae transformado con un plásmido URA3 que codifica GFE demuestra una expresión funcional de proteína heteróloga. En esta figura, se muestra un ejemplo del uso viable de UFC detectado en las placas de Peyer tras la disección del animal.Un rendimiento típico de CF recuperadas por ratón es inferior a 10. Ahora debería tener una buena comprensión de cómo generar cepas mutantes oxitroficas de levadura probiótica, utilizando mutagénesis por UV. También hemos descrito cómo evaluar la capacidad de estas levaduras para expresar proteínas heterólogas y adherirse a las placas de Peyer del intestino delgado del ratón.Tras seguir estos procedimientos, se pueden utilizar otros métodos, como ELISA y microscopía de fluorescencia, para evaluar el plegamiento y la función adecuados de las proteínas heterólogas expresadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Evaluación de los efectos del trasplante de microbiota fecal en un ratón con deficiencia de interleucina-10

Este video muestra la administración oral de células de levadura transformadas en un modelo de ratón. Las células de levadura transformadas se administran por vía oral mediante una técnica de sonda nasogástrica, llegando al estómago del ratón. Más tarde, las células migran al intestino delgado, donde las células de los micropliegues las engullen y facilitan su transferencia a los parches de Peyer y acceden al sistema inmunitario intestinal.

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Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones (Video) | JoVE Journal

Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

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