Name: Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Aprende a transformar Saccharomyces boulardii para expresar proteínas heterólogas en el tracto gastrointestinal murino. Estas técnicas permiten generar cepas auxotróficas sin selección antibiótica y verificar su adherencia a parches de Peyer.

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Los autores reconocen la financiación a través del Centro Infantil de Inmunología y Vacunas y un premio Innovador Nueva NIH (1DP2AI112242-01) adjudicado a Tracey J. Cordero. Los autores también agradecen a Natalya P. Degtyareva por la generosa contribución de rad1 S. cerevisiae.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Juntos, los protocolos en este documento se describen los pasos esenciales necesarios para el desarrollo y prueba de cepas de levadura auxotróficos probióticos para la entrega de la proteína terapéutica heteróloga al intestino. Esta manipulación y el ensayo de levadura viva recombinante requiere técnicas y recursos con los que cualquier laboratorio individuo puede no estar familiarizado actualmente. Por lo tanto, a pesar de numerosos estudios anteriores han descrito los protocolos anteriores para múltiples cepas de leva...

Los microorganismos probióticos son un medio potenciales interesantes de la entrega de manera eficiente y económica proteínas heterólogas en el tracto gastrointestinal. Estos organismos son capaces de sobrevivir el paso a través del tracto gastrointestinal sin embargo no colonizarlo 1, lo que permite la dosificación controlada y limitar la exposición a la droga expresó. Además, la capacidad de diseñar fácilmente estos organismos para producir la proteína heteróloga a gran escala las hace una alternativa económica a las partículas de entrega sintéticos. Sin embargo, el desarrollo de un enfoque de este tipo, como se ha demostrado recientemente el uso de una cepa auxotrófica de la levadura Saccharomyces probióticas boulardii 2, requiere el conocimiento de las técnicas de laboratorio sin combinar tradicionalmente en un estudio dado, que van desde la levadura y la biología molecular de las técnicas de manipulación de los animales y métodos inmunológicos. Así, aunque los procedimientos individuales descritos en este documento no son en sí mismos novelaprotocolos de laboratorio, el objetivo de este manuscrito es presentar una introducción a las técnicas unificada necesarios para las pruebas experimentales de la levadura probiótica como vehículos de administración de fármacos en el tracto gastrointestinal murino. Proporcionada es una compilación de los protocolos esenciales para: 1) la generación de cepas mutantes auxotróficos de levadura que pueden ser fácilmente manipulados genéticamente; 2) la transformación de cultivos de levaduras para expresar la proteína heteróloga; 3) la administración de levadura recombinante al intestino a través de una sonda nasogástrica; y 4) la recuperación de la levadura recombinante probiótico viable desde el intestino murino y evaluación de su expresión de la proteína heteróloga. En primer lugar, si bien existen numerosos métodos de selección positivos y negativos para la manipulación de especies de levadura, selección negativa tal como mediante el uso de marcadores auxotróficos aumenta tanto la eficiencia y la facilidad con la que la levadura puede ser transformada y seleccionado. La selección positiva de los transformantes usando antibióticos, en contrast, aumenta significativamente el coste de la manipulación de la levadura. Por otra parte, la selección de la levadura en medio sólido que contiene los antibióticos puede permitir un mayor crecimiento de las colonias transformadas fondo relativos a la selección de la levadura auxotrófico en caída sintética a cabo los medios sólidos (observaciones no publicadas). levadura auxotrófico es cepas que carecen de enzimas críticas para la síntesis de los aminoácidos esenciales o uracilo. Tal levadura puede crecer solamente si se complementa con el metabolito falta o genes metabólicos, lo que permite que la selección negativa cuando la levadura se cultivó en placas sobre gota sintética a cabo los medios de comunicación que carece del metabolito esencial. Muchos Saccharomyces comúnmente usados ​​son cepas de laboratorio cerevisiae, de hecho, ya mutantes auxotróficos 3. Industrial, clínica, y las cepas de levadura probióticas, sin embargo, son típicamente prototrophic con la capacidad de sintetizar todos los nutrientes requeridos. Para permitir la manipulación genética más eficiente de tal levadura, genes auxotróficos pueden ser dirigidos selectivamentepara generar cepas que se pueden seleccionar sin antibióticos. La orientación específica de los genes marcadores auxotróficos se puede lograr a través de la interrupción de genes mediada por PCR basándose en la recombinación homóloga o más recientemente a través de CRISPR / Cas9 orientación 4-6. Como alternativa, la mutagénesis UV puede generar rápidamente los mutantes auxotróficos incluso en cepas de levadura para las que la transformación con múltiples plásmidos es técnicamente difícil 7. Si bien la orientación CRISPR PCR y / Cas9 han sido ampliamente descritos en otras partes, presentado en la primera parte de este manuscrito es un protocolo detallado que describe un enfoque de mutagénesis UV para crear cepas auxotróficas que permitan la selección negativa en lugar de los antibióticos de selección positiva de los transformantes de levadura. El siguiente paso necesario en el uso de tales cepas auxotróficas para la administración oral de la proteína heteróloga es la transformación de levadura con ADN de plásmido. Desde la primera transformación con éxito de síest esferoplastos reportados para Saccharomyces cerevisiae en 1978 8, numerosas modificaciones se han caracterizado para aumentar la eficiencia y la facilidad con la que las especies de levadura se pueden modificar genéticamente. El uso de electroporación para la transformación exitosa de ADN en S. cerevisiae fue descrita por primera vez en 1985 9 y desde entonces ha sido mejorada mediante la adición de incubación de 1 M de sorbitol al 10 osmóticamente células de apoyo. Eficiencia electroporación Además, se ha demostrado que dependen de la especie de levadura y cepa, el número de células y la fase de crecimiento, el volumen de la electroporación, la intensidad de campo, y tampones específicos 11. La transformación de litio de etilo (LiOAc), originalmente descrita por Ito et al. 12, es uno de los protocolos de transformación más comúnmente utilizados, ya que no requiere ningún equipo especial. Análisis adicionales mostraron que la eficiencia de transformación de levadura LiOAc aumenta en gran medida cuando las células se recogen en fase semilogarítmicade crecimiento y se sorprendió de calor en presencia de polietilenglicol (PEG) y el ADN a 42 ° C 12. La incubación de la levadura intacta entera con PEG es esencial para la transformación eficiente, posiblemente a través de la mejora de la unión de ADN a la membrana celular, así como a través de otros efectos sobre la membrana 13. Sí litio también aumenta la permeabilidad de las células intactas 14. Aunque la mayor parte de laboratorio S. cepas cerevisiae pueden ser fácilmente transformado mediante LiOAc transformación 3, otras especies de levaduras pueden ser transformadas de manera más eficiente a través de protocolos alternativos. Pichia pastoris, por ejemplo, es más eficiente transformado a través de la electroporación en lugar de transformación LiOAc 13. Es crucial, por lo tanto, para probar múltiples métodos de transformación y para optimizar los periodos de incubación y las concentraciones de reactivos cuando se trata de modificar genéticamente una cepa de levadura sin caracterizar. Por tanto, este manuscrito describe tanto LiOAc transformation y electroporación como técnicas para la transformación del mutante auxotrófico y de tipo salvaje S. boulardii. Los lectores interesados ​​pueden dirigirse a las recientes revisiones para descripciones exhaustivas de la evolución de la transformación de levadura, protocolos alternativos, y más discusiones de posibles mecanismos de acción 13,15. Transformación de levadura con el plásmido que codifica una proteína fácilmente detectable es, además, esencial para las pruebas de aguas abajo con el fin de asegurar la expresión y función de la proteína heteróloga adecuada. proteínas Myriad diferentes pueden seleccionarse en función del objetivo final del estudio terapéutico y los anticuerpos disponibles para la detección de proteínas por inmunotransferencia, ELISA, y otras técnicas. Los protocolos para estas técnicas se han descrito a fondo en otra parte 16,17, y se pueden utilizar para determinar los niveles de producción de proteínas heterólogas a partir de levadura transformada por comparación con las curvas de calibración. Para los propósitos de demostración y para mostrarproducción exitosa de una proteína muy utilizado comúnmente en la biología de la levadura, este manuscrito presenta transformación con plásmido que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), que permite la posterior detección mediante microscopía de fluorescencia. Igualmente importante para la producción de organismos probióticos que expresan la proteína heteróloga es la adecuada administración y detección de estos microorganismos dentro de los tejidos gastrointestinales, como se describe en partes tres y cuatro. La administración de levadura recombinante a través de una sonda oral permite la entrega de cantidades controladas de levadura directamente en el estómago, de la que C57BL / 6 ratones son naturalmente incapaz de vómitos 18. Sin embargo, el manejo de animales inadecuada y alimentación forzada puede conducir a daño esofágico y perforación, perforación gástrica, administración traqueal, y neumonía por aspiración 19,20. Una técnica deficiente y la falta de experiencia, además, pueden aumentar la variabilidad en la respuesta inmune murina experimental y results, que han sido atribuidos a estrés de los animales sobre una sonda oral 21,22. La práctica en la técnica apropiada de este modo no sólo puede atenuar las molestias animal, pero también puede aumentar la precisión de los resultados experimentales. Este manuscrito describe y demuestra la manipulación de animales y una sonda nasogástrica para la administración de dosis controladas de levadura recombinante. Por último, es vital para confirmar la entrega exitosa de levadura recombinante mediante el análisis de tejidos linfoides para la presencia de la levadura y la proteína heteróloga. Los tejidos inmunes gastrointestinales que pueden más fácilmente y de manera previsible ser examinados para la presencia de la levadura son las placas de Peyer. Placas de Peyer son órganos linfoides secundarios a lo largo del intestino delgado que son sitios clave de la mucosa inducción respuesta inmune 23. Antígenos de los lumen se transfieren transcelular a través de micropliegues células (M) en el epitelio y se liberan en las placas de Peyer, exponiendo así encerrard antígeno de células presentadoras de contenido luminal intestinal. Aunque la absorción de partículas a través del epitelio intestinal también se puede lograr por las células caliciformes, estas células se ha demostrado que sólo ocupan partículas de menos de 0,02 m de diámetro 24. Dendritas transepiteliales extendieron a partir de células dendríticas CD103 + (DC) también ocupan pequeñas partículas desde el lumen intestinal 25; Sin embargo, actualmente no existen informes que demuestran que CD103 + DC ocupan las partículas más grandes que las bacterias. Por lo tanto, la levadura probiótica intacto, de tamaño medio de entre 3 a 6 m de diámetro, son más propensos a ser absorbidos por las células M y se transfirió a las placas de Peyer. Descrito aquí es un protocolo de recogida y selección de las placas de Peyer para levadura recombinante viable, aunque este procedimiento también se puede adaptar fácilmente para la evaluación de la absorción de bacterias probióticas. En resumen, la evaluación de la levadura recombinante probiótico para la entrega de larapeutic proteínas en el intestino requiere el dominio de las técnicas de laboratorio que abarcan la biología molecular para el manejo de animales e inmunología. Aquí se presentan son los protocolos para 1) la generación y selección de cepas de levadura auxotróficos que puede ser fácilmente seleccionado negativamente sin antibióticos, 2) protocolos alternativos para transformar la levadura y permiten la expresión de la proteína heteróloga, 3) demostraciones de técnicas de manejo de animales adecuados y sonda oral durante intragástrico la entrega de la levadura recombinante, y 4) protocolos para la disección de las placas de Peyer y la detección de levadura recombinante viable y funcional proteína heteróloga. Combinados, estos protocolos permitirán la generación y prueba de una cepa de levadura probiótico capaz de entregar proteína terapéutica heterólogo en el tracto gastrointestinal.

<table><tbody><tr><td>Espectrofotómetro SmartSpec 3000</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Ejemplo de espectrofotómetro para determinar la concentración celular y el diámetro exterior 600 de cultivos de levadura</td></tr><tr><td>New Brunswick Tambor de rodillos</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Ejemplo de tambor de rodillos para la incubación de cultivos de levadura</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Ejemplo de stratalinker</td></tr><tr><td>Contador de colonias Stuart SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher</td><td>Scientific Plate soporte con registros de aumento recuento de colonias al detectar la presión de la pluma</td></tr><tr><td>Contador de colonias Scienceware&nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware Bolígrafo de</td><td>mano para contadores de colonias</td></tr><tr><td>Réplica de dispositivo de recubrimiento</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Ejemplo de réplica de soporte y almohadillas de recubrimiento&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuadrados de terciopelo</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>Esparcidores de células estériles en forma de L&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Ácido desoxirribonucleico, monocatenario de testículos de salmón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Ejemplo de ADN portador para levadura Transformación de LiOAc</td></tr><tr><td>Agujas de sonda nasogástrica</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp; 002</td><td>Para ratones de 15 a 20 g, la aguja sugerida es una aguja de sonda nasogástrica reutilizable de calibre 22 (1,25 mm), recta y de 1 pulgada de largo. Para ratones que pesen más de 20 &nbsp; g, se pueden usar agujas de sonda nasogástrica rectas o curvas de calibre 20 o más grandes</td></tr> 1 <tr><td>ml estéril de punta deslizante jeringa de tuberculina desechable</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas romas como Electrónica Microscopy Sciences Punta dentada de 7" (178 mm), pinzas de agarre amplio</td> Ciencias de la <td>Microscopía Electrónica</td><td>77937-28</td><td>Ejemplo de pinzas romas necesarias para la disección&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras de disección rectas y curvas</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>72966-02 y 72966-03</td><td>Ejemplos de tijeras necesarias para la disección</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

El desarrollo de la terapia oral recombinante permitiría dirigirse más directamente al sistema inmunitario de la mucosa y mejorar la capacidad de combatir los trastornos gastrointestinales. La adaptación de la levadura probiótica en particular para este enfoque conlleva varias ventajas. Estas cepas no solo tienen el potencial de sintetizar una amplia variedad de proteínas heterólogas complejas, sino que también son capaces de sobrevivir y proteger esas proteínas durante el tránsito a través del intestino. Sin embargo, este enfoque requiere experiencia en muchas técnicas de laboratorio diversas que no suelen utilizarse en conjunto. Además, aunque los protocolos individuales para la transformación de la levadura están bien caracterizados para las cepas de laboratorio de uso común, aquí se hace hincapié en los enfoques alternativos y en la importancia de optimizar la transformación para las cepas probióticas menos caracterizadas. Detallar estos métodos ayudará a facilitar el debate sobre los mejores enfoques para probar la levadura probiótica como vehículos de administración de fármacos orales y, de hecho, servirá para avanzar en el desarrollo de esta nueva estrategia para la terapia gastrointestinal.

Generación de una curva de supervivencia después de la irradiación UV requiere placas de células de levadura diluidas de tal manera que unidades formadoras de colonias (CFU) distintos son capaces de formar. Cada muestra de 500 l recogida como se ha descrito anteriormente contiene aproximadamente 5 x 10 6 células; Sin embargo, más de 100 colonias por placa son difíciles de distinguir con precisión. Revestimiento de la muestra sin diluir así como de serie diluciones 1:10 de las ...

Se presenta aquí una descripción unificada de las técnicas que se pueden utilizar para desarrollar, transformar, administrar y poner a prueba la expresión de proteínas heterólogas de la levadura probiótica Saccharomyces boulardii.

Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

El objetivo general de estos procedimientos es desarrollar una cepa de levadura probiótica que pueda transformarse fácilmente para expresar y entregar proteínas heterólogas al tracto gastrointestinal de ratón. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten la generación rápida de cepas oxitróficas de levadura probiótica. Estas levaduras mutantes luego pueden manipularse genéticamente sin depender de la selección con antibióticos.La administración oral por gavaje en ratones y la obtención de las placas de Peyer también permiten verificar la adherencia de levaduras mutantes a los tejidos inmunitarios gastrointestinales. Estos métodos ayudarán a responder preguntas clave en el campo de la vacunación oral y facilitarán experimentos para evaluar probióticos en la administración de terapéuticos gastrointestinales. Después de preparar el medio YPD y cultivar las levaduras durante la noche hasta alcanzar la saturación, diluya las células uno a diez en agua en una cubeta de plástico.Luego, conecte un espectrofotómetro y determine la densidad óptica del cultivo nocturno. Diluya las células con 20 mililitros de agua destilada estéril hasta una concentración de 10 a la séptima células

transformation-probiotic-yeast-their-recovery-from-gastrointestinal

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este vídeo muestra un procedimiento de trasplante de microbiota fecal en un ratón con deficiencia de interleucina-10 e inflamación del colon. Los microbios fecales colonizados en el intestino liberan metabolitos secundarios, lo que provoca la liberación de citocinas antiinflamatorias y reduce la inflamación del colon.

Evaluación de los efectos del trasplante de microbiota fecal en un ratón con deficiencia de interleucina-10

Este video muestra la administración oral de células de levadura transformadas en un modelo de ratón. Las células de levadura transformadas se administran por vía oral mediante una técnica de sonda nasogástrica, llegando al estómago del ratón. Más tarde, las células migran al intestino delgado, donde las células de los micropliegues las engullen y facilitan su transferencia a los parches de Peyer y acceden al sistema inmunitario intestinal.

Administración oral de células de levadura transformadas en el sistema inmunitario intestinal del ratón

Aquí ofrecemos protocolos detallados para la administración oral de antibióticos a ratones, colección de muestras fecales, la extracción de ADN y cuantificación de coliformes fecales por qPCR.

Cuantitativa de polimerasa análisis reacción-basado cadena de la Microbiota Intestinal murino después del tratamiento antibiótico Oral

Este estudio detalla el proceso de cantidades precisas de gavaging de probióticos a los ratones neonatales. El montaje experimental se optimizó para incluir pero no se limita a probiótico, la dosis, métodos de administración y cuantificación de bacterias en los intestinos.

Estudios de probióticos en ratones neonatales mediante sonda nasogástrica

Describimos un método novedoso para generar ratones BLT dobles humanizados que cuentan con un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal estable injertado similar al humano. Este protocolo se puede seguir sin necesidad de ratones libres de gérmenes o instalaciones gnotobióticas.

Un modelo de dos colores BLT humanizados con un microbioma intestinal humano estable y un sistema inmune humano

El propósito de este protocolo es visualizar la forma de la célula candida albicans y la localización en el tracto gastrointestinal de los mamíferos.

Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

La interacción de la susceptibilidad genética, la inmunidad de la mucosa y el entorno microecológico intestinal está involucrada en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En este estudio, aplicamos el trasplante de microbiota fecal a ratones deficientes en IL-10 e investigamos su impacto en la inflamación del colon y la función cardíaca.

Evaluación terapéutica del trasplante de microbiota fecal en un modelo de ratón deficiente en interleucina 10

En este artículo, presentamos un protocolo para establecer el modelo de ratón de colitis inducida por sodio, pseudo-germen, sulfato de dextrano libre de antibióticos, para investigar el papel de la microbiota intestinal en la regulación de los efectos positivos del Bacillus cereus sobre la colitis.

Investigación de los efectos paliantes de la administración de Bacillus cereus en la colitis a través de la modulación de la microbiota intestinal

Los bacteriófagos (fagos), virus que infectan a las bacterias, son un componente integral del microbioma intestinal. Aunque estos habitantes simbióticos impulsan la aptitud bacteriana y la dinámica de la población, se sabe poco sobre cómo afectan a la homeostasis intestinal y a la enfermedad. Este protocolo estudia fagos T4 aislados dentro de un modelo de ratón, adaptables a otros pares fago-bacteriano.

Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

Este protocolo describe las mejores prácticas para la transferencia y el alojamiento de ratones libres de gérmenes en aisladores experimentales de una sola jaula (isojaulas) mientras se mantienen las condiciones estériles. Se discuten los métodos para el trasplante fecal en ratones libres de gérmenes y la recolección de bacterias viables de estos ratones "humanizados" intestinales para aplicaciones posteriores.

Preparación y mantenimiento del experimento de jaula IsoPositive de bioexclusión para el trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes

Aprende a transformar Saccharomyces boulardii para expresar proteínas heterólogas en el tracto gastrointestinal murino. Estas técnicas permiten generar cepas auxotróficas sin selección antibiótica y verificar su adherencia a parches de Peyer.

Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones (Video) | JoVE Journal

Transformación de la levadura probiótica y su recuperación de tejidos gastrointestinales inmune después de alimentación forzada oral en ratones

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