Name: La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a visualizar dinámicas de organelos subcelulares en embriones vivos de Danio rerio mediante microscopía de campo amplio y confocal. Esta técnica permite estudiar mitocondrias y centrosomas en contexto fisiológico y modelos de enfermedad.

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P.E. cuenta con el apoyo del Grupo de Formación en Investigación 1373 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) y la Escuela de Graduados de la Technische Universität München (TUM-GS). G.P. contó con el apoyo de TUM-GS. L.T. cuenta con el apoyo de una beca EMBO (EMBO ALTF 108-2013). El trabajo de D.P. sobre el pez cebra fue apoyado por la DFG a través del Sonderforschungsbereich "Mecanismos moleculares de la neurodegeneración" (SFB 596); el Centro para las Ciencias Integradas de las Proteínas (Múnich) y el Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7/2007-2013) en virtud del acuerdo de subvención n.º 200611 (MEMOSAD). Actualmente es becario de la Fundación de Células Madre-Druckenmiller de Nueva York y contó con el apoyo de una beca de la Academia Alemana de Ciencias Leopoldina. L.G. cuenta con el apoyo financiero de la DFG a través de SFB 870 "Ensamblaje y función de circuitos neuronales", Proyecto A11. 
Estamos agradecidos a Kristina Wullimann por mantener nuestras instalaciones de pesca, a Yvonne Hufnagel por su apoyo técnico y a Thomas Misgeld por sus comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos a R. Köster (Technische Universität Braunschweig) por proporcionar el vector M1 Medusa (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) del que clonamos Centrin-YFP y a S.C. Suzuki y T. Yoshimatsu (Universidad de Washington) por proporcionar el casete 14xUAS:MA-cerúleo que utilizamos para generar la construcción reportera para hacer CentrinFish. Además, agradecemos a S.C. Suzuki y T. Yoshimatsu (Universidad de Washington) por la línea transgénica Otx2:Gal4, A. Sagasti por el constructo Sensory:Gal4-VP16 (UCLA) y M. Nonet (Universidad de Washington en St. Louis) por el vector pCold Heart Tol2. Agradecemos a Bettina Schmid, Alexander Hruscha y Christian Haass (Centro Alemán de Enfermedades Neurodegenerativas de Múnich - DZNE) por contribuir al desarrollo de MitoFish.

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se demuestra la versatilidad del sistema de expresión Gal4-UAS a las mitocondrias de la etiqueta fluorescente, centrosomas y las membranas celulares de tipos de células específicas in vivo en embriones de pez cebra. Muchas proteínas de fusión fluorescentes que etiquetan otros orgánulos o estructuras subcelulares se pueden encontrar en la literatura publicada y se pueden obtener en el laboratorio respectivo, de fuentes comerciales o depositarios plásmido no comerciales (por ejemplo, Addgene). Para...

En imágenes in vivo proporciona una visualización directa de los comportamientos celulares en el contexto más fisiológica. La transparencia de los embriones de pez cebra, su rápido desarrollo y externa y una rica variedad de herramientas genéticas que permiten el marcaje fluorescente, han contribuido a la creciente utilización de la microscopía in vivo para dilucidar la dinámica de eventos de desarrollo claves. Los estudios de imágenes del desarrollo del sistema nervioso en el pez cebra tienen, por ejemplo, se expandió enormemente nuestro conocimiento del comportamiento de las células progenitoras neurales y el destino de su progenie, incluyendo su posterior migración, la diferenciación y la integración del circuito 1-8. El escenario está listo para investigar la dinámica subcelulares que subyacen a estos comportamientos celulares. De hecho, el pez cebra ya están siendo explotados como herramientas para la biología de las células en vivo. Ahora es posible visualizar las mitocondrias 9-11, centrosomas 2,8,12-14, 15 de Golgi, Los microtúbulos y la actina 4 16 citoesqueleto, endosomes 17 y los componentes de la membrana apical complejo 1,18, entre otras estructuras subcelulares en embriones de pez cebra en vivo. Hasta ahora, gran parte de lo que se conoce acerca de la función de estos orgánulos proviene de estudiar su comportamiento en células cultivadas. Mientras que los estudios in vitro han dado mucha información sobre los biología celular, las células en cultivo no representan plenamente la complejidad de la situación in vivo y por lo tanto no reflejan necesariamente la función y dinámica de los orgánulos subcelulares in vivo. Embriones de pez cebra ofrecen una alternativa viable en vivo para examinar la dinámica subcelulares. Como los vertebrados, el pez cebra posee muchos sistemas de órganos (por ejemplo, la retina neural) que son homólogas a las que se encuentran en especies de mamíferos. Además, embriones de pez cebra son cada vez más utilizados para modelar enfermedades humanas 19,20 </sarriba&gt;, incluidos los relacionados con la función centrosómicas (por ejemplo, microcefalia 21 y amaurosis 22 congénita de Leber) y para la función mitocondrial (por ejemplo, enfermedad de Parkinson 23, tauopatías 10,24 y el síndrome de Barth 25). imágenes in vivo a nivel celular y subcelular en estos casos permitirá una mejor comprensión de la biología de las células que subyace a estos estados patológicos. El objetivo general de los métodos descritos aquí es proporcionar una guía completa para investigar orgánulos y otras estructuras subcelulares en embriones de pez cebra utilizando microscopía de luz en vivo. Todo el flujo de trabajo involucrado en la visualización y el seguimiento de las estructuras subcelulares en vivo se describe - a partir de enfoques genéticos de etiquetado, para generar transitoriamente expresar y peces transgénicos estable, y finalmente a la formación de imágenes usando de campo amplio y microscopía confocal. Aunque cada uno de estos procedures es utilizada por numerosos laboratorios de pez cebra, los protocolos descritos se han optimizado y simplificado para la investigación de la dinámica de las estructuras subcelulares. Dos aspectos específicos del trabajo aquí descrito garantizan mención: En primer lugar, el uso del sistema de expresión Gal4-UAS en múltiples configuraciones para genéticamente orgánulos de la etiqueta en tipos celulares específicos. En segundo lugar, una comparación directa de campo amplio y microscopía confocal a las estructuras subcelulares de imagen in vivo. Las estrategias actuales para modificar genéticamente los orgánulos de la etiqueta y otras estructuras subcelulares en el pez cebra o bien hacer uso de cubiertas de ARNm 1,4,8 o construcciones de ADN basada en elementos promotores conducen directamente la expresión de proteínas de fusión 9,14,15. Transcrito in vitro de ARN en cubiertas resultados rápida y amplia expresión, que no es específica de tejido sin embargo. Además, los niveles de expresión disminuyen con el tiempo que el ARN tapado se diluye o se degrada. Así, el uso de ARN basadoconstruye para examinar la dinámica de orgánulos en las etapas posteriores de desarrollo es limitado (generalmente hasta 3 días después de la fertilización). Estas limitaciones se pueden superar mediante el uso de construcciones de ADN, donde el control espacial y temporal de la expresión se determina por elementos promotores específicos. Cuando construcciones basadas ADN se utilizan en el contexto del sistema de Gal4-UAS mejoras significativas en los niveles de expresión del transgen se observan 26,27. En este sistema de expresión bipartito, de tipo celular elementos promotores específicos conducir la expresión de un activador transcripcional Gal4, mientras que los genes informadores son clonados aguas abajo de la secuencia de activación aguas arriba Gal4 vinculante (UAS). Mediante la combinación de UAS reporteros con conductores Gal4 apropiadas, la expresión puede limitarse a tipos de células específicos, eludiendo la necesidad de clonar genes informadores detrás de diferentes promotores cada vez que se desea un patrón de expresión específico. Además, la expresión de múltiples genes indicadores UAS puede serimpulsado por un solo activador Gal4. Así, el sistema Gal4-UAS ofrece un enfoque genético versátil y flexible para el etiquetado subcelular. De gran campo y microscopios confocal son los caballos de batalla de la mayoría de los laboratorios. sistemas de campo amplia suelen utilizar una lámpara de arco como fuente de luz y detectar la luz emitida con una cámara sensible que se coloca al final de la trayectoria de la luz. Esta modalidad de imagen está normalmente restringido a muestras delgadas como fuera de foco luz oscurece la información de enfoque en las muestras más gruesas. Microscopios confocales difieren de los sistemas de campo amplio en el que se construyen para favorecer las señales que se originan en el plano focal sobre los que se originan fuera de foco (es decir, &quot;seccionamiento óptico&quot;) 28. Para lograr seccionamiento óptico de un agujero de alfiler se coloca en la trayectoria de emisión en una posición conjugada a la fuente de luz puntual. Los láseres son utilizados como fuentes de luz y las señales se detectan con tubos fotomultiplicadores (PMT). Prácticamente, un láserhaz se desliza sobre la muestra de punto por punto y la emisión de fluorescencia en cada punto (pixel) es detectada por el PMT. Aquí la imagen de las mismas estructuras subcelulares en embriones de pez cebra de estar utilizando tanto de gran campo y la microscopía confocal para proporcionar una comparación directa de ambas modalidades de microscopía. El objetivo subyacente de proporcionar este tipo de comparaciones es ofrecer directrices para la elección de la técnica de microscopía más apropiada para la cuestión específica que nos ocupa. El uso de los enfoques descritos aquí demostramos Gal4-UAS etiquetado con base genética de las mitocondrias y los centrosomas. Estos orgánulos son imágenes en diferentes tipos de células del sistema nervioso y en las células musculares usando de campo amplio y microscopía confocal para demostrar la idoneidad de cada modalidad de imagen. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar fácilmente para la investigación de otros orgánulos y estructuras subcelulares en el embrión de pez cebra vivo.

<table><tbody><tr><td>Agarosa (2-hidroxietilagirasa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>Baja temperatura de gelificación Tipo VII</td></tr><tr><td>Calentador de bloque</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer compacto</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 Nitrato de calcio hidratado, 99,996%&nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>Para preparar 30x Cámara CCD de Danieau</td></tr><tr><td></td><td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Revestimiento cerámico Pinzas Dumont #5</td><td>Dumont - Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td>#5 Pinzas</td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Culture Calentador de platos</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>Anillo calefactor</td></tr><tr><td>Sal de metanosulfato de etilo 3-aminobenzoato</td><td>PharmaQ</td><td>Tricaine PharmaQ-25g</td><td>Tricaine (anestésico)</td></tr><tr><td>Microscopio de disección de fluorescencia</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GeneClean kit</td><td>MP Biomedicals</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo con fondo de vidrio</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C Placa de</td><td>Petri de 35 mm, micropocillo de 14 mm, cubreobjetos n.º 0</td></tr><tr><td>Agujas de vidrio</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Para microinyecciones</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>Para preparar 30x Grasa de alto vacío Danieau's</td></tr><tr><td>Dow</td><td>Corning&nbsp;</td><td>DCC000001242 150 g</td><td>Grasa de dióxido de silicona</td></tr><tr><td>KCl 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>Para preparar 30x Danieau's</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O &nbsp; &nbsp; Sulfato de magnesio heptahidratado 98+% Reactivo A.C.S</td>. <td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>Para preparar 30x Microinyector Danieau</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Puntas de microcargador <td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td></td><td>Micromanipulador Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 ul</td></tr><tr><td></td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de micropipeta</td><td>Intracel</td><td>N/P 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Para transcribir PCS-Transposase</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>Para preparar 30x</td></tr><tr><td>Nanofotómetro de Danieau</td><td></td><td></td><td>Para medir la concentración de ADN/ARN</td></tr><tr><td>Tirador de aguja</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Flaming/Brown</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp;</td><td>Objetivo de cono de inmersión en agua</td> <td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>N-Feniltiourea Grado I, aprox. 98%</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (previene la pigmentación)</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Moldes de plástico&nbsp;</td><td>Herramientas de ciencia adaptativa</td><td>TU-1</td><td>Para microinyecciones</td></tr><tr><td>Cubierta de plexiglás con un agujero</td><td>Hecho</td><td></td><td>a medida El agujero de la cubierta de plexiglás debe ser 3 mm más grande que el diámetro del objetivo del cono de inmersión en agua</td></tr><tr><td>Colador de té (plástico)</td><td></td><td></td><td>Para recoger huevos de pez cebra</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>Temperatura automática dual </td></tr><tr><td>Controlador Pipetas de transferencia</td><td>Sarstedt AG&nbsp;</td><td>86.1171</td><td>Pipetas de transferencia de plástico de 3,5 ml</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1,00 W</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objetivo de cono de inmersión</td></tr><tr><td>en agua UMPlanFLN 20x/0,50 W;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objetivo de cono de inmersión</td></tr><tr><td>en agua Microscopio de campo amplio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (50x Stock)</td><td></td><td></td><td>Disolver 76 mg de PTU en 50 ml de agua destilada Remover vigorosamente a temperatura ambiente&nbsp; Almacenar a -20 oC en 1 ml alícuotas Usar en 1x solución de trabajo</td></tr><tr><td>Tricaína (20x Stock)</td><td></td><td></td><td>Disolver 200 mg de Tricaína en 48 ml de agua destilada Añadir 2 ml 1M Tris base (pH9) Ajustar al pH 7&nbsp; Almacenar a -20 oC en 1 ml alícuotas Usar en 1x solución</td></tr><tr><td>de trabajo Solución de Danieau (30x stock)</td><td></td><td></td><td>1.740 mM&nbsp; NaCl&nbsp; 21 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl&nbsp; 12 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MgSO4.7H2O&nbsp; 18 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp; &nbsp; &nbsp; Búfer HEPES&nbsp; Agua destilada hasta 1 L&nbsp; Tienda a 4 oC&nbsp; Úselo en una solución de trabajo de 0.3x</td></tr></tbody></table>

la formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Las imágenes in vivo proporcionan un acceso sin precedentes al comportamiento dinámico de las estructuras celulares y subcelulares en su contexto natural. La realización de tales experimentos de imagen en vertebrados superiores, como los mamíferos, generalmente requiere acceso quirúrgico al sistema en estudio. La accesibilidad óptica del pez cebra embrionario y larvario permite eludir estos procedimientos invasivos y permite obtener imágenes del organismo intacto. De hecho, el pez cebra es ahora un modelo bien establecido para visualizar comportamientos celulares dinámicos utilizando microscopía in vivo en una amplia gama de contextos de desarrollo, desde la proliferación hasta la migración y la diferenciación. Un desarrollo más reciente es el uso cada vez mayor del pez cebra para estudiar eventos subcelulares, incluido el tráfico mitocondrial y la dinámica del centrosoma. La relativa facilidad con la que estas estructuras subcelulares pueden ser marcadas genéticamente por proteínas fluorescentes y el uso de técnicas de microscopía óptica para obtener imágenes de ellas está transformando al pez cebra en un modelo in vivo de biología celular. Aquí describimos métodos para generar construcciones genéticas que marquen orgánulos de manera fluorescente, destacando las mitocondrias y los centrosomas como ejemplos específicos. Utilizamos el sistema bipartito Gal4-UAS en múltiples configuraciones para restringir la expresión a tipos específicos de células y proporcionar protocolos para generar peces transgénicos estables y que se expresan transitoriamente. Finalmente, proporcionamos pautas para elegir los métodos de microscopía óptica que son más adecuados para obtener imágenes de la dinámica subcelular.

Aquí el uso de campo amplio y microscopía confocal para las mitocondrias de imagen y los centrosomas en embriones de pez cebra que vive está directamente comparado y contrastado. Dependiendo de la localización de las células en las que la dinámica de orgánulos han de ser examinada y la frecuencia propia de los acontecimientos subcelulares específicos, por lo general, ya sea de campo amplio o microscopía confocal es la mejor opción. Nos fotografiado orgánulos en las neuronas RB situados e...

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

El objetivo general de este método de imagen es estudiar orgánulos subcelulares en un vertebrado in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular neuronal, como la dinámica de mitocondrias o de centrosomas en un contexto in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que todo el experimento puede realizarse en un vertebrado intacto, sin necesidad de ningún procedimiento quirúrgico.Este método puede proporcionar información no solo sobre la dinámica subcelular en condiciones fisiológicas, sino que también puede aplicarse a estudios de modelos de tesis, como la enfermedad de Alzheimer. Después de generar embriones con expresión transitoria mediante microinyección u obtener embriones de líneas transgénicas estables, según el protocolo descrito, al final del primer día, seleccione los huevos muertos o no fertilizados. Utilizando una pipeta de transferencia de plástico, transfiera los embriones viables a solución de Danieau que contenga PTU 1x para prevenir la formación de pigmento, y mantenga los embriones en solución de Danieau con PTU 1x hasta la selección para expresión del transgén.El día del experimento de imágenes, utilice un microscopio de disección con fluorescencia para examinar embriones anestesiados en busca de expresión del transgén. A continuación, transfiera los embriones seleccionados a una placa de Petri separada que contenga tampón Danieau con PTU 1x y tricaina 1x. Una vez que los embriones hayan sido anestesiados, pipetee suavemente algunos dentro del agarosa de bajo punto de fusión que contiene PTU 1x y tricaina 1x, transfiriendo la menor cantidad posible de líquido para evitar diluir el agarosa.Transfiera los embriones con una pequeña cantidad de agarosa a una placa de Petri con fondo de vidrio. Luego, trabajando relativamente rápido, use pinzas para posicionar los embriones en la orientación deseada según la estructura que se va a imaginar. Los embriones deben orientarse adecuadamente, por ejemplo, de lado para la adquisición de imágenes de la retina o de una neurona de Rohon-Beard.Una orientación precisa garantizará la mejor calidad de imagen y optimizará la velocidad de adquisición. Después de permitir que el agarosa se solidifique durante al menos 15 minutos, agregue el tampón de Danieau con PTU 1x y tricaina 1x para cubrir los embriones. Para realizar microscopía de campo amplio, después de equilibrar un platillo con peces montados en una cámara de calentamiento a 28,5 grados Celsius sobre la platina de un microscopio de campo amplio y elegir un área de interés, abra el software del microscopio.Bajo Iluminación, haga clic en Configuración para definir los conjuntos de filtros correctos para la longitud de onda de interés. En Configuración de la cámara, introduzca el tiempo de exposición necesario para adquirir una imagen adecuada. Luego, elija un objetivo de inmersión en agua con larga distancia de trabajo, con un aumento que varíe entre 40x y 100x, que tenga la mayor apertura numérica y que esté corregido cromáticamente.Haga clic en Directo para seleccionar el campo de visión. En el caso de una neurona R-B, capture el transporte mitocondrial en el axón principal, que emerge del cuerpo celular o en el arborizado periférico. Luego, en el menú de ImageJ, haga clic en el botón de selección rectangular y defina una región de interés, o ROI.Y haga clic en ROI en la ventana de MicroManager. Después de seleccionar la ROI para la adquisición de imágenes, haga clic en Detener y Guardar para registrar la morfología neuronal en el canal YFP. Para adquirir imágenes del transporte mitocondrial, haga clic en Adquisición Multidimensional.A continuación, en la ventana llamada Adquisición multidimensional, seleccione el número de puntos temporales y el intervalo entre ellos. En la ventana de Adquisición multidimensional, haga clic en Canales, y agregue y defina la longitud de onda para la adquisición de imágenes y el tiempo de exposición. Haga clic en Guardar imágenes para guardar automáticamente los archivos en la carpeta específica indicada en la ruta del directorio.Ahora, haga clic en Adquirir en la esquina superior derecha para iniciar la imagen de lapso de tiempo. Para la microscopía confocal, después de colocar los embriones montados en una cámara de calentamiento a 28,5 grados Celsius sobre la platina del microscopio confocal, abra el software del microscopio y haga clic en Trans Lamp o Epi Lamp. Luego, mediante los oculares del microscopio, utilice respectivamente luz transmitida o fluorescencia para identificar la región de interés.En la ventana de configuración de adquisición, verifique que el objetivo elegido para la imagen coincida con el objetivo que aparece en el menú desplegable de los objetivos disponibles. Luego, en la ventana de control de adquisición de imágenes, haga clic en el botón de lista de colorantes y seleccione los fluoróforos adecuados. Alternativamente, haga clic en el botón de ruta de luz y colorantes para establecer manualmente los parámetros.En la ventana Configuración de adquisición, ajuste el factor de zoom y la relación de aspecto del tamaño de la imagen escaneada para obtener el tamaño de píxel necesario para resolver mejor las estructuras que se están visualizando. Establezca el tamaño de píxel en aproximadamente la mitad de la resolución teórica del objetivo, siguiendo así los criterios de muestreo de Nyquist. Para determinar el tamaño de píxel de una imagen adquirida, en la ventana Control de adquisición de imagen, haga clic en el botón I.A continuación, configure la velocidad de escaneo en la más rápida posible. Luego, en la ventana de Control de Adquisición de Imágenes, haga clic en promediado de líneas Kalman y establezca un factor de dos o tres para reducir el ruido. Para seleccionar un modo de escaneo secuencial para la obtención de imágenes de fluoróforos con espectros superpuestos, haga clic en Secuencial y Línea.A continuación, ajuste la potencia de salida de las líneas láser relevantes. Para escanear continuamente la región seleccionada mientras ajusta la configuración del detector para cada canal, haga clic en XY Repetir o en Enfoque x2 o Enfoque x4. Luego, ajuste el HV, la Ganancia y el Desplazamiento para cada canal con el fin de adquirir imágenes que tengan el mayor rango dinámico de valores de grises.Ahora, presione Control más H para visualizar las imágenes adquiridas mediante una tabla de consulta que identifica los píxeles sub-saturados en azul y los píxeles sobre-saturados en rojo, ambos casos que deben evitarse. Reevalúe la salida de potencia de las líneas láser relevantes y la configuración del detector. Para definir los límites superior e inferior del volumen que se va a imaginar, en Configuración de Adquisición haga clic en el botón Establecer Final en el límite superior y luego enfoque hasta el límite inferior y presione Establecer Inicio.Para comprobar la resolución Z del objetivo, en el Control de Adquisición de Imagen, haga clic en el símbolo I. Luego seleccione un tamaño de paso que sea la mitad de la resolución Z para el objetivo dado. En la subventana TimeScan, introduzca la frecuencia con la que deben adquirirse las pilas Z y el número de veces que deben adquirirse las imágenes, para configurar una serie temporal adecuada para la dinámica de la estructura subcelular que se va a imaginar.Haga clic en los botones Profundidad y Tiempo para confirmar que se adquirirá la serie Z y la serie temporal. Finalmente, haga clic en el botón XY Zt para comenzar a adquirir imágenes de lapse de tiempo. Después de la adquisición de imágenes, en la interfaz del software, haga clic en Serie Finalizada.Y guarde las imágenes en formato OIB para registrar las imágenes y los metadatos asociados. Esta figura muestra orgánulos y neuronas R-B ubicadas en la superficie del embrión utilizando microscopía de campo amplio y confocal. Aquí, se utilizó la imagenología de lapso de tiempo en un microscopio de campo amplio para rastrear el movimiento de una mitocondria individual en el arbor periférico de una neurona R-B.La imagen confocal es significativamente más lenta y puede llevar a una subestimación de la dinámica de eventos subcelulares específicos. Las imágenes de células retinianas adquiridas mediante microscopía de campo amplio presentan bajo contraste, ya que las señales fluorescentes de un gran volumen de tejido enmascaran los detalles en el plano focal. Aquí, la capacidad de seccionamiento óptico de la microscopía confocal mejora notablemente el contraste.Los recuadros muestran detalles de una región de la capa nuclear interna, con marcado de membranas celulares y mitocondrias. Impulsada por el conductor específico Gau-4 de una neurona sensorial, la expresión en mosaico proveniente de las inyecciones de UAS-mito-CFP y UAS MAY-FP permite el seguimiento de células individuales durante días, como se observa en esta neurona sensorial R-B a los dos y tres días posteriores a la fertilización. Además de las mitocondrias, otros orgánulos subcelulares como los centrosomas pueden marcarse mediante fluorescencia.En este ejemplo, dos cassettes UAS en un único constructo contiguo impulsaron la expresión de YFP dirigida al centrosoma y de cerulea dirigida a la membrana en células retinianas. Los recuadros muestran una célula en fase M. Todo este procedimiento requiere varios días, desde el apareamiento, recolección de huevos, inyecciones y, finalmente, la adquisición de imágenes a los tres o cuatro días posteriores a la fertilización.El experimento de imagen real en el microscopio puede tardar desde varios minutos hasta un día completo. Tras seguir este procedimiento, otros orgánulos como los microtúbulos o peroxisomas pueden marcarse e imagenarse para comprender su dinámica in vivo. No olvide que el PTU es carcinógeno y que siempre deben tomarse precauciones, como el uso de guantes, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico del desarrollo de órganos en embriones de pez cebra mediante el uso de un microscopio de fluorescencia de disección capaces de realizar seccionamiento óptico y estrategias simples de reajuste para corregir la deriva focal y plana.

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

La mitosis es crítica para todo organismo vivo y los defectos a menudo conducen al cáncer y trastornos del desarrollo. Utilizando este protocolo de imagen y el pez cebra como sistema modelo, los investigadores pueden visualizar la mitosis en un organismo vertebrado vivo y la multitud de defectos que surgen cuando los procesos mitóticos son defectuosos.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.

Inmunofluorescencia secuencial e inmunohistoquímica en embriones de pez cebra crioseccionados

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Se describe una estrategia de preparación de muestras para obtener imágenes de embriones tempranos de pez cebra dentro de un corion intacto utilizando un microscopio de lámina de luz. Analiza las diferentes orientaciones que adquieren los embriones dentro del corion en las etapas de epibolia y yema del 70% y detalla estrategias de imagen para obtener una resolución a escala celular en todo el embrión utilizando el sistema de lámina de luz.

Imágenes de microscopía de lámina de luz y estrategias de montaje para embriones tempranos de pez cebra

Aprende a visualizar dinámicas de organelos subcelulares en embriones vivos de Danio rerio mediante microscopía de campo amplio y confocal. Esta técnica permite estudiar mitocondrias y centrosomas en contexto fisiológico y modelos de enfermedad.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

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