La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

El objetivo general de este método de imagen es estudiar los orgánulos subcelulares en un vertebrado in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular neuronal, como la dinámica de las mitocondrias o los centrosomas en un contexto in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que todo el experimento se puede realizar en un vertebrado intacto, sin necesidad de ningún procedimiento quirúrgico.

Este método puede proporcionar información no solo sobre la dinámica subcelular en condiciones fisiológicas, sino que también se puede aplicar a estudios de modelos de tesis, como la enfermedad de Alzheimer. Después de generar embriones que se expresan transitoriamente por microinyección, u obtener embriones de líneas transgénicas estables, de acuerdo con el protocolo de texto, al final del primer día, se deben realizar pruebas de detección de óvulos muertos o no fertilizados. Con una pipeta de transferencia de plástico, transfiera los embriones viables a la solución de Danieau que contenga 1x PTU para evitar la formación de pigmento, y mantenga los embriones en la solución de Danieau que contenga 1x PTU hasta la detección de la expresión de transgenes.

El día del experimento de diagnóstico por imágenes, utilice un microscopio de disección de fluorescencia para examinar la expresión de transgenes en los embriones anestesiados. A continuación, transfiera los embriones seleccionados a una placa de Petri separada que contenga el tampón de Danieau con 1x PTU y 1x tricaína. Una vez que los embriones han sido anestesiados, pipetear suavemente algunos en la agarosa de bajo punto de fusión que contiene 1x PTU y 1x tricaína, transfiriendo la menor cantidad de líquido posible para evitar diluir la agarosa.

Transfiera los embriones con una pequeña cantidad de agarosa a una placa de Petri con fondo de vidrio. Luego, trabajando relativamente rápido, use fórceps para colocar los embriones en la orientación deseada dependiendo de la estructura que se va a obtener de la imagen. Los embriones tienen que estar orientados correctamente, por ejemplo, planos hacia un lado para obtener imágenes de la retina o una neurona de Rohon-Beard.

Una orientación precisa garantizará la mejor calidad de imagen y optimizará la velocidad de adquisición. Después de dejar que la agarosa se solidifique durante al menos 15 minutos, agregue el tampón de Danieau con 1x PTU y 1x tricaína para cubrir los embriones. Para llevar a cabo la microscopía de campo amplio, después de equilibrar un plato de peces montados en una cámara de calentamiento a 28,5 grados centígrados, en la platina de un microscopio de campo amplio, y elegir un área de interés, abra el software del microscopio.

En Iluminación, haga clic en Ajustes de configuración para definir los conjuntos de filtros correctos para la longitud de onda de interés. En Configuración de la cámara, introduzca el tiempo de exposición necesario para obtener una imagen adecuada. Luego, elija un objetivo de cono de inmersión de agua a larga distancia de trabajo, con un aumento de 40x a 100x, que tenga la apertura numérica más alta y esté corregido cromáticamente.

Haga clic en En vivo para elegir el campo de visión. En el caso de una neurona R-B, imagen del transporte mitocondrial en el axón del tallo, que emana del cuerpo celular o en el árbol periférico. Luego, en el menú ImageJ, haga clic en el botón de selección rectangular y defina una región de interés o ROI.

Y haga clic en ROI en la ventana del micromanager. Después de seleccionar el ROI para la obtención de imágenes, haga clic en Detener y guardar para registrar la morfología neuronal en el canal YFP. Para obtener una imagen del transporte mitocondrial, haga clic en Adquisición Multi-D.

A continuación, en la ventana denominada Adquisición multidimensional, seleccione el número de puntos de tiempo y el intervalo entre puntos de tiempo. En la ventana Adquisición multidimensional, haga clic en Canales y agregue y defina la longitud de onda para la imagen y el tiempo de exposición. Haga clic en Guardar imágenes para guardar automáticamente los archivos en la carpeta específica descrita en la ruta del directorio.

Ahora, haga clic en Adquirir en la esquina superior derecha para iniciar la creación de imágenes de lapso de tiempo. Para la microscopía confocal, después de colocar los embriones montados en una cámara de calentamiento a 28,5 grados centígrados en la etapa confocal, abra el software del microscopio y haga clic en Trans Lamp o Epi Lamp. A continuación, a través de los oculares del microscopio, utilice la luz transmitida o la luz de fluorescencia, respectivamente, para identificar la región de interés.

En la ventana Configuración de adquisición, verifique que el objetivo elegido para la imagen coincida con el objetivo que aparece en el menú desplegable de los objetivos disponibles. A continuación, en la ventana de control de adquisición de imágenes, haga clic en el botón de lista de colorantes y seleccione los fluoróforos adecuados. Alternativamente, haga clic en el botón Ruta de luz y tintes para configurar manualmente los parámetros.

En la ventana Configuración de adquisición, ajuste el factor de zoom y la relación de aspecto del tamaño de la imagen escaneada para obtener el tamaño de píxel necesario para resolver mejor las estructuras que se están fotografiando. Establezca el tamaño de píxel para que sea aproximadamente la mitad de la resolución teórica del objetivo, siguiendo así los criterios de muestreo de Nyquist. Para determinar el tamaño de píxel de una imagen adquirida, en la ventana de Control de adquisición de imágenes, haga clic en el botón I.

A continuación, configure la velocidad de escaneo al más rápido posible. A continuación, en la ventana de control de adquisición de imágenes, haga clic en el promedio de líneas de Kalman y configúrelo en un factor de dos o tres para reducir el ruido. Para seleccionar un modo de escaneo secuencial para obtener imágenes de fluoróforos con espectros superpuestos, haga clic en Secuencial y Línea.

A continuación, ajuste la potencia de salida de las líneas láser correspondientes. Para escanear continuamente la región seleccionada mientras ajusta la configuración del detector para cada canal, haga clic en XY Repeat o Focus x2 o Focus x4. A continuación, ajuste HV, Ganancia y Desplazamiento de cada canal para obtener imágenes que tengan el rango dinámico más alto de valores de gris.

Ahora, presione Control más H para visualizar las imágenes adquiridas a través de una tabla de búsqueda que identifica los píxeles subsaturados en azul y los píxeles sobresaturados en rojo, los cuales deben evitarse. Vuelva a evaluar la potencia de salida de las líneas láser relevantes y la configuración del detector. Para definir los límites superior e inferior del volumen que se va a visualizar, en Configuración de adquisición, haga clic en el botón Finalizar conjunto en el límite superior y luego enfoque al límite inferior y presione Iniciar configuración.

Para comprobar la resolución Z del objetivo, en el Control de adquisición de imágenes, haga clic en el símbolo I. A continuación, seleccione un tamaño de paso que sea la mitad de la resolución Z para el objetivo dado. En la subventana TimeScan, introduzca la frecuencia a la que se deben adquirir las pilas Z y el número de veces que se deben adquirir las imágenes, para establecer una serie temporal adecuada para la dinámica de la estructura subcelular que se va a obtener de la imagen.

Haga clic en los botones Profundidad y Tiempo para confirmar que se adquirirán la pila Z y la serie temporal. Finalmente, haga clic en el botón XY Zt para comenzar a adquirir imágenes de lapso de tiempo. Después de la adquisición de la imagen, en la interfaz del software, haga clic en Serie Hecho.

Y guarde las imágenes en formato OIB para registrar las imágenes y los metadatos asociados. Esta figura muestra orgánulos y neuronas R-B ubicados en la superficie del embrión utilizando campos amplios y microscopía confocal. Aquí, se utilizaron imágenes de lapso de tiempo en un microscopio de campo amplio para rastrear el movimiento de un mitocondrio individual en el eje periférico de una neurona R-B.

Las imágenes confocales son significativamente más lentas y pueden llevar a una subestimación de la dinámica de eventos subcelulares específicos. Las imágenes de las células de la retina adquiridas por microscopía de campo amplio sufren de un contraste deficiente, ya que las señales fluorescentes de un gran volumen de tejido oscurecen los detalles en el plano focal. En este caso, la capacidad de corte óptico de la microscopía confocal mejora notablemente el contraste.

Los recuadros muestran detalles de una región de la capa nuclear interna, con el marcaje de las membranas celulares y las mitocondrias. Impulsada por el controlador Gau-4 específico de una neurona sensorial, la expresión en mosaico de las inyecciones de UAS-mito-CFP y UAS MAY-FP permite el seguimiento de células individuales durante días, como se ve en esta neurona sensorial R-B a los dos y tres días después de la fertilización. Además de las mitocondrias, otros orgánulos subcelulares, como los centrosomas, pueden marcarse con fluorescencia.

En este ejemplo, dos casetes UAS en una sola construcción contigua impulsaron la expresión de YFP dirigido al centrosoma y cerúleo dirigido a la membrana en las células de la retina. Los recuadros muestran una celda en fase M. Todo este procedimiento requiere varios días desde el apareamiento, la recolección de óvulos, las inyecciones y, finalmente, las imágenes tres o cuatro días después de la fertilización.

El experimento de imagen real en el microscopio puede tomar de varios minutos a un día entero. Siguiendo este procedimiento, otros orgánulos como los microtúbulos o los peroxisomas pueden ser marcados y fotografiados para comprender su dinámica in vivo. No olvide que la PTU es cancerígena y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes al realizar este procedimiento.